Glimpse into an ATP synthase's F0 motor at work
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Diss. ETH No. 17935
Glimpse into an ATP synthase’s
F0 motor at work
A dissertation submitted to the
Federal Institute of Technology Zürich
for the degree of
Doctor of Sciences
presented by
Alexander Wiedenmann
Dipl. hum. biol.
University of Marburg
born March 8th , 1978
from Heidenheim/Brenz, Germany
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Markus Aebi, examiner
Prof. Dr. Peter Dimroth, co-examiner
Zürich 2008Zusammenfassung
Adenosintriphosphat (ATP) ist der universelle Energieträger in der gesamten belebten
Welt. Eine Vielzahl von zellulären Prozessen wie z.B. Vesikeltransport, Elektrolyt Homöo-
stase und DNA Replikation sind von der Verfügbarkeit von ATP abhängig.
Das meiste ATP wird durch einen Enzymkomplex, die sogenannte F1 F0 ATP Syn-
thase, hergestellt. Dieser Komplex besteht aus einem Membran-assoziierten F1 Teil und
einem Membran-integralen F0 Teil. Die ATP Synthase hat nicht nur eine zentrale Rolle
im zellulären Stoffwechsel, sondern besitzt zusätzlich einen faszinierenden und einmali-
gen Mechanismus: Wie bei einem Mühlrad fliessen H+ - oder Na+ - Ionen entlang des
elektrochemischen Gradienten der Zellmembran durch den F0 Teil und erzeugen durch
die dabei frei werdende Energie eine Rotation. Diese Rotation wir über eine zentrale,
asymmetrische Welle vom F0 Teil auf den F1 Teil übertragen, wo die Energie schliesslich
genutzt wird, um ADP und Pi zu ATP zu kondensieren.
Der elektrochemische Gradient, der die ATP Synthase antreibt, wird entweder von den
Atmungskettenkomplexen oder durch die Reaktionszentren der Fotosynthese erzeugt. In
seltenen Fällen wird die ATP Synthese durch einen Na+ -Gradient angetrieben, der von
einer Membran-ständigen Decarboxylase erzeugt wird.
Während der F1 Teil der ATP Synthase im Detail erforscht ist, liegen grosse Teile des
Mechanismus und der Struktur des F0 Teils noch im Dunkeln.
In der vorliegenden Arbeit sollten die Antriebkräfte untersucht werden, die zur Ro-
tation im isolierten F0 Teil bzw. zur ATP Synthese in der F1 F0 ATP Synthase führen.
Darüber hinaus sollten die Antriebskräfte zwischen dem H+ -gekoppelte Enzym von E.
coli untersucht und mit der Na+ -gekoppelte ATP Synthase von P. modestum verglichen
werden.
Um die Antriebskräfte definieren zu können, die zur Rotation im F0 Teil führen, wurde
ein Protokoll entwickelt, das zu einer einheitlichen Orientierung der ATP Synthase in Li-
posomen führt. Dadurch konnte der H+ -Transport in bzw. aus den Liposomen genau
quantifiziert werden. Die Methode basiert auf dem Farbstoff Pyranin, einem wasserlös-
lichen Fluorophor, der seine optischen Eigenschaften mit der H+ -Konzentration ändert.
Mit dieser Methode wurde der Einfluss von ∆pH und ∆ψ auf den F0 Teil der ATP
Synthasen von E. coli und aus Spinat Chloroplasten bestimmt (Kapitel 2).
1Um die Antriebskräfte des F0 Teils mit denen des Gesamtenzyms vergleichen zu kön-
nen, wurden die Bedingungen untersucht, welche die Synthese von ATP mit den Enzymen
von E. coli und P. modestum ermöglichen. Ein Ionen-Konzentrationsgradient von ∼ 30 -
50 mV war in beiden Enzyme für die Synthese von ATP unerlässlich. Erstaunlicher war
jedoch das Ergebnis, dass ∼ 100-fach höhere Ionenkonzentrationen für die Synthese von
ATP benötigt wurden, verglichen mit der Hydrolyse von ATP. Zum ersten Mal wurde
die Ionenkonzentration auf der periplasmatischen Seite als wichtige Voraussetzung für die
ATP Synthese charakterisiert. Auf Grund dieser neuen Erkenntnisse wurde ein erweit-
ertes Modell für die Erzeugung von Rotation im F0 Teil der ATP Synthase entworfen.
Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass ein ∆pNa alleine nicht zum Na+ Transport
führt. Es war daher überraschend, dass ein ∆pNa für die ATP Synthese unerlässlich
war (siehe Kapitel 3). Dieser scheinbare Widerspruch wurde in Kapitel 4 eingehend
untersucht. Es zeigte sich, dass die Rekonstitutionsmethode für die P. modestum ATP
Synthase ebenfalls zu einer einheitlichen Orientierung der ATP Synthase in die Liposomen
führte. Daher wurde in den vorangegangenen Studien ausschliesslich Na+ Transport in
Synthese Richtung beobachtet. Wurden die Triebkräfte in der umgekehrten Orientierung
angelegt, führten sowohl ein ∆pNa als auch ein ∆ψ sowie eine Kombination aus beiden
Triebkräften zum Ausstrom von Na+ , was mit den Beobachtungen bei der ATP Synthese
übereinstimmt. Die Ergebnisse zeigten ausserdem, dass ∆pNa und ∆ψ unterschiedliche
Wirkungen auf den Transport in Hydrolyse oder Synthese Richtung haben.
Im letzten Kapitel (Kapitel 5) wurde eine Übersicht zu den Erkenntnissen über die
a-Untereinheit der letzten 30 Jahre erstellt. Die Erkenntnisse und ihre Bedeutung aus
den verschiedenen Studien wurden diskutiert und neue Aspekte zum Mechanismus der
a-Untereinheit vorgeschlagen.
2Summary
Adenosine triphosphate (ATP) is the universal carrier of free energy in the living world.
A plethora of cellular reactions like vesicle transport, electrolyte homeostasis, and repli-
cation depend on the availability of ATP. The majority of ATP is generated by an enzyme
complex termed F1 F0 ATP synthase.
The bipartite enzyme, which consists of a membrane-embedded F0 part and a water-
soluble F1 part, has not only a central role in cellular metabolism but in addition features
a fascinating catalytic mechanism: Energy stored in the transmembrane electrochemical
gradient is converted into rotation by an H+ or Na+ current through the membrane-
embedded F0 part, reminiscent of a waterwheel. The rotation is transmitted by the
central stalk from the F0 to the water-exposed F1 part, where the rotation is converted
into chemical energy by condensation of ADP and Pi to ATP.
The electrochemical gradient, which fuels the ATP synthase, is created by the res-
piratory chain, photosynthetic reaction centers or in some cases by a membrane-bound
decarboxylase, which catalyzes Na+ -transport.
Compared to the thoroughly investigated F1 part, knowledge about the mechanism of
the F0 part is still scarce. The present thesis aimed to elucidate the driving forces that
are required for torque generation during ATP synthesis in the holoenzyme as well as in
the isolated F0 part. Furthermore, we designed experiments to compare the requirements
for ATP synthesis in the Na+ -dependent and the H+ -dependent ATP synthases from P.
modestum and E .coli, respectively.
To characterize the driving forces causing rotation in the F0 part, a method was devel-
oped which led to unidirectional incorporation of the E .coli ATP synthase in preformed
lipid vesicles. This allowed the accurate quantification of H+ -transport in and out of
F0 -containing proteoliposomes. The technique is based on the hydrophilic fluorophore
pyranine which changes its fluorescent properties in response to the proton concentration
(pH). Using these techniques, we studied the impact of ∆pH and ∆ψ on H+ -transport
through F0 parts of the ATP synthase from spinach chloroplasts and E .coli (chapter 2).
In addition, the requirements for rotation during ATP synthesis in the holoenzyme
were investigated in the H+ - and Na+ -dependent enzymes from E .coli and P. modestum.
3Although small (30 - 50 mV), an ion concentration gradient was indispensable for ATP
synthesis in both enzymes. Much more surprising was the observation that ∼ 100 times
higher Na+ - or H+ -concentrations were required for the synthesis than the hydrolysis
of ATP. For the first time the ion concentration at the periplasmic side is recognized
as critical determinant for ATP synthesis. On the basis of the gathered experimental
evidence an advanced model for torque generation in the F0 part of F-type ATPases
was constructed. In earlier reports, ∆pNa was found to be insufficient to elicit rotation
in the P. modestum F0 part. The studies described in chapter 3, however, assigned an
indispensable role to ∆pNa during ATP synthesis.
This apparent conundrum was investigated in more detail and is described in chapter 4.
We inspected our reconstitution procedure and found predominantly uniformly oriented
enzymes in the proteoliposomes. As a result, only transport in hydrolysis was monitored
in the earlier studies. When we reversed the transport direction, ∆pNa, ∆ψ or a combi-
nation of both led to Na+ -transport, matching the requirements for ATP synthesis. The
data demonstrated that the two types of driving forces (∆pNa and ∆ψ) have a different
impact on the P. modestum F0 part, whether it works in hydrolysis or synthesis mode.
To get a better picture of the a-subunit, an overview of investigations on the a-subunit
during the last 30 years is given in the general discussion (chapter 5). The significance and
usefulness of applied techniques are discussed and novel ideas about functional aspects
of the ATP synthase are proposed.
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