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Nr. 56 – 2022
> >
Werden Sie zum Digital
Experiment Manager (BN 56) JANUAR 2022
Stay Informed Infografiken
SEITE 1
> Centrifuge 5910 Ri: Dokumentation auf Knopfdruck
> Wie wählen Sie Ihre nächste Pipette aus? Infografiken verschaffen Überblick!
Für Ihre Forschungsarbeit ist es essen-
tiell, dass Sie über die in Ihrem Labor
verwendeten Techniken auf dem Lau-
fenden bleiben. Oft sind es gerade die
grundlegenden, häufig angewandten
> Ist bekannt, wodurch das homogene
Zellwachstum in Ihrer Zellkultur be-
einflusst wird?
> Wird der PCR-Mastermix stets auf die
gleiche Weise vorbereitet?
Unsere Infografik-Reihe „Stay Informed“
Einen Vorgeschmack auf unsere Stay
Informed-Inhalte finden Sie auf dieser
und der nächsten Seite. Besuchen Sie
www.eppendorf.com/stay-informed,
um sich umfassend zu informieren. Hier
finden Sie ebenfalls Links auf unter-
stützende Materialien zu industriellen
> Plastik reduzieren, Sicherheit wahren
Techniken, die die meisten Probleme
hilft Ihnen, den Überblick zu behalten oder speziellen Applikationen in der
verursachen.
und sicherzustellen, dass die in Ihrem Lebensmittel- oder Pharmaindustrie
> Weiß jeder Mitarbeitende, wie Labor eingesetzten Verfahren konsis- und der Forensik.
reverses Pipettieren funktioniert? tent durchgeführt werden.* *Nur in englischer Sprache.
Präzises und reproduzierbares Pipettieren von Aerosole im Labor
schwierigen Flüssigkeiten
Aerosole sind kolloidale Systeme aus Tröpfchen und/oder
Pipettieren scheint eigentlich ganz einfach zu sein, aber festen Partikeln, die in der Luft schweben. Aerosole sind
unsere Tipps und Tricks helfen Ihnen, konsistente und fast überall auf der Welt zu finden, und wir atmen sie
reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten – selbst bei ständig ein, daher sollten wir zwischen schädlichen und
schwierigen Flüssigkeiten. harmlosen Aerosolen unterscheiden. Die wichtigsten
Aerosole in der Laborumgebung sind Bioaerosole.
Infografik herunterladen unter: Infografik herunterladen unter:
http://eppendorf.global/m2s http://eppendorf.global/m2u
Application Notes
Xenofreie Entwicklung, Expansion und Differenzierung von humanen iPS-Zellen ·
Oder QR-Code Oder QR-Code
scannen und Tutorial scannen und Tutorial
anschauen anschauen
Fermentation von Pichia pastoris im DASbox® Mini Bioreactor System ∙ etc. Your local distributor: www.eppendorf.com/contact
Eppendorf SE · Barkhausenweg 1 · 22339 Hamburg · Germany · E-Mail: eppendorf@eppendorf.com · www.eppendorf.com
2 EDITORIAL
Impressum
Herausgeber
Eppendorf SE, Barkhausenweg 1,
22339 Hamburg, Deutschland
Telefon: + 49 40 53 801- 0
Fax: + 49 40 53 801- 556
E-Mail: bionews@eppendorf.de
www.eppendorf.com/bionews
Redaktionsteam
Berrit Hoff (Projektleitung),
Dr. Jan-Hendrik Bebermeier,
Dr. Tanja Musiol, Natascha Weiß
Gestaltung
Holger Paulsen Grafik-Design, Hamburg
Druck
MOD Offsetdruck GmbH, Dassow
Bildnachweis
Alle Bilder Eppendorf SE. Ausnahmen:
S. 14, Amber Alhadeff: Happy Hour
Headshot; Application Note 5 – 6: Rick
Wie schön, Cohen
Kontakt
Eppendorf Vertrieb Deutschland GmbH
dass Sie sich die Zeit nehmen für die neue Ausgabe unserer BioNews. Wir hoffen sehr, Peter-Henlein-Str. 2
dass Ihnen unser Themenmix gefällt! 50389 Wesseling-Berzdorf
Tel. 01803 - 255911
Wie stehen Sie eigentlich zur Digitalisierung im Labor? Sind Sie schon eingestiegen (0,09 €/min aus dem Festnetz,
oder noch in der Planung? Für Eppendorf wird das Labor der Zukunft auf jeden Fall Mobilfunk max. 0,42 €/min)
> digital sein, mit unterschiedlichen Automatisierungsgraden und intelligenten Lösungen. E-Mail: vertrieb@eppendorf.de >
Nachdem wir mit der VisioNize® Lab Suite im vergangenen Jahr den Grundstein für das
Vertrieb Schweiz
vernetzte Labor gelegt haben, machen wir Sie mit unserem neuen Service „Experiment
Vaudaux-Eppendorf AG
Management“ jetzt zum „Digital Experiment Manager“. Mehr dazu in unserem Leit-
Im Kirschgarten 30
artikel auf Seite 4 – 5.
4124 Schönenbuch/Basel
Von der Digitalisierung profitiert auch die Dokumentation von Experimenten. Smarte Tel. (061) 4821414
Laborgeräte wie die Centrifuge 5910 Ri speichern z.B. alle wichtigen Parameter Ihres E-Mail: eppendorf@eppendorf.ch
Zentrifugenlaufs für die digitale Dokumentation im eLabJournal®, einem elektronischen
Vertrieb Österreich
Laborbuch (S. 6).
Eppendorf Austria GmbH
Unser neues (na klar, digitales) Format Eppendorf Lab Channel mit virtuellen Webinaren Donau-City-Str. 11-13, 1220 Wien
und Produktdemonstrationen hilft Ihnen dabei, Ihr Wissen rund ums Labor zu erweitern Tel. (01) 8901364 - 0
und mit Experten ins Gespräch zu kommen (S. 12). E-Mail: office@eppendorf.at
Weitere nützliche Impulse für den Laboralltag möchten wir Ihnen mit Tipps zur Aus-
wahl Ihrer nächsten Pipette (S. 7) oder zur Reduzierung von Plastikmüll (S. 11) sowie Hinweise
mit unseren Stay Informed Infografiken (Application Note 1 – 2) mitgeben. Ihre Beiträge sind willkommen. Für unver-
langt eingesandte Manuskripte wird keine
Zu guter Letzt: Vielleicht gönnen Sie sich eine (analoge) Tasse Tee und entspannen ein
Verantwortung übernommen. Die Einfüh-
wenig beim Lösen unseres Preisrätsel? Es gibt wieder tolle Preise zu gewinnen (S. 15).
rung von Produkten kann in verschiedenen
Haben Sie Ideen und Wünsche? Sie erreichen uns per Mail an bionews@eppendorf.de. Märkten zu unterschiedlichen Zeitpunkten
Wir freuen uns auf Ihr Feedback! erfolgen. Wir beraten Sie gern.
Aus Gründen der besseren Lesbarkeit und
Ihr Eppendorf BioNews-Team ohne jede Diskriminierungsabsicht wird
im Text ausschließlich eine Form genutzt,
die alle Geschlechter einbezieht.
Irrtum und technische Änderungen
vorbehalten. Alle Rechte vorbehalten,
einschließlich der Grafiken und Bilder.
Markenhinweise auf Seite 14.
Übrigens: Aus Verantwortung für die Umwelt sponsert Eppendorf bereits zum fünften Mal in Folge die International © Copyright Eppendorf SE, Januar 2022.
Freezer Challenge. Neugierig geworden? Dann schauen Sie nach: www.freezerchallenge.org
Klimaneutral gedruckt in Deutschland.
INHALT 3
6 7 8
IM BLICKPUNKT Werden Sie zum Digital Experiment Manager 4–5
LABORPRAXIS Wie wählen Sie Ihre nächste Pipette aus? 7
Mischer können weitaus mehr als „nur“ Mischen 8
Von Daten zur Steuerung: Prozessanalytik in der Bioprozesstechnik 9
Plastik reduzieren, Sicherheit wahren 11
INNOVATION Centrifuge 5910 Ri: Dokumentation auf Knopfdruck 6
NAHAUFNAHME Schokomuffin mit Zuckerguss? 7
> >
NEWS / TIPPS Tipps & Tricks zum Pipettieren 5
Gute Aussichten für Conical Tubes 25 mL 10
Für alle Fälle: Eppendorf Tubes ®
10
Eppendorf – 100 % mit erneuerbarer Energie 11
Lab Channel: Experts. Knowledge. Live. 12
Katalog 2022: kompakter, digitaler 13
Virtuelle Preisverleihungen an Tanmay Bharat & Amber Alhadeff 14
SERVICE Markenhinweise 14
Preisrätsel: Move It Pipette zu gewinnen
®
15
(BN 56) JANUAR 2022 SEITE 1
Stay Informed Infografiken
EPPENDORF SE
Stay Informed Infografiken 1– 2
BLANDINE VANBELLINGHEN, SILVIA TEJERINA, AURELIE TACHENY, INES HARTMANN
Infografiken verschaffen Überblick!
Für Ihre Forschungsarbeit ist es essen-
tiell, dass Sie über die in Ihrem Labor
verwendeten Techniken auf dem Lau-
> Ist bekannt, wodurch das homogene
Zellwachstum in Ihrer Zellkultur be-
einflusst wird?
> Wird der PCR-Mastermix stets auf die
Einen Vorgeschmack auf unsere Stay
Informed-Inhalte finden Sie auf dieser
und der nächsten Seite. Besuchen Sie
www.eppendorf.com/stay-informed,
Optimierung der Plasmidausbeute 3–4
in Schüttelkulturen
um sich umfassend zu informieren. Hier
fenden bleiben. Oft sind es gerade die gleiche Weise vorbereitet?
finden Sie ebenfalls Links auf unter-
grundlegenden, häufig angewandten
Unsere Infografik-Reihe „Stay Informed“ stützende Materialien zu industriellen
Techniken, die die meisten Probleme
hilft Ihnen, den Überblick zu behalten oder speziellen Applikationen in der
verursachen.
und sicherzustellen, dass die in Ihrem Lebensmittel- oder Pharmaindustrie
> Weiß jeder Mitarbeitende, wie Labor eingesetzten Verfahren konsis- und der Forensik.
reverses Pipettieren funktioniert? tent durchgeführt werden.* *Nur in englischer Sprache.
RICK COHEN
Präzises und reproduzierbares Pipettieren von Aerosole im Labor
schwierigen Flüssigkeiten
Aerosole sind kolloidale Systeme aus Tröpfchen und/oder
Pipettieren scheint eigentlich ganz einfach zu sein, aber festen Partikeln, die in der Luft schweben. Aerosole sind
unsere Tipps und Tricks helfen Ihnen, konsistente und fast überall auf der Welt zu finden, und wir atmen sie
Eine niedrige Sauerstoffkonzentration unterstützt die xenofreie 5–6
reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten – selbst bei ständig ein, daher sollten wir zwischen schädlichen und
schwierigen Flüssigkeiten. harmlosen Aerosolen unterscheiden. Die wichtigsten
Aerosole in der Laborumgebung sind Bioaerosole.
Infografik herunterladen unter: Infografik herunterladen unter:
Entwicklung, Expansion und Differenzierung von humanen iPS-Zellen
http://eppendorf.global/m2s http://eppendorf.global/m2u
NINA SCHRAND, MALTE SCHNEIDER, MA SHA
Oder QR-Code Oder QR-Code
scannen und Tutorial scannen und Tutorial
anschauen anschauen
Fermentation von Pichia pastoris im DASbox® Mini Bioreactor System 7– 8
Your local distributor: www.eppendorf.com/contact
Eppendorf SE · Barkhausenweg 1 · 22339 Hamburg · Germany · E-Mail: eppendorf@eppendorf.com · www.eppendorf.com
bei konstantem RQ
4 IM BLICKPUNKT · WERDEN SIE ZUM DIGITAL EXPERIMENT MANAGER
ANN-CLAIRE FOETSCH, EPPENDORF SE
Werden Sie zum Digital Experiment
Manager
Die Digitalisierung hat Einzug in unser Leben gehalten, und wir haben in den letzten zwei Jahren einen enormen
Schub erlebt. Videokonferenzen sind das „neue Normal“ und die Kommunikation via Microsoft® Teams oder Slack®
gehört zum Alltag. Auch im Labor gewöhnen wir uns zunehmend an elektronische Laborjournale, verwalten
Proben, Chemikalien und Verbrauchsmaterialien digital oder nutzen vernetzte Geräte. Das Labor 4.0 ist auf
dem Vormarsch – und mit ihm das Versprechen von mehr Effizienz, weniger Ressourcenverbrauch und mehr
Nachhaltigkeit. Aber ist das wirklich so einfach?
Labornotizbuch aufbewahrt werden, er- Daten innerhalb und außerhalb des La-
schweren die Reproduzierbarkeit. bors lassen sich gemeinsam nutzen und
austauschen. Die digitalen Tools helfen
Schon heute speichern immer mehr
bei der Rückverfolgung Ihrer Proben und
Wissenschaftler und Wissenschaftlerin-
unterstützen Sie in Kombination mit ei-
> nen ihre experimentellen Daten in einem
nem Bestandsverwaltungssystem bei der
>
elektronischen Labornotizbuch (ELN)
Verwaltung Ihrer Verbrauchsmaterialien,
oder einem Laborinformationsmanage-
Chemikalien und Lösungsmittel.
mentsystem (LIMS), anstatt klassische
Papier-Laborbücher zu verwenden. Die „Unstoppable“: Digitalisierung im Labor
Umstellung auf diese digitalen Formate
Da immer mehr Laborgeräte vernetzbar
hat viele Vorteile mit sich gebracht und
werden, wird sich der Einsatz eines effi-
Physische Kalender zur Reservierung Zeiteinsparungen ermöglicht.
zienten Labordaten- und Inventarmanage-
eines Geräts oder eines Arbeitsplatzes,
Es ist wesentlich einfacher geworden, ments noch ausweiten, vor allem in der
die zentrale Ablage von Daten auf einem
Experimente nachzuvollziehen und poten- heutigen Zeit, in der Labore weltweit
Server oder aber das Pflegen von Geräte-
tielle Fehlerquellen zu identifizieren, wenn mit neuen Anforderungen und Heraus-
listen in Microsoft Excel® sind in vielen
ein Experiment fehlgeschlagen ist. forderungen konfrontiert sind.
Laboren noch gang und gäbe. Dabei gibt
es zahlreiche Ansatzpunkte, um Abläufe
zu optimieren und die Nutzung der vor-
handenen Ressourcen durch digitale An-
wendungen zu verbessern. Aufgaben wie
Geräteüberwachung, Wartungsplanung
oder Geräte- und Versuchsdokumentation
lassen sich durch Softwareapplikationen
mit Visualisierung wesentlich effizienter
lösen.
Die vollständige Rückverfolgbarkeit
der durchgeführten Protokolle und eine
lückenlose Dokumentation der Laborab-
läufe sind für eine effiziente und produk-
tive Laborumgebung von entscheidender
Bedeutung.
Wer im Labor ist nicht ständig mit der
zeitaufwändigen Dokumentation von
L aborverfahren konfrontiert? Handge-
schriebene Protokolle, die lose in einem
WERDEN SIE ZUM DIGITAL EXPERIMENT MANAGER · IM BLICKPUNKT 5
Tipp
Tipps & Tricks
zum Pipettieren
Im neuen eBook „The Science of Pipet-
ting to Perfection“ haben wir all unsere
Erfahrungen und Erkenntnisse der letzten
60 Jahre zusammengetragen. Dieser Leit-
faden unterstützt Sie dabei, im Umgang mit
Flüssigkeiten aller Art gute wissenschaftli-
che Arbeit zu leisten. Erfahren Sie, worauf
es bei der Auswahl einer neuen Pipette
ankommt (s. auch Artikel auf Seite 7 in
diesem Heft) und wie Sie durch korrekte
Handhabung und sorgfältige Wartung
Hierzu zählen neue Normen der sozialen „Experiment Management“ ist seit An-
sicherstellen, dass Ihre Pipette stets mit
Distanzierung, Home-Office-Regelungen fang 2022 am Start und sorgt für eine ver-
optimaler Leistung arbeitet.
und somit eine agilere Belegschaft, ein- besserte Effizienz Ihres Labors, indem es
geschränkter Zugang zu Laborarbeits- die Produktivität und Reproduzierbarkeit Lernen Sie, wie Sie die Reproduzierbarkeit
plätzen und virtuelle Compliance-Audits. von Experimenten vom Entwurf bis zur und Zuverlässigkeit Ihrer Ergebnisse er-
Optimierung fördert. halten und erhöhen können und wie Sie
> Wir bei Eppendorf haben den wachsen-
Ihre Arbeitsabläufe sicher und effizient
>
den Bedarf an digitalen Software-Services VisioNize Lab Suite Experiment
gestalten. Außerdem erhalten Sie Anre-
und dem digitalen, vernetzten Labor er- Management bietet Ihnen u.a.:
gungen zur Schaffung ergonomischer, ge-
kannt. Für uns wird das Labor der Zukunft
>> Einfache Erstellung und Verwaltung sundheitsfördernder Arbeitsbedingungen.
digital sein, mit unterschiedlichen Auto-
von Protokollen und Arbeitsabläufen
matisierungsgraden und intelligenten
mit Drag-and-Drop-Protokollschritten
Lösungen, die es Ihnen ermöglichen, sich
für hohe Reproduzierbarkeit und An-
auf das Wesentliche zu konzentrieren: Ihre
passbarkeit von Protokollen
Forschung.
>> Sicherstellung einer ordnungsgemäßen
Mit der VisioNize® Lab Suite haben wir im
Ausführung durch geführte und vorge-
Frühjahr 2021 den Grundstein für das ver-
schriebene Schrittfolgen und Vernet-
netzte Labor gelegt, um die Produktivität
zung der im Experiment verwendeten
bei allen Routineaufgaben im Labor zu
Laborgeräte, um mit dem Experiment
steigern. Als Lösung für effektives Labor-
in Kontakt zu bleiben
management bietet diese Plattform Ser-
vices in den Bereichen Fernüberwachung, >> Vollständige Rückverfolgbarkeit von Jetzt eBook (in englischer Sprache)
Alarmierung, Geräte- und Aufgabenmana- Durchführenden, Proben, Reagenzien kostenlos herunterladen unter
gement an. und verwendeten Geräten, sowie von http://eppendorf.global/m0E
Fehlern und Protokollabweichungen
Die VisioNize Lab Suite wird kontinuierlich
aktualisiert und ist somit eine nachhaltige Erleben Sie jetzt eine neue Dimension
Investition in das Labor der Zukunft. des digitalen Experiment-Managements!
Neuer Service „Experiment Mehr Informationen unter
Management“ http://eppendorf.global/lZO
Mit der Einführung des neuen Service
„Experiment Management“ gehen wir
einen Schritt weiter und über bereits be-
kannte Tools wie z.B. ELNs hinaus. Wir
bieten Ihnen die Möglichkeit, Ihre Experi-
mente zu digitalisieren – von der Erstellung
des Protokolls bis hin zur automatisierten
Dokumentation Ihrer Experimente.
6 INNOVATION · CENTRIFUGE 5910 Ri: DOKUMENTATION AUF KNOPFDRUCK
NICOLE SEELIGMÜLLER, EPPENDORF SE
Centrifuge 5910 Ri:
Dokumentation auf Knopfdruck
Zur Dokumentation ihrer Experimente greifen viele Forscherinnen und Forscher auf Tabellenkalkulationsprogram-
me oder klassische Notizbücher zurück. Dabei stehen heutzutage moderne elektronische Mittel zur Verfügung:
Laborgeräte, die Lauf- und Benutzerinformationen erfassen, und digitale Laborbücher. Wie das eLabJournal® von
Eppendorf, mit welchem Sie die von Ihrer smarten Centrifuge 5910 Ri erzeugten Daten dokumentieren können.
Effizient und sicher.
Dokumentation: eine Hassliebe Die eLabJournal-Software ist eine vollständig integrierte Lösung
für das Daten-, Proben- und Protokollmanagement. Mit ihr opti-
Die Dokumentation zählt zu den wichtigsten und gleichzeitig
mieren Sie Ihre Arbeitsabläufe, indem Sie z.B. Forschungsdaten
unbeliebtesten Aufgaben im Labor. Die rückverfolgbare Doku-
dokumentieren und durchsuchen, Probensammlungen verfolgen
mentation von Forschungsdaten ist in jedem Labor wichtig, so-
und vieles mehr.
> wohl im akademischen Bereich als auch im regulierten Umfeld >
wie der pharmazeutischen Industrie. Ob Daten, Texte oder Ab- eLabJournal ist webbasiert, so dass Sie Ihre Daten jederzeit, von
bildungen für wissenschaftliche Publikationen oder zur Erfül- jedem Ort und jedem Gerät aus einsehen können. Arbeiten Sie
lung von GxP/GLP-Standards aufbewahrt werden müssen – die in einem regulierten Umfeld? Mit eLabJournal kann Ihr Labor ge-
Herausforderung ist meist nicht die Datenerstellung, sondern mäß Good Laboratory Practice (GLP) arbeiten. Zentrifugenläufe
vielmehr der manuelle Dokumentationsaufwand dahinter. können gemäß FDA 21 CFR part 11 elektronisch unterzeichnet
sowie gegengezeichnet und so vor weiterer Modifizierung ge-
Papiergestützte Dokumentation – heute noch in vielen Laboren
schützt werden.
zu finden – hat den Nachteil, dass Daten zum Teil in verschiede-
nen Laborbüchern (z.B. einem Logbuch an der Zentrifuge oder Mehr Informationen
einem persönlichen Journal) festgehalten werden. Diese lokal
www.eLabJournal.com
dokumentierten Daten sind nicht für jeden Mitarbeiter und
von jedem Ort aus zugänglich und könnten verloren gehen oder
beschädigt werden.
Dokumentation: effizient und sicher
Unsere smarte Centrifuge 5910 Ri zeichnet alle Parameter auf,
die sonst von Hand notiert werden müssten: Benutzer, Zeit,
Temperatur, Geschwindigkeit, ob der Lauf manuell gestoppt
wurde, welches Programm verwendet wurde, usw.
Die Centrifuge 5910 Ri
speichert bis zu 1000 dieser
„Run Records“. Die Mög-
lichkeit, nach Datum, Be-
nutzer oder Programm zu
filtern, macht es sehr ein-
fach, nur die Aufzeichnun-
gen zu exportieren, die Sie
benötigen. Der Datenexport
erfolgt als PDF- oder CSV-
Datei, die anschließend im Erfahren Sie mehr über die Dokumentations-
eLabJournal dokumentiert funktion der Centrifuge 5910 Ri im Video-Tutorial.
werden kann. QR-Code scannen und anschauen!
WIE WÄHLEN SIE IHRE NÄCHSTE PIPETTE AUS? · LABORPRAXIS 7
SIMON PLATE, EPPENDORF SE
Wie wählen Sie Ihre Nahaufnahme
nächste Pipette aus? Schokomuffin mit
Zuckerguss?
Erkennen Sie, worum es sich bei unserer
Nahaufnahme handelt? Ist es etwa ein zu
Die Wahl der richtigen Pipette oder des richtigen Dispensers kann ein
trocken geratener Schokomuffin, filigran
Schlüssel zum Erfolg Ihrer Arbeit sein. Das optimale Tool kann Ihre Effizienz verziert mit Zuckerguß?
steigern, den Umgang mit verschiedenen Flüssigkeitstypen erleichtern
und reproduzierbare Ergebnisse gewährleisten. Bei der riesigen Auswahl
sollte die Entscheidung für ein Liquid-Handling-System mit Bedacht ge-
troffen werden. Unsere fünf Leitfragen helfen dabei!
Schwierige Flüssigkeiten mit einer ande-
ren Viskosität, Flüchtigkeit, Oberflächen-
spannung oder Dichte als Wasser sowie
heiße, kalte oder gefährliche Flüssigkeiten Zur Aufklärung unseres Bilderrätsels kann
lassen sich jedoch besser mit einem Direkt- unser Video „Handling Magnetic Beads
> verdrängersystem wie der Multipette® mit during NGS Library Preparation“ beitragen:
>
Combitips® advanced übertragen. Bei der Die Herstellung einer hochqualitativen
Verwendung einer elektronischen Pipette NGS-Library ist kosten-, zeit- und arbeits-
kann ein digitaler Laborassistent mit vor- intensiv. Besonders das DNA-Cleanup
definierten Einstellungen für verschiede- mittels magnetischer Beads erfordert ein
ne Flüssigkeitstypen (wie der VisioNize® großes Maß an Erfahrung. Werden z.B.
Qual der Wahl: Allein Eppendorf bietet mehr als 100 Pipetten- pipette manager) ebenfalls sehr hilfreich die Beads vor der finalen DNA-Elution zu
Varianten an
sein, um schwierige Flüssigkeiten zu stark getrocknet, werden sie spröde (wie
1. Welcher Volumenbereich? handhaben. ein trockener Schokomuffin), und es wird
schwierig, die DNA von ihnen zu lösen.
Um die Reproduzierbarkeit zu maximie- 4. Durchsatz und 5. Komplexität
ren, wählen Sie eine Pipette, deren maxi- Das Video beschreibt anschaulich die ver-
Die endgültige Entscheidung für ein Li-
males Nennvolumen so nah wie möglich schiedenen Schritte, gibt wertvolle Tipps
quid-Handling-System sollte in Abhängig-
an dem üblicherweise zu übertragenden für das Handling magnetischer Beads und
keit vom Durchsatz und der Komplexität
Volumen liegt. zeigt auf, warum ein Pipettierautomat wie
Ihrer Aufgaben getroffen werden. Je höher
die epMotion® eine echte Arbeitserleichte-
2. Welches Gefäßformat? der Durchsatz und die Komplexität, desto
rung für diesen Prozess ist.
sinnvoller ist es, elektronische Pipetten
Für die Arbeit mit einzelnen Gefäßen sind
oder sogar automatisierte Pipettierroboter QR-Code einscannen
Einkanalpipetten ideal; für Mikrotestplat-
in Betracht zu ziehen. und Video schauen
ten hingegen Mehrkanalpipetten oder
Handdispenser. Für 384-Well-Platten emp- Eine Auswahltabelle für Eppendorf-
fehlen wir 16- oder 24-Kanal-Pipetten, Pipetten und passende Spitzen finden
um problemlos eine ganze Reihe auf ein- Sie zum Download unter
Die wichtigsten Tipps aus dem Video finden
mal zu befüllen. Wenn Sie regelmäßig
http://eppendorf.global/lVd Sie in unserer Infografik!
die Formate wechseln müssen (z.B. von
Reaktionsgefäßen zu Platten), entscheiden Oder scannen Sie QR-Code einscannen und
Sie sich am besten für eine Pipette mit den QR-Code Infografik downloaden
verstellbarem Spitzenabstand.
3. Welcher Flüssigkeitstyp?
Die am häufigsten verwendeten Pipetten Mehr Stay Informed Infografiken unter
sind Luftpolsterpipetten, die sich ideal für http://eppendorf.global/m1q
den Transfer wässriger Lösungen eignen.
8 LABORPRAXIS · MISCHER KÖNNEN WEITAUS MEHR ALS „NUR“ MISCHEN
HANAË KÖNIG, EPPENDORF SE
Mischer können weitaus mehr als
„nur“ Mischen
Wenn es ein Standardgerät in jedem Labor gibt, dann ist es ein Thermomischer. Täglich werden Proben gemischt,
erhitzt oder gekühlt. Mischer ermöglichen jedoch noch weitaus praktischere Anwendungen. Haben Sie schon ein-
mal überlegt, das alte Wasserbad auszutauschen und lieber einen Mischer zum Auftauen von Zelllinien zu nutzen?
Wieso eigentlich nicht? Die Vorteile sind überragend. Oder wussten Sie, dass eine PCR-ähnliche Anwendung bei
gleichbleibender Temperatur mit einem Mischer möglich ist?
Sicheres Auftauen sensibler Zelllinien In 1,8 – 2 mL Kryogefäßen können die tion durchführen. Es bilden sich selbst
tiefgefrorenen Zelllinien wasserfrei und hybridisierende DNA-Schleifen („Loops“),
Für das Auftauen von Zellen ist die Ver-
reproduzierbar in einer leicht zu reinigen- die zu einer Hantelstruktur führen.
wendung eines Wasserbades weit verbrei-
den und zu desinfizierenden Umgebung
tet. Dieses birgt jedoch viele Nachteile, Das Tempo der Amplifikation erhöht sich
aufgetaut werden. Einmal auf die verwen-
> z.B. die aufwendige Reinigung, die Konta-
dete Probenzahl angepasst, läuft das Auf-
und man hat nach ca. 30 Minuten ein Er- >
minationsgefahr und die fehlende Mög- gebnis. Wird ein kolorimetrisches LAMP
tauprogramm stets gleich ab. Es können
lichkeit, den Auftauprozess zu standardi- Kit verwendet, so ändert sich der pH-Wert
parallel 1– 24 Proben mit einem Volumen
sieren. Gefäße sind nach dem Auftauen des Ansatzes bei Einbau der Nukleotide.
von 1 mL aufgetaut werden – entweder
nass, müssen getrocknet und von außen
direkt in oder neben der Sterilbank. Die Probe färbt sich bei Vorhandensein
desinfiziert werden, bevor man sie in die
des gesuchten DNA-Abschnitts von rosa
Sterilbank überführen kann. Häufiges Bekanntes Gerät – neue Möglichkeiten
nach gelb. Eine schnelle Detektion von
Öffnen und Schließen des Wasserbad
Die Forschung bringt stetig neue Metho- bakterieller Besiedlung bei Stechmücken,
deckels sowie die parallele Nutzung, z.B.
den hervor, wie z.B. die Loop-Mediated von COVID oder von Viren bei Rebstöcken
für das Erwärmen von Mediengefäßen und
Isothermale Amplifikation (LAMP). Diese sind einige Anwendungsbeispiele.
anderen Zusätzen, können zu Temperatur-
Methode ersetzt keine PCR, ist jedoch
schwankungen führen und die Verlässlich- Mehr Informationen unter
eine sinnvolle Ergänzung um eine schnelle
keit des Auftauprozesses gefährden. www.eppendorf.com/thermomixer
Kontrolle einzelner Genabschnitte durch-
Sicherer, einfacher und reproduzierbarer zuführen. LAMP arbeitet mit 4 – 6 Primern
ist da der Eppendorf ThermoMixer® C mit sowie 6 – 8 Bindestellen auf der Zielse-
dem Eppendorf SmartBlock cryo thaw quenz und einer speziellen Polymerase,
und einem integrierten Auftauprogramm die bei gleichbleibender Temperatur so-
für Zelllinien [1]. wohl das Annealing als auch die Elonga-
[1] Standardized and Water-free Cell Thawing using the
Eppendorf ThermoMixer ® C with the Eppendorf SmartBlock
cryo thaw. Eppendorf Application Note 437.
QR-Code scannen und Application
Note gratis herunterladen
Eppendorf ThermoMixer C mit SmartBlock cryo thaw Eppendorf ThermoMixer C mit SmartBlocks für fast alle
gängigen Gefäß- und Plattenformate
(BN 56) JANUAR 2022 SEITE 1
Stay Informed Infografiken
Infografiken verschaffen Überblick! >> Ist bekannt, wodurch das homogene Einen Vorgeschmack auf unsere Stay
Zellwachstum in Ihrer Zellkultur be- Informed-Inhalte finden Sie auf dieser
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>
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schwierigen Flüssigkeiten
Aerosole sind kolloidale Systeme aus Tröpfchen und/oder
Pipettieren scheint eigentlich ganz einfach zu sein, aber festen Partikeln, die in der Luft schweben. Aerosole sind
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schwierigen Flüssigkeiten. harmlosen Aerosolen unterscheiden. Die wichtigsten
Aerosole in der Laborumgebung sind Bioaerosole.
Infografik herunterladen unter Infografik herunterladen unter
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SEITE 2 (BN 56) JANUAR 2022
Stay Informed Infografiken
Die grundlegenden Komponenten eines Bioreaktors Stammzell-Expansion in Bioreaktoren
Bioreaktoren sind mehr als nur Gefäße. Wenn Sie die Die Stammzellkultur in Rührkessel-Bioreaktoren erleich-
einzelnen Komponenten verstehen und wissen, welche tert das Scale-up und ermöglicht eine umfassende Über-
Rolle sie spielen, können Sie die Effizienz Ihres Prozesses wachung und Kontrolle von Parametern wie Temperatur,
maximieren. Erfahren Sie mehr über die grundlegenden pH-Wert und gelöstem Sauerstoff. In unserer Infografik
Komponenten eines Bioreaktors, um mehr aus Ihrem geben wir Ihnen Tipps, wie Sie Ihre Stammzellkultur aus
Gefäß herauszuholen. Schalen und Kolben auf Bioreaktoren übertragen können.
Infografik herunterladen unter Infografik herunterladen unter
http://eppendorf.global/m2y http://eppendorf.global/m2B
> >
Reproduzierbare DNA-Amplifikation in der PCR
Heutzutage kann die PCR robust und einfach sein – aber
trotzdem kann es gelegentlich Schwierigkeiten geben.
Mit einigen einfachen Tricks können Sie das Beste aus
Ihrer PCR herausholen.
Infografik herunterladen unter
http://eppendorf.global/m2w
Oder QR-Code
scannen und Tutorial
anschauen
Your local distributor: www.eppendorf.com/contact
Eppendorf SE · Barkhausenweg 1 · 22339 Hamburg · Germany · E-Mail: eppendorf@eppendorf.com · www.eppendorf.com(BN 56) JANUAR 2022 SEITE 3
Optimierung der Plasmidausbeute
in Schüttelkulturen
BLANDINE VANBELLINGHEN, SILVIA TEJERINA, AURELIE TACHENY, EPPENDORF APPLICATION TECHNOLOGIES, S.A., NAMUR, BELGIEN
INES HARTMANN, EPPENDORF SE, HAMBURG
Zusammenfassung Material und Methoden Die abgebildeten Kolben-Designs wur-
den untersucht, um das für eine hohe
Rekombinante Plasmid-DNA wird in E. coli DH5α und JM109 wurden mit
Ausbeute am besten geeignete Design
Bakterienkulturen erzeugt, zumeist in pUC19 Plasmid und pGEM®-3Z trans-
für Kolben größeren Volumens zu er-
E. coli. Die Plasmidausbeute sowie deren formiert. Glycerin-Stammkulturen wur-
mitteln. Das Ultra Yield Design schnitt
Qualität hängen von zahlreichen Fakto- den bei −80 °C gelagert. Lennox-Broth
etwas besser ab als der Standard-Erlen-
ren ab, wie z.B. dem Insert, der Auswahl (LB) Medium und modifiziertes TB-Me-
meyerkolben mit Schikanen (Daten sind
des Bakterienstamms, dem Vektordesign dium wurden angesetzt und frisch mit
in der originalen Application Note 449*
und den Methoden, welche für die Kulti- Ampicillin und Anti-Schaum versetzt.
einzusehen); dieses Design wurde für
vierung sowie für die Aufreinigung ge- Die Flüssigkulturen wurden mit einer
die nachfolgenden Tests eingesetzt.
wählt werden. Wir konzentrieren uns hier identischen Startmenge von 1% (v/v)
auf die Optimierung der E. coli Schüttel- angeimpft und in Triplikaten durchge- Einfluss der Medienzusammensetzung
kultur und untersuchen den Einfluss von führt.
Das Medium versorgt die Kultur mit
Kulturmedium, Gefäßdesign, Füllvolu-
Die Experimente wurden im Eppendorf Nährstoffen, wie Proteinen, Mineralien,
men und Schüttelgeschwindigkeit auf
Innova® S44i mit einem Schütteldurch- Vitaminen und Kohlenhydraten. Abbil-
die Bakterien- und Plasmidausbeute.
messer von 25 mm bei 37 °C in Erlen- dungen 2 und 3 zeigen den Einfluss der
Wir zeigen auf, wie eine größere Produk-
meyerkolben (mit und ohne Schikanen) Medienzusammensetzung auf die Bio-
tionsbandbreite mit Hilfe der geeigneten
sowie Ultra Yield Kolben (Thomson) masse sowie die pDNA-Ausbeute klar
Kombination aus einem Hochkapazitäts-
durchgeführt. Die Bakteriendichte wurde auf. Die gesamte bakterielle Biomasse
Inkubationsschüttler, optimierten Kultur-
bei OD600 nm gemessen, die Biomasse in angereichertem TB-Medium erzielte
bedingungen und speziell konzipierten
wurde aus abgeernteten Kulturproben gegenüber klassischem LB-Medium eine
Kulturflaschen erzielt werden kann.
ermittelt, die pDNA wurde isoliert und 2- bis 4-fach erhöhte Biomasse, je nach
bei OD260 nm gemessen. Füllvolumen und Schüttelgeschwindig-
> keit (Abb. 2).
>
Ergebnisse und Diskussion
Die daraus resultierenden pDNA-Aus-
Einfluss des Kolbendesigns
beuten zeigten ähnliche Ergebnisse, mit
Schüttelflaschen stellen die am häufigs- 4- bis 5-fach erhöhter pDNA-Ausbeute
ten verwendeten Kulturgefäße für die bei Kultivierung in TB-Medium (Abb. 3).
Plasmidherstellung im Labormaßstab Klassisches LB-Medium eignet sich her-
dar. Die Auswahl des adäquaten Kolben- vorragend für routinemäßige molekular-
designs hängt von dem Sauerstoffbedarf biologische Anwendungen; allerdings
des Organismus sowie den individuellen sind die Ausbeuten bei einer OD600 ≤ 7
Innova S44i mit Ultra Yield Kolben Anforderungen der jeweiligen Anwen- gesättigt, nachdem die verwertbaren
dung ab. Heutzutage sind verschiedene Kohlenstoffquellen erschöpft sind. Um
Einleitung
Schüttelflaschen-Designs erhältlich, höhere Ausbeuten mit OD-Werten ≥ 20
Plasmide dienen als Vehikel in der Gen- welche den Sauerstofftransfer in die zu erzielen, ist ein gepuffertes, nährstoff-
technologie, um DNA-Fragmente wie z.B. Kultur erhöhen (Abb. 1). reiches Medium, welches z.B. Glycerin
Gene zu klonieren und zu amplifizieren,
oder um rekombinante Proteine zu ex-
primieren. Plasmid-DNA (pDNA) kann
mit einfachen Mitteln genetisch mani-
puliert und in großen Mengen in E. coli
produziert werden. Eine Vielzahl von
gebrauchsfertigen Produktlösungen
ermöglicht die problemlose nachfolgen-
de Aufreinigung. Abhängig von der An-
wendung kann die Produktion der pDNA
im Labormaßstab (bis zu ein paar mg)
bis hin zum industriellen Maßstab (im
mg- bis g-Bereich) durchgeführt werden.
Hier untersuchen wir den Einfluss der
Kulturbedingungen auf die Generierung
von pDNA in großvolumigen 2,5 L Ultra
Yield® Kolben. Abb. 1 (von links nach rechts): Erlenmeyerkolben traditionell (ohne Schikanen), mit Schikanen, Ultra Yield Kolben
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Optimierung der Plasmidausbeute
in Schüttelkulturen
als zusätzliche Kohlenhydratquelle ent-
Bakterielle Biomasse
hält, besser geeignet.
80
Einfluss der Schüttelgeschwindigkeit LB 250 rpm 20 % Füllvolumen
70
LB 250 rpm 40 % Füllvolumen
Standardmäßige Schüttelgeschwindig- LB 400 rpm 20 % Füllvolumen
60
keiten betragen zwischen 200 und TB 250 rpm 20 % Füllvolumen
Biomasse [g/L]
TB 250 rpm 40 % Füllvolumen
250 rpm. Die positiven Effekte einer 50
TB 400 rpm 20 % Füllvolumen
höheren Schüttelgeschwindigkeit können
40
hier in nährstoffreicher TB-Medienkultur
klar aufgezeigt werden. Die besten Er- 30
gebnisse mit Bezug auf Biomasse und
20
pDNA ergaben Kulturen mit 20 % Füll-
volumen, welche bei 400 rpm inkubiert 10
wurden. Im Vergleich zur Standard-
0
Schüttelgeschwindigkeit von 250 rpm 4 6 8 24
resultierte eine Erhöhung auf 400 rpm Stunden nach der Animpfung [h]
nach 8 Stunden in einer nahezu 2-fach
erhöhten Biomasse (Abb. 2) sowie einer Abb. 2: Bakterielle Biomasse (DH5α mit pUC19 Plasmid) in 2,5 L Ultra Yield Kolben mit verschiedenen Medien, Arbeits
volumina und Schüttelgeschwindigkeiten, inkubiert bei 37 °C
~30 % erhöhten pDNA-Ausbeute (Abb. 3).
Einfluss des Arbeitsvolumens pDNA-Ausbeuten 8 Stunden nach der Animpfung
45,2
50
Ein größeres Kulturvolumen kann eben-
40,4
falls die Plasmidausbeute verbessern. 45
Das höhere Füllvolumen (bei gleichblei- 40
pDNA-Ausbeute [mg/L]
34,8
bender Schüttelgeschwindigkeit von 35
> 250 rpm) erzielte höhere Ausbeuten: eine 30
>
Verdopplung des Kulturvolumens von 20 25
auf 40 % ergab eine ~1,4-fach erhöhte 20
Biomasse (Abb. 2) und eine Erhöhung 15
9,0
der pDNA-Ausbeute um >15 % nach 8 10 7,1
8,1
Stunden (Abb. 3). Dies stellte ein uner- 5
wartetes Ergebnis dar, da ein höheres 0
Füllvolumen im Normallfall zu Einschrän- LB 250 rpm LB 250 rpm LB 400 rpm TB 250 rpm TB 250 rpm TB 400 rpm
20 % Füllvolumen 40 % Füllvolumen 20 % Füllvolumen 20 % Füllvolumen 40 % Füllvolumen 20 % Füllvolumen
kungen der Sauerstoffversorgung führt.
Eine mögliche Erklärung könnte im spe- Abb. 3: pDNA-Ausbeuten (DH5α mit pUC19 Plasmid) in 2,5 L Ultra Yield Kolben mit verschiedenen Medien, Arbeits
volumina und Schüttelgeschwindigkeiten, inkubiert bei 37 °C
zifischen Design der Schikanen sowie im
Fließverhalten innerhalb des speziellen die Plattform an mehreren Punkten, was digkeit kann das Bakterienwachstum
Ultra Yield-Kolbens liegen. bei Inkubation mit hoher Geschwindig- und somit nachfolgende Produktions-
keit und Beladung für maximale Stabilität ausbeuten positiv beeinflussen. Daher
Einfluss des Schüttler-Designs
sorgt. Um die von der Flüssigkeitsmasse sollten die Auswahlkriterien bei Schütt-
Um so viele Kolben wie möglich parallel erzeugte Zentrifugalkraft zu kompensie- lern neben der Kapazität auch einen
zu inkubieren, sind stapelbare Hochkapa- ren, sollte der Antrieb des Schüttlers zu- robusten Antrieb mit Gegengewichts-
zitäts-Inkubationsschüttler das Produkt sätzlich mit einem guten Gegengewicht system miteinschließen, um bei hoher
der Wahl für die Plasmidproduktion mit ausgestattet sein, um Unwuchten zu Gewichtsbelastung und hohen Schüttel-
hoher Ausbeute. Bei Verwendung von verhindern und somit den Schüttler geschwindigkeiten zuverlässig arbeiten
2,5 L Ultra Yield Flaschen erreicht man, langfristig vor Verschleiß zu schützen. zu können.
abhängig vom Füllvolumen, ein Gesamt- *Application Note 449 steht unter www.eppendorf.com/
Fazit appnote449 zur Verfügung.
volumen zwischen 19,5 L (20 % Füllvo-
lumen) und 45 L (40 % Füllvolumen) in Die Optimierung der Bedingungen einer
einem dreifach gestapelten Hochkapa- Bakterienkultur kann zur Steigerung der Die Eppendorf SE behält sich das Recht vor, ihre Produkte
zitätsschüttler, wie z.B. dem Eppendorf pDNA-Ausbeute beitragen. Der Einsatz und Dienstleistungen jederzeit zu ändern. Diese Application
Note kann ohne Vorankündigung geändert werden. Wenn-
Innova S44i. Der Schüttler sollte bei eines nährstoffreichen Mediums anstelle gleich größte Sorgfalt darauf verwendet wurde, die Richtigkeit
und Vollständigkeit dieser Informationen zu gewährleisten,
hoher Gewichtsbelastung und bei hohen von LB-Medium sowie von Kolben mit übernimmt die Eppendorf SE keine Haftung für eventuelle
Fehler oder Schäden, die sich aus der Anwendung oder dem
Schüttelgeschwindigkeiten zuverlässig Schikanen oder speziellem Design, wie Gebrauch dieser Informationen ergeben. Die Heranziehung
von Application Notes allein kann das Lesen und Einhalten
arbeiten. Schüttler mit einem Mehrfach- z.B. Ultra Yield Kolben, zusammen mit der jeweils aktuellen Version der Bedienungsanleitung nicht
ersetzen.
Exzenter-Antriebssystem stabilisieren einer Erhöhung der Schüttelgeschwin-
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Eine niedrige Sauerstoffkonzentration unterstützt die xenofreie
Entwicklung, Expansion und Differenzierung von humanen iPS-Zellen
RICK COHEN, RUTGERS UNIVERSITY, PISCATAWAY, NJ, USA
Zusammenfassung In dieser neuen Studie kombinierten wir Ergebnisse und Diskussion
zahlreiche dieser Verbesserungen, um
Wir konnten in vorangegangenen Ar- Expansion und Charakterisierung von
die erfolgreiche Reprogrammierung von
beiten zeigen, dass die Verwendung iPSC unter hypoxischen Bedingungen
humanen Fibroblasten mit Hilfe niedri-
einer niedrigen Sauerstoffkonzentration
ger O2 -Konzentration im CO2 -Inkubator Am 21. bis 30. Tag nach ihrer Modifikation
die Effizienz einer Reprogrammierung
CellXpert® C170i CO2 aufzuzeigen. Wir entwickelten sich aus den rudimentären
humaner somatischer Zellen zur Pluri-
beobachteten, dass die untersuchten iPSC-Kolonien ausgereiftere Kolonien.
potenz steigert [1].
Wachstumssubstrate der reprogram- Diese wurden mit Hilfe von schonenden
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit mierten Fibroblasten eine stabile Zell nicht-enzymatischen Methoden passa-
ermöglichen eine Weiterentwicklung adhäsion sowie -ausbreitung gewährleis- giert. Reine iPSC-Kolonien wurden von
dieses Kultivierungs-Paradigmas. Wir teten. Dies führte wiederum zu einer Hand selektiert. Auf synthetischen Sub-
konnten beobachten, dass Fibroblasten robusten Produktion karyotypisch nor- straten gewachsene iPSC hingegen
nach der Elektroporation bei 4 % O 2 - maler iPSC-Kolonien mit der Fähigkeit, überwuchsen innerhalb kürzester Zeit
Gehalt auf synthetischen sowie biologi- in einem definierten Medium robust zu die geringe Anzahl von Fibroblasten,
schen Oberflächen wachsen. Weiterhin expandieren sowie zu neuronalen und die durch die nicht-enzymatische Passa-
beobachteten wir eine normale Aus- kardialen Lineages differenziert zu gierung abgelöst worden waren.
breitung von iPS-Zellkolonien mit einem werden.
Nach sieben Passagen wurde die durch
hohen Reinheitsgrad in frühen Passagen.
Material und Methoden episomale Plasmide neu programmierte
Die Zellen wurden erfolgreich in Moto-
Linie auf der synthetischen Beschich-
neuronen sowie Kardiomyozyten-Linea- Die Reagenzien und Verfahren in dieser
tung karyotypisch analysiert und für
ges differenziert, was die Wirksamkeit Application Note* entsprechen den be-
normal befunden. Ähnliche Kulturen
des niedrigen Sauerstoffgehalts wäh- reits beschriebenen Methoden. Wenn
wurden auf 24-Well-Platten ausgesät
rend der Zellkultivierung unterstreicht. angezeigt, wurden Kulturgefäße mit
und in Bezug auf Pluripotenz oder Ex-
> Einleitung
5 µg/mL Vitronectin beschichtet und
pression von Differenzierungsmarkern
>
als Vergleich zu einem synthetischen
analysiert (Abb. 1).
Die Reprogrammierung humaner soma- Substrat eingesetzt. Sobald es zur Ent-
tischer Zellen in das pluripotente Stadi- wicklung von iPSC-Kolonien im Repro- Nach acht Passagen fehlte den Kultu-
um ist das Thema zahlreicher Publikati- grammierungsmedium kam, wurden ren jegliche messbare Expression von
onen seit ihrer Entdeckung im Jahr 2007. diese zur weiteren Expansion in „Animal SSEA1, bei robuster Expression von
Die ersten Studien wurden mit einem Free Low Protein hESC“-Medium über- sowohl SSEA4 als auch Oct4. Ebenso
Set von vier Genen durchgeführt, wel- führt. iPSC-Expansion und die frühen exprimierten diese Zellen gleichzeitig
che in nativen humanen embryonalen Schritte der neuronalen Differenzierung Lin28, Nanog und Tra-1-60.
Stammzellen exprimiert werden: Oct4, wurden in 6-Well-Platten durchgeführt,
Differenzierung von iPSC in neuronale
Sox2, KLF4 und c-Myc (Lin28 und Na- während Zellen, welche mit Hilfe von
bzw. Herzmuskel-Zellen
nog). Diese Gene wurden mit Hilfe ge- Immunanfärbung analysiert oder end-
netisch modifizierender Methoden, wie gültig zu Motoneuronen oder Kardiomyo- Die iPSC wurden zunächst zu Neuro-
z. B. retrovirale Vektoren, in die Zellen zyten differenziert wurden, in 24-Well- epithelzellen differenziert und daraufhin
eingeführt, gefolgt von Kultivierung auf Kulturplatten ausgesät wurden. Die in neuronale Stammzellen. Nach vier
undefinierten Wachstumssubstraten. In Entwicklung von Neuronen wurde wie Passagen in neuronalem Stammzell
den 13 Jahren, die seit diesen zukunfts- zuvor beschrieben durchgeführt. medium schienen sich die Zellen in eine
weisenden Studien vergangen sind,
wurden zahlreiche Verbesserungen er- DAPI SSEA1 SSEA4 Oct4
zielt, wie z.B. (1) der Ersatz genetisch
modifizierender Methoden durch siche-
rere, das Genom nicht verändernde Al-
ternativen; (2) Substitution des c-Myc
Oncogens durch das nicht transformie-
rende Familienmitglied L-Myc; (3) der
DAPI Lin28 Nanog Tra-1-60
Einsatz niedermolekularer Verbindungen
zur Effizienzsteigerung der Reprogram-
mierung; (4) Optimierung der Zellkultur-
bedingungen, einschließlich niedriger
O 2 -Konzentration (4 – 5 %) und (5) der
Einsatz klinisch relevanter, definierter
Medien und Wachstumssubstrate. Abb. 1: Immunfluoreszenz-Anfärbung der Pluripotenz- bzw. Differenzierungs-Marker in iPSC niedriger Passagen
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Eine niedrige Sauerstoffkonzentration unterstützt die xenofreie
Entwicklung, Expansion und Differenzierung von humanen iPS-Zellen
einheitliche Schicht zu differenzieren, nisierten die Zellen ein feines, robustes Fazit
mit einem sich wiederholenden, für neu- Neurofilament H-positives Netzwerk,
Wir zeigten eine erfolgreiche Repro-
ronale Stammzellen charakteristischen mit einem geringen Rest eines TUJ1+
grammierung von humanen Fibroblasten
Rosettenmuster. Viele dieser Zellen wa- Erscheinungsbildes und wenigen GFAP+
in hypoxischer Umgebung im CellXpert
ren OTX2-positiv, wobei eine größere Gliazellen. Insgesamt zeigten diese Er-
C170i CO2 -Inkubator. Die iPSC-Linie
Anzahl von Zellen sowohl Pax6 als auch gebnisse, dass hypoxische Kultivierung
wurde als karyotypisch normal charak-
Nestin exprimierte. Da dies den zweiten eingesetzt werden kann, um Zellen der
terisiert und exprimierte die erwarteten
von vier Schritten zu abgeleiteten Moto- neuro-ektodermalen Abstammungslinie
Marker für Pluripotenz. Weiterhin unter-
neuronen darstellte, fuhren wir fort, die zu erzeugen.
stützte die niedrige O2 -Umgebung die
Stammzellen in Vorläufer von Motoneu-
Zusätzlich waren wir in der Lage, die zuverlässige Differenzierung der iPSC
ronen zu differenzieren.
Zellen zunächst in endgültiges Endoderm in verschiedene Stadien von Ektoderm,
Die niedermolekularen Verbindungen zu differenzieren, gefolgt von der Ent- neuronalen Stammzellen, Vorläufern
und Wachstumsfaktoren wurden ver- wicklung zu Kardiomyozyten (Abb. 3). von Motoneuronen sowie letztendlich
ändert, um mit dem Differenzierungs- Nach 10 – 11 Tagen in Kultur organisier- Motoneuronen. Ebenfalls unterstützt
protokoll fortzufahren (Abb. 2, obere ten sich die überlebenden Zellen in die hypoxische Atmosphäre innerhalb
Bildreihe); einige Zellen exprimierten kleine Kolonien. Diese „Knotenpunkte“ des Inkubators die Differenzierung der-
weiterhin OTX2 und Nestin, während waren hochgradig dreidimensional und selben iPSC-Linie in Kardiomyozyten.
viele Zellen begannen, Olig2 zu expri- exprimierten Troponin T, Nkx2.5 und
*Download der vollständigen
mieren – einen motoneuronalen Marker. SMA.
Application Note 443 unter
Nach einer Woche wurden die Zellen Wir beobachteten eine zusätzliche http://eppendorf.global/lR2
einer Reihe von Zytokinen und nieder- robuste Expression von Troponin T, oder über QR Code:
molekularen Verbindungen ausgesetzt, gemeinsam mit GATA4 und MHCv.
um die endgültige Differenzierung zu Gemeinsam kennzeichnen diese Ergeb-
Motoneuronen zu induzieren (Abb. 2, nisse eine erfolgreiche Entwicklung
> untere Bildreihe). Nach sieben Tagen im der Kardiomyozyten-Abstammungslinie
>
abschließenden Medium-Cocktail orga- in einer hypoxischen Umgebung.
DAPI OTX2 Nestin Olig2
Literatur
[1] Low Oxygen Levels Enhance the Efficiency
of Reprogramming Human Somatic Cells to
Pluripotency. Eppendorf Application Note 338.
Download unter http://eppendorf.global/lUV
DAPI Neurofilament H GFAP TUJ1
Abb. 2: Differenzierung von iPSC in Motoneuronen-Vorläuferzellen in einer Umgebung mit niedrigem Sauerstoffgehalt
DAPI Troponin T Nkx2.5 SMA
DAPI Troponin T GATA4 MHCv
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und Dienstleistungen jederzeit zu ändern. Diese Application
Note kann ohne Vorankündigung geändert werden. Wenn-
gleich größte Sorgfalt darauf verwendet wurde, die Richtigkeit
und Vollständigkeit dieser Informationen zu gewährleisten,
übernimmt die Eppendorf SE keine Haftung für eventuelle
Fehler oder Schäden, die sich aus der Anwendung oder dem
Gebrauch dieser Informationen ergeben. Die Heranziehung
von Application Notes allein kann das Lesen und Einhalten
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ersetzen.
Abb. 3: Differenzierung von iPSC zu Kardiomyozyten in einer niedrigen O 2 -Umgebung
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Fermentation von Pichia pastoris
im DASbox Mini Bioreactor System bei konstantem RQ
®
NINA SCHRAND, MALTE SCHNEIDER, EPPENDORF SE BIOPROCESS CENTER, JÜLICH
MA SHA, BIOPROCESS APPLICATIONS LAB, EPPENDORF, INC., ENFIELD, CT, USA
KONTAKT: BIOPROCESS-EXPERTS@EPPENDORF.COM
Einleitung nen, welcher anzeigt, welches Substrat Hilfe einer automatischen Script-Pro-
von der Kultur konsumiert wird, und ein grammierung auszulösen. Die Details
Die Hefe Pichia pastoris wird vor allem
konstanter RQ-Prozess kann eingesetzt sind in der Eppendorf Application Note
zur heterologen Proteinproduktion in der
werden, um die Fermentation auf der 439 beschrieben [3].
Biotechnologie eingesetzt. Die Fütte-
Grundlage einer spezifischen Kohlen-
rungsstrategie ist einer der wichtigsten Automatische RQ-Steuerung durch
stoffquelle zu optimieren.
Faktoren bei der Optimierung der Pro- programmierte Fütterung
duktionsausbeute. Eine der führenden Material und Methoden
Wie bereits erwähnt, kann der RQ-Wert
Strategien in der auf die Proteinproduk-
In dieser Studie setzten wir den Pichia als Indikator dafür dienen, welches
tion ausgerichteten Fütterung beruht auf
pastoris Stamm DSMZ 70382 ein. Wir ver- Substrat von der Kultur verbraucht wird.
dem respiratorischen Quotienten (RQ).
wendeten das DASbox Mini Bioreactor Wir führten ein Software-Script ein, wel-
Eine konstante RQ-basierte Fütterung
System für mikrobielle Anwendungen ches automatisch nach der Animpfung
stellt sicher, dass der respiratorische
(Eppendorf) in Verbindung mit einem startet [3]. Nach einer Verzögerungszeit
Stoffwechsel von Glucose/Glycerin zum
DASGIP ® GA4 Abgasanalyse-Modul von 12 h wird der RQ-Wert von 1 ver-
Zwecke der Proteinproduktion optimiert
(Eppendorf) und DASware® control wendet, um die Fütterungspumpe zu
und die Bildung von Nebenprodukten
software (Eppendorf). Der Ansatz von starten, und nachfolgende Fütterungen
begrenzt wird [1].
Medien, der Aufbau des Bioprozess-Sys- werden automatisch auf Basis des RQ-
Ziel dieser Studie ist es, die Durchführ- tems, die Vorbereitung des Inokulums Wertes gesteuert.
barkeit einer konstanten RQ-basierten sowie die Messung der optischen Dichte
Ergebnisse
Fütterung für die Hefe-Fermentierung sind in der Eppendorf Application Note
zum Zwecke der Proteinproduktion mit 439 beschrieben [3]. Die Prozess-Para- Wir führten die P. pastoris Fed-Batch
Hilfe des DASbox Mini Bioreactor Sys- meter sind in Tabelle 1 aufgelistet. Fermentation zweimal durch. In einem
> tems aufzuzeigen. Weiterhin verglichen Ansatz starteten wir die Fütterung auto-
>
Durch DO-Spike ausgelöster
wir diese Ergebnisse mit einer standard- matisch durch ein von einem DO-Spike
Fütterungsprozess
mäßigen, durch erhöhte DO-Werte („DO- ausgelöstes Script. Im zweiten Ansatz
Spike“) ausgelösten Fütterung unter Ver- Das Ende der Batch-Phase einer Fed- setzten wir eine konstante RQ-gesteu-
wendung des gleichen Versuchsaufbaus. Batch Kultur wird häufig durch einen erte Fütterungsstrategie ein. Die auf
Anstieg des DO-Wertes angezeigt (DO- DO-Spike beruhende Fütterung wurde
Der respiratorische Quotient (RQ)
Spike). Zu diesem Zeitpunkt ist die Koh- begonnen, sobald der Wert des Gelöst-
RQ ist der Quotient aus dem von einer lenstoffquelle innerhalb des ursprüng sauerstoffs von 30 % auf über 38 %
Kultur erzeugten Kohlendioxid und dem lichen Kulturmediums aufgebraucht, anstieg, was nach 39 h Inokulationszeit
verbrauchten Sauerstoff, ausgedrückt und die Stoffwechselaktivität der Kultur, der Fall war [3]. Die RQ-gesteuerte
durch die Kohlendioxid-Transferrate und somit der Sauerstoffbedarf, sinken Fütterung wurde nach einer Verzöge-
(CTR) und die Sauerstoff-Aufnahmerate rapide ab, was zu einem steilen Anstieg rungszeit von 12 h gestartet. Der RQ
(OUR). Bei einer konstanten Konzentra- von DO im Medium führt. Wir nutzten wird auf einen Wert von 1 reguliert,
tion an gelöstem Sauerstoff gleicht die diesen DO-Spike aus, um einen automa- indem die Fütterungspumpe ein- und
OUR der Sauerstoff-Transferrate (OTR) tischen Start der Fütterungspumpe mit ausgeschaltet wird.
[2]. Der RQ für die Verstoffwechselung
von Glucose ist 1. Parameter Konfiguration
Dies kann durch die Tatsache erklärt Gefäß DASbox Mini Bioreactor, autoklavierbar, Mikrobiologie
werden, dass pro Mol Glucose 6 Mol O2
Animpfdichte OD600 = 1
benötigt und 6 Mol CO 2 produziert
werden. Die O 2 -Aufnahme entspricht Gelöstsauerstoff (DO) 30 %, beibehalten durch DO-Kaskade
somit der CO2 -Übertragung, so dass der Agitation Überkopfantrieb, maximal 1.600 Upm, durch DO-Kaskade gesteuert
Quotient 1 beträgt. Sobald die Glucose
Begasung Gasfluss und -mischung automatisch, durch DO-Kaskade gesteuert
vollständig verstoffwechselt ist, beginnt
die Kultur damit, Nebenprodukte der Temperatur 30 °C, Beheizung und Kühlung durch Peltier-Elemente
Fermentation zu konsumieren – haupt- 5,0, einseitige Steuerung mit 10 % (v/v) steriler Ammonium Hydroxyd
pH
sächlich Ethanol. Da Ethanol stärker Lösung
reduziert ist als Glucose, resultiert der Sparger L-Sparger
Verbrauch von Ethanol als Substrat in
Fütterung Automatisch durch Reaktor-Script ausgelöst
einem RQ-Wert unter 1. Daher kann
der RQ-Wert als Inline-Parameter die- Tabelle 1: Prozessparameter, welche während der Fermentation eingesetzt wurden
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