ABLAUFPLAN PHARMAKOLOGISCH-TOXIKOLOGISCHER DEMONSTRATIONSKURS KUS-NR.: PH4-10032 FÜR PHARMAZIESTUDENTEN 8. FS, SOSE 2019 MONTAG 3.6.2019 ...
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Institut für Pharmakologie und Toxikologie
Drackendorfer Str. 1 07747 Jena
03641 9 325651 Fax: 03641 9325652
E-Mail: birgit.lange@med.uni-jena.de
16.05.2019
ABLAUFPLAN
Pharmakologisch-Toxikologischer
Demonstrationskurs
Kus-Nr.: Ph4-10032
für Pharmaziestudenten
8. FS, SoSe 2019
Montag 3.6.2019 – Mittwoch 3.7.2019
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Institut für Pharmakologie und Toxikologie
Drackendorfer Str. 1 07747 Jena
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16.05.2019
VORLESUNGEN I 13:00-17:00 Uhr
Datum Dozent Thema Raum/HS
Neurologische Erkrankungen in der Forschung: Vom HS IV
Mo 3.6.2019 Dr. S. Keiner
Tiermodell zum Menschen Am Klinikum
HS II
4.6.2019 PD Dr. Jahn Dentalpharmaka
Di Am Klinikum
HS III
Mi 5.6.2019 Prof. Dr. Koscielny Medikamentöse Therapie von HNO-Erkrankungen Am Klinikum
HS III
Do 6.6.2019 Prof. Dr. Hartmann Antibiotic Stewardship Am Klinikum
Antibiotikaresistenzen - Von Grundlagen bis zu HS IV
Fr 7.6.2019 Dr. Makarewicz
neuen Therapieansätzen Am Klinikum
PRAKTIKA 13:00-17:00 Uhr
Thema 1 Thema 2 Thema 3 Thema 4 Thema 5 Thema 6 Thema 7 Thema 8
Herr Dr. Herr Herr PD Dr. Herr Prof. Frau Prof. Frau Dr. GGIZ SocraTec Erfurt
BITTE Reinscheid Dr. Huonker Peters Dr. Bauer Neuhaus Schütz Erfurt, R&D GmbH;
9 325656 9 325774 9 397170 9 395636 9 325670 9 325681 HELIOS Mainzer-
KITTEL Pharmakologie Am Klinikum Inst. f. Mol. Pharmakologie Pharmakologie Klinikum, hofplatz 14*,
mitbringen! Toxikologie
1.OG, Trakt C,
1 Rechts-
medizin
Zellbiologie
Hans-Knöll-
Toxikologie
1.OG, Trakt C,
Toxikologie,
1.OG, Trakt B,
Haus 3a, 99084 Erfurt;
Herr Dr.
Nordhäuser
C23 Gebäude F2, Str.2 C22 B22 F. Donath, Tel.:
Straße 74*,
Drackendorfer SR 10/HSIII Drackendorfer Drackendorfer 0361 6020555
99089 Erfurt;
Straße 1 Am Straße 1 Straße 1 Frau Dr. Prasa,
Klinikum 1 Tel.:
03617307310
Datum Gruppen
Mo 10.6.2019 Pfingstmontag
Di 11.6.2019 1 2 3 4 5 6
Mi 12.6.2019 Gruppe 1-4 Gruppe 5-8
Do 13.6.2019 Gruppe 5-8 Gruppe 1-4
Fr 14.6.2019 2 3 4 5 6 7
Mo 17.6.2019 3 4 5 (HS III) 6 7 8
Di 18.6.2019 4 5 6 (HS III) 7 8 1
Mi 19.6.2019 5 6 7 8 1 2
Do 20.6.2019 6 7 8 1 2 3
Fr 21.6.2019 7 8 1 2 3 4
Mo 24.6.2019 8 1 2 3 4 5
VORLESUNGEN II 13.00-17.00 Uhr
Datum Dozent Thema Raum/HS
HS Psychiatrie
Di 25.6.2019 Prof. Dr. Smesny Klinische Anwendungsgebiete von Psychopharmaka
Oval office
Mi 26.6.2019 Prof. Dr. Schulz Phosphorylierung G-Protein gekoppelter Rezeptoren
Am Klinikum
HS IV
Do 27. 6.2019 Prof. Dr. Schneider Pharmakotherapie in der Schwangerschaft
Am Klinikum
HS IV
Fr 28.6.2019 Prof. Dr. Schwab Therapie von Schlafstörungen und Epilepsie
Am Klinikum
HS IV
Mo 1.7.2019 Prof. Pfister Aktuelle Impfungen
Am Klinikum
HS IV
Am Klinikum
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Themen:
Thema 1 „Analyse von Gi-Signalen mittels Membranpotentialassay“
Dr. R. Reinscheid, (mailto: rainer.reinscheid@med.uni-jena.de); Pooja Dasgupta 9 325656
Inst. für Pharmakologie/Toxikologie, Drackendorfer Str. 1, 1. OG, C23
Thema 2 „Demonstration des Elektroenzephalogramms bei verschiedenen Aktivitätszuständen des
Gehirn“ 9 325774
Herr Dr. R. Huonker (mailto: ralph.huonker@med.uni-jena.de)
Biomagnetisches Zentrum, Klinik für Neurologie, Am Klinikum 1
Thema 3 „Klinische und Forensische Toxikologie, Grundlagen und Fallbeispiele“
Herr PD Dr. F. Peters (mailto: frank.peters@med.uni-jena.de) 9 397170
Inst. f. Rechtsmedizin, Am Klinikum 1, Gebäude F2, SR 10,
Thema 4 „Auswirkungen von akuter Hypoxie auf Kreislaufregulation und Säure-Basen-Haushalt“
Herr Prof. Dr. R. Bauer (mailto: reinhard.bauer@med.uni-jena.de) 9 395636
Institut für Molekulare Zellbiologie, CMB, Hans-Knöll-Str. 2
Thema 5 „Pharmakogenetik von Cyp-Enzymen“
Prof. Dr. E. Neuhaus (eva.neuhaus@med.uni-jena.de); Sneha Bhat, Julia Karius 9 325670
Inst. für Pharmakologie/Toxikologie, Drackendorfer Str. 1, 1. OG, C22
Thema 6 „Dosis/Wirkungs-Beziehungen von M-Rezeptor-Agonisten und -Antagonisten: Messung von
Calciumantworten mittels FLIPR“ 9 325681
Frau Dr. D. Schütz (mailto:dagmar.schuetz@med.uni-jena.de); Praveen Kumar
Inst. für Pharmakologie/Toxikologie, Drackendorfer Str. 1, 1. OG, B23
Thema 7 - Aufgaben und Arbeitsweise des Giftinformationszentrums
- Vergiftungsgeschehen; Allgemeine Maßnahmen der Vergiftungsbehandlung 0361/
- Akute Vergiftungen durch Arzneimittel, Haushaltschemikalien und Pflanzen 7307310
Frau Dr. D. Prasa (mailto: apotheker@ggiz-erfurt.de); Giftinformationszentrum (GGIZ) Erfurt,
HELIOS Klinikum, Haus 3a, Nordhäuser Str. 74, 99089 Erfurt (*s. Wegbeschreibung)
Thema 8 - Gesetzgebung mit Schwerpunkt auf dem Arzneimittelgesetz, Deklaration von Helsinki 0361/
- Geltende Richtlinien, insbesondere GxP (GCP, GLP, GMP) 6020555
- Entwicklungsplan für potenzielle Arzneimittel (Phase I-IV)
- Biometrische Planung klinischer Studien
- Praktische Beispiele der Phase I der klinischen Entwicklung mit pharmakokinetischen
Überlegungen und dem Schwerpunkt der Bioäquivalenz von Arzneimitteln
Herr Dr. F. Donath, ( (frank.donath@socratec-pharma.de); SocraTec R&D GmbH;
Mainzerhofplatz 14, 99084 Erfurt (s. Wegbeschreibung)
Wegbeschreibungen
*Giftinformationszentrum (GGIZ), Nordhäuser Str. 74, Haus 3a, 99089 Erfurt
Bei Anreise mit der DB:
- Fahren Sie vom Hauptbahnhof mit der Straßenbahnlinie 3 (Richtung Europaplatz) oder Linie 6 (Richtung Rieth) bis zur
Haltestelle Universität. Gegenüber der Uni ist der Haupteingang zum HELIOS Klinikum. Nach der Schranke linkerhand
um den Parkplatz in die Sackstraße, dann stehen Sie vor dem Giftinformationszentrum .
*SocraTec R&D GmbH, Mainzerhofplatz 14, 99084 Erfurt
Bei Anreise mit der DB:
- Auf dem Vorplatz des Erfurter Hauptbahnhofes nach links wenden, dort befinden sich die Straßenbahnhaltestellen.
- weiter mit der Linie 4 in Richtung Bindersleben/Flughafen bis zur Station Theater (Fahrzeit 8 min). Die Station befindet
sich in der dritten Etage des Gebäudes gegenüber vom Theater mit direktem Zugang vom Theaterplatz aus (Eingang
Gelb).
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Thema 1: „Analyse von Gαi-Signalen mittels Membranpotential-Assay am Beispiel des
Nociceptin/Orphanin FQ-Rezeptors (NOP-Rezeptor)“
Dr. Rainer Reinscheid, Pooja Dasgupta, Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Drackendorfer Straße 1, UKJ
1.1 Einführung
Die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) stellen die größte Gruppe der zellmembranständigen Rezeptoren dar, die
wahrscheinlich 2% des menschlichen Genoms repräsentieren. Die Liganden für die GPCRs, sowohl Agonisten als auch
Antagonisten, machen etwa 30% aller pharmazeutischen Wirkstoffe aus, die heutzutage klinisch angewendet werden.
Nach Aktivierung leiten GPCRs ihre Signale über heterotrimere G-Proteine ins Zellinnere weiter. Die aktivierten βγ-
Untereinheiten dissoziieren von dem heterotrimeren G-Protein-Komplex (Gαβγ) und interagieren mit G-Protein-
gekoppelten, einwärts gleichgerichteten Kaliumkanälen (GIRK). GIRK1, GIRK2 und GIRK3 werden im ZNS exprimiert und
GIRK4 wird primär im Herz exprimiert. Durch die Kanalöffnung werden diese permeabel für Kaliumionen, was zur
Hyperpolarisation der Zellen führt. Zur Erhaltung der zellulären Homöostase ist jedoch die regulierte Abschaltung
(Desensitisierung) dieses Signals notwendig. An der Desensitisierung sind sowohl die dritte intrazelluläre Schleife als auch
der C-Terminus des Rezeptors wichtig. Nach Aktivierung des Rezeptors werden Serin – und Threoninreste in diesen
Rezeptoranteilen durch G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinasen (GRKs) phosphoryliert, β-Arrestin bindet am
phosphorylierten Rezeptor, und der Rezeptor wird über Clathrin-beschichtete Vesikel internalisiert. Im sauren Milieu der
frühen Endosomen wird der Ligand vom Rezeptor abgespalten. Anschließend wird der Rezeptor dephosphoryliert und
entweder zur Plasmamembran zurücktransportiert (Resensitisierung) oder proteolytisch abgebaut (Downregulierung).
Opioid-Rezeptoren sind Gαi-gekoppelte Rezeptoren und die pharmakologischen Zielstrukturen verschiedener Opioide und
Opiate. Opioide zählen zu den stärksten wirksamen Analgetika und sind bis heute für die Schmerztherapie unverzichtbar.
Viele derzeit verfügbaren Opioid-Analgetika wie Morphin, Oxycodon und Fentanyl entfalten ihre Wirkung über die
Interaktion mit dem µ-Opioid Rezeptor (MOP-Rezeptor). Der Einsatz dieser Analgetika in der klinischen Praxis ist jedoch
aufgrund zahlreicher unerwünschter Wirkungen wie Obstipation, Toleranz und Abhängigkeit limitiert. Da analgetische
Wirkungen prinzipiell über alle 4 Mitglieder (µ-, κ-, δ-Opioid Rezeptor, Nociceptin/Orphanin FQ Rezeptor) der Opioid-
Rezeptor-Familie vermittelt werden können, wird derzeit eine neue Generation von Opioid-Analgetika entwickelt, die mit
hoher Affinität an mehrere Mitglieder der Opioid-Rezeptor-Familie binden können. Mit der Entwicklung dieser neuen
Multi-Opioid-Rezeptor-Analgetika ist die Hoffnung verbunden, zusätzliche schmerzlindernde Wirkungen zu erzielen und
gleichzeitig das Auftreten typischer Nebenwirkungen von MOP-Rezeptor-Analgetika zu senken. Zwei Prototypen dieser
neuen Substanzen sind Cebranopadol und AT-121, welche sowohl den MOP-Rezeptor als auch den NOP-Rezeptor binden
und aktivieren. Diese Substanzen wurden entwickelt, da gezeigt werden konnte, dass die gemeinsame Applikation von
Ro64-6198 (NOP-Rezeptor-Agonist) und Morphin (MOP-Rezeptor-Agonist) in subanalgetischen Dosen zu einer
gesteigerten antinociceptiven Wirkung führt, bei einer gleichzeitigen Reduktion der unerwünschten Wirkungen. Klinische
Studien zeigen, dass das neuartige Profil von Cebranopadol besonders gut für die Behandlung von mittelstarken bis
schweren chronischen Schmerzen, einschließlich neuropathischer Schmerzen, geeignet ist.
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1.2 Aufgabe
Im Versuch soll anhand des humanen Nociceptin/Orphanin FQ Rezeptors (NOP Rezeptor) gezeigt werden, welche
Prozesse nach einer Aktivierung des Rezeptors mit dem endogenen Liganden Nociceptin (N/OFQ) und dem Opioid
Buprenorphin erfolgen. Dabei wird die GIRK-Aktivierung mittels eines Membranpotential-Assays an stabil mit dem
humanen NOP Rezeptor transfizierten AtT20-Zellen untersucht.
1.3 Durchführung
Hintergrund Membranpotential-Assay: Bei dem Membranpotential-Assay wird die Änderung des Membranpotentials
mittels eines Fluoreszenzfarbstoffes gemessen. Hierfür werden die Zellen mit einem Farbstoff inkubiert, welcher aus 2
Komponenten besteht. Der Indikatorfarbstoff ist der Fluoreszenzfarbstoff, welcher erst fluoresziert, wenn er intrazellulär
vorliegt. Um das Hintergrundsignal des Indikatorfarbstoffes zu minimieren, enthält der Farbstoff als zweite Komponente
einen maskierenden Farbstoff (Quencher), welcher das Fluoreszenzsignal des Indikatorfarbstoffes ausschließlich
außerhalb der Zelle (extrazellulär) stoppt. Anschließend werden die Zellen mit verschiedenen Agonist-Konzentrationen
stimuliert, was durch die GIRK-Aktivierung zu einer Hyperpolarisation der Zellen und damit zu einer Abnahme des
Fluoreszenzsignals führt. Diese konzentrationsabhängige Änderung des Membranpotentials wird an der FlexStation 3
gemessen.
1.3.1 Nachweis der GIRK-Kanal-Aktivierung im Membranpotential-Assay
a) a) 50.000 Zellen in mit Poly-L-Lysin (0,2µg/ml in dest. H2O) beschichteten 96well Zellkulturplatten aussäen,
Inkubation für 2 Tage bei 37 °C und 5% CO2
b) Assay-Vorbereitung (Pufferlösung): HBSS/HEPES (HBSS ohne Ca, ohne Mg; HEPES 20 mM) bei 37 °C vortemperieren
c) Abnahme des Zellkulturmediums
d) Zellen 1x waschen mit Pufferlösung
e) Zugabe der Pufferlösung (90µL)
f) Zugabe der Farbstofflösung (90 µL)
g) Inkubation der mit Farbstoff beladenen Zellen im Inkubator für 45 min
h) Vorbereitung der Vehikelplatte (V-bottom): Zugabe der Agonisten (N/OFQ, Buprenorphin)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1µM 0.05µM 1nM
1µM 0.05µM 1nM
0.5µM 0.01µM 0.1nM
0.5µM 0.01µM 0.1nM
0.1µM 5nM 10pM
0.1µM 5nM 10pM
V1 V2 1pM
V1 V2 1pM
i) Messung der Änderung des Fluoreszenzsignals/Membranpotentialänderung an der Flex Station (Multi-Mode-Mikroplatten-Reader)
j) Auswertung: Wiedergabe der Daten mit der FlexStation 3 Software, Export der Daten als txt-File und Auswertung mit Excel und
Origin
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Thema 2:
Demonstration des Elektroenzephalogramms bei verschiedenen Aktivitätszuständen des Gehirns
Herr Dr. R. Huonker, Biomagnetisches Zentrum, Klinik für Neurologie, Erlanger Allee 101
Im Praktikum werden folgende Verfahren demonstriert bzw. durchgeführt
• Ableitung des EEG von der Schädeloberfläche eines Probanden bei verschiedenen Aktivitätszuständen sowie
Demonstration von biologischen und technischen Artefakten im EEG,
• Ableitung von akustisch evozierten Potentialen (AEP) nach Stimulation mit reinen und verstimmten Akkorden -
Fehlerquotenbestimmung bei verschiedenen Aktivitätszuständen,
• Auswertung des EEG mit Frequenzanalyse.
Grundlagen der Elektroenzephalographie
Die Aktivierung von Nervenzellen im Kortex führt zu Potentialschwankungen an den Zellen (Zellmembranen) und
infolgedessen zu Strömen, die sich im Kopf ausbreiten. Diese wiederum führen auf der Kopfoberfläche zu messbaren
veränderlichen elektrischen Potentialunterschieden. Dieses Signal (EEG-Signal) als Ausdruck kortikaler Hirntätigkeit kann
beim Menschen direkt von der Kopfoberfläche abgeleitet werden. Die relativ einfache Registriermöglichkeit des EEG am
Menschen führte nach ihrer Entdeckung durch Hans Berger (1929 in Jena) zur schnellen Verbreitung dieser Methode und
brachte im klinischen Bereich eine Vielzahl diagnostischer Anwendungen und medizinischer Erkenntnisse, so zur
Charakterisierung verschiedener Schlaf- und Narkosestadien und für die Diagnostik pathologischer zerebraler
Veränderungen, wie z.B. raumfordernder Prozesse im Zentralnervensystem.
Das Elektroenzephalogramm bezeichnet die Aufzeichnung einer zeitabhängigen bioelektrischen Potentialdifferenz. Bei
der Elektroenzephalographie werden die durch Membranpotentialschwankungen verursachten kortikalen Feldpotentiale
extrazellulär registriert. Die Aktivitäten tieferer Hirnstrukturen gehen direkt in das EEG ein, aber auch, indem sie die
neuronale Funktion des Kortex beeinflussen. So werden z.B. die Generatoren des synchronisierten Alpha-EEG in
rhythmisch entladenden Schrittmacherzellen sowie in periodisch hemmenden neuronalen Verschaltungen des Thalamus
vermutet.
Den von der Kopfhaut (EEG) abgeleiteten Potentialdifferenzen liegen hauptsächlich summierte postsynaptische
Potentiale (EPSP und IPSP) zugrunde. Generatoren dieser Potentiale sind die senkrecht zur Hirnoberfläche ausgerichteten
Pyramidenzellen des Kortex, die durch Synapsen vielfach untereinander verschaltet sind und sich so in ihrer Aktivität
gegenseitig beeinflussen. Die Entstehung der abgeleiteten Potentiale lässt sich mit Hilfe der Dipoltheorie
veranschaulichen: Das aufgezeichnete EEG besitzt einen unregelmäßigen, wellenförmigen Charakter mit Amplituden
zwischen 10 und 100 µV und hängt in seinem Verlauf stark vom Ableitort ab. Zur Beschreibung des EEG bedient man sich
der Auswertung von Amplituden, Wellenformen und ihren Frequenzen. Man unterscheidet die folgenden klassischen
Frequenzbereiche:
Delta-Wellen zwischen FU = 0,5 Hz FO = 3 Hz
Theta-Wellen zwischen FU = 4 Hz FO = 7 Hz
Delta-Wellen und Theta-Rhythmus treten im Wach-EEG des Kindes, beim Erwachsenen während des Schlafes und bei
gespannter Aufmerksamkeit auf.
Alpha-Wellen zwischen FU = 8 Hz FO = 13 Hz
Der Alpha-Rhythmus ist besonders im relaxierten Wachzustand, bei geschlossenen Augen und über der okzipitalen Region
ausgeprägt. Das EEG zeigt einen regelmäßigen, synchronisierten Verlauf mit einer (im adulten EEG) vorherrschenden
Frequenz bei ca. 10 Wellen/s.
Beta-Wellen zwischen FU = 14 Hz FO = 30 Hz
Das Beta-EEG ist typisch für einen Zustand erhöhter Aktivität (z.B. Augen geöffnet, Sinnesreize, geistige Tätigkeit,
Orientierungsreaktionen). Es ist desynchronisiert und besteht aus einer unregelmäßigen Überlagerung zahlreicher Wellen
mit Frequenzen zwischen 13 und 30 Hz.
Hochfrequente Gamma-Wellen >30 Hz können im aufmerksamen Wachzustand, bei Wahrnehmungs- und Lernprozessen
sowie im Traumschlaf auftreten.
Methode der Elektroenzephalographie
Bei der Elektroenzephalographie werden mittels spezieller auf die Kopfoberfläche aufgebrachter Elektroden elektrische
Potentialdifferenzen zwischen zwei Orten gemessen (abgeleitet). Je nach Verwendung einer oder mehrerer
Bezugselektroden unterscheidet man bei der Ableitung von Biopotential-Differenzen zwischen unipolarer und bipolarer
Ableitung: Unipolare Ableitungen sind Ableitungen zwischen (mehreren) differenten EEG-Elektroden über dem Kortex
und einer gemeinsamen indifferenten Referenz-Elektrode. Diese Bezugselektrode erfasst -genau wie die EEG-Elektroden-
auch unerwünschte Artefakte, d.h. andere Biopotentiale des Körpers (wie EKG, EMG, EOG) und technische Störsignale
(z.B. das 50 Hz-Wechselstrom-“Brummen“), möglichst nicht jedoch das EEG als eigentliches Nutzsignal. Das wird oft z.B.
durch das Setzen der Referenzelektrode am Ohr erreicht. Dort wird das EEG-Signal vernachlässigbar klein. Die
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elektronische Subtraktion im EEG-Differenzverstärker eliminiert dann weitgehend diese biologischen und technischen
Störsignale und verbessert somit den Signal-Rausch-Abstand (SNR) des EEG.
An der Grenzfläche zwischen Elektrode und Kopfhaut treten ohmsche und kapazitive Übergangswiderstände
(Elektrodenimpedanz) auf. Diese können durch folgendes Ersatzschaltbild beschrieben werden:
Elektrodenersatzschaltbild mit:
Rs - Ohmscher Widerstand der Elektrodenpaste und Elektrode,
C - Kapazität der elektrischen Doppelschicht der Elektroden,
RF - Faraday-Widerstand der chemischen Prozesse, die bei Stromfluss vor sich gehen.
Um einen guten Übergang der bioelektrischen Potentiale und eine geringe Einkopplung von Störungen zu erreichen,
müssen die Elektrodenimpedanzen sehr klein (< 5 kOhm) sein. Deshalb muss die Kopfhaut vor dem Aufbringen der
Elektroden an der Positionen gut gereinigt werden. Dadurch wird der elektrische Übergangswiderstand zwischen
Kopfhaut und Elektrode so weit wie möglich verringert.
Zum Vergleich: Während beim EKG ÜbergangswiderständeInstitut für Pharmakologie und Toxikologie
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EEG-Auswertung - Frequenzanalyse des Elektroenzephalogramms (FOURIER-Spektralanalyse)
Grundlagen der EEG-Spektralanalyse
Im EEG des Menschen überlagern sich Wellen verschiedener Frequenzen, die mit mathematischen Verfahren analysiert
werden können. Allgemein durchgesetzt hat sich für derartige periodische Biopotentialverläufe eine Zerlegung in
Sinuswellen und Cosinuswellen verschiedener Frequenzen – die Fourier-Analyse.
Zunächst wird ein EEG-Abschnitt der Dauer T (einige sec) digitalisiert. Dabei wird das analoge, kontinuierliche
Biopotential EEG(t) in diskreten Zeitabständen ti von z.B. 5 msec in eine Folge digitaler Zahlenwerte EEG (ti) umgewandelt,
was einer Digitalisierungs- oder Abtastfrequenz von 200 Hz entspricht.
Die so entstandene EEG-Zeitreihe wird durch Lösung des Gleichungssystems:
[ ]
N /2
EEG(ti ) = ∑ a j * cos(ω j ti ) + b j *sin(ω j ti ) (1)
j =1
mit
2π (2)
ωj = j
T
in eine Folge von cos- und sin-Wellen einer Grundfrequenz ω1 = 2π / T und höherer, ganzzahliger Vielfacher der
Grundfrequenz ωj (höhere Harmonische oder Oberwellen) zerlegt.
Ergebnis dieses Analyseverfahrens ist das so genannte Leistungsspektrum:
LSD ( f j ) =
4π
(
N 2 2
a j + bj ) in [ µV 2 ] (3)
Leistungsspektren des α- und des β-EEG
Es werden Zeitabschnitte des abgeleiteten Spontan-EEG bei geschlossenen Augen und bei geöffneten Augen einer
Spektralanalyse unterzogen – jeweils bei den verschiedenen Aktivitätszuständen. Dabei werden Leistungsspektren
berechnet und dargestellt, es wird den Studenten demonstriert, wie die Parameter gewählt werden müssen, damit
Ergebnisse deutlich sichtbar werden. Das unterschiedliche Aussehen der Leistungsspektren wird interpretiert und mit
dem EEG verglichen. Es ist auf artefaktfreie EEG-Abschnitte (keine Lidschläge, Bulbusbewegungen oder EMG-
Einstreuungen) zu achten.
Aus den Leistungsspektren des α-EEG und des β-EEG sind die Frequenzen Fmax der maximalen spektralen Leistung sowie
die Maximalwerte LSDmax der spektralen Leistungsdichte zu bestimmen:
Akustisch Evozierte Potentiale (AEP)
Akustisch Evozierte Potentiale (AEP) als diagnostisches Hilfsmittel zur Überprüfung der Funktion neuronaler
Verschaltungen: Prinzip des AEP-Averaging und Aussage des AEP/ frühe und späte Komponenten bei verschiedenen
Aktivitätszuständen des Probanden.
Fehlerquoten beim Erkennen von verstimmten Akkorden
Es werden randomisiert reine und verstimmte Akkorde mit einer Lautstärke von 65 dB SPL im freien Schallfeld appliziert
(n=50/1:4) und der Proband muss eine Maustaste drücken, wenn ein verstimmter Akkord zu hören ist - jeweils ohne und
mit Kaffee. Die als richtig erkannten verstimmten Akkorde werden gezählt und mit den dargebotenen ins Verhältnis
gesetzt. Die Fehlerquote mit und ohne Kaffee wird verglichen. Die Auswertung aller gemessenen Daten erfolgt mit Hilfe
des Programms BrainVision Analyszer von der Firma Brain Products München.
Substanzinfos Koffein
Alkaloid in Kaffeebohnen, Tee- und Mateblättern, Kolanüssen und Guaranasamen.
Erscheinungsformen: in Cola-Getränken, Kaffee, Energydrinks; als Koffeintabletten oder als reines (synthetisches) Koffein
in Pulverform. Konsumformen: getrunken, geschluckt oder geschnupft
Wirkung
Koffein macht wach, beschleunigt den Herzschlag und steigert vorübergehend die geistige Leistungsfähigkeit. In höheren
Dosen (ca. 300 bis 600 mg = ca. 8 Tassen Kaffee) erzeugt es Euphorie.
Wirkungseintritt: nach 10–60 Min., Wirkdauer: 2–3 Std.
Risiken und Nebenwirkungen
Koffein entzieht dem Körper Flüssigkeit (Dehydration). Bei sehr hohen Dosen: Schweißausbrüche, Herzflattern,
Harndrang, Herzrhythmusstörungen, starke Wahrnehmungsstörungen, Zittern, Nervosität und Schlafstörungen.
Langzeitrisiken: Bei dauerhaftem, regelmäßigem Koffeinkonsum (auch bei Kaffee!) besteht die Gefahr körperlicher
Abhängigkeit. Mögliche Entzugssymptome: Kopfschmerzen, Nervosität, Müdigkeit, Erbrechen bis hin zu Bewegungs- und
Konzentrationsstörungen. Der Säuregehalt des Kaffees fördert zudem langfristig die Bildung von Magengeschwüren. Der
Dauerkonsum von Koffein mit Schmerzmitteln kann zu schweren Nierenschäden mit lebensbedrohenden Komplikationen
führen.
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Literatur:
• Beschreibung des Programms BrainVision Analyzer
• Physiologie der Menschen von Schmidt/Thews
• Sonderdrucke zum EEG und Aktivitätszuständen sowie zu Besonderheiten der auditiven zentralen Verarbeitung von
musikalischen Stimuli.
_______________________________________________________________________________________________
Bitte beantworten Sie die folgenden Fragen mit einigen kurzen Sätzen schriftlich in Ihr Protokoll:
1. Welche Veränderungen sind im EEG beim Öffnen bzw. Schließen der Augen zu erkennen?
2. Was ist kennzeichnend für den Berger-Effekt?
3. Welche Veränderungen sind im EEG bei mentaler Anspannung zu erwarten?
4. Welche Veränderungen sind im EEG bei Weck- und Orientierungsreaktionen zu erwarten?
5. Vergleichen Sie die Größe dieses Artefaktes in den einzelnen Ableitungen: Wie sehen die Störsignale im EEG aus?
6. Wie stark sind EMG-Artefakte der Körpermuskulatur im EEG?
7. Vergleichen Sie den Verlauf der EEG-Spektren im α-Spektralband und im β-Band
8. miteinander!
9. Vergleichen Sie die Leistungsspektren und Fehlerquoten beim EEG und AEP bei den verschiedenen
Aktivitätszuständen mit und ohne Kaffee! Was können Sie daraus schließen?
10. Warum können die Wellen eines Beta-EEG nur schwierig und ungenau ausgezählt werden?
11. Was sind evozierte Potentiale?
12. Wie werden sie ausgelöst und beim Menschen registriert?
13. Was sagen die einzelnen Zeitbereiche nach dem Stimulus aus?
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16.05.2019
Thema 3:
Klinische und Forensische Toxikologie, Grundlagen und Fallbeispiele
PD Dr. Frank T. Peters, Dr. Julia Dinger, Frau Lisa Oßowski, Frau Franziska Fiedler
Institut für Rechtsmedizin, Universitätsklinikum Jena, Am Klinikum 1, Bereich F2
Einführung
Unter Vergiftung versteht man die schädliche Einwirkung toxischer Substanzen (Gifte) auf den Organismus sowie die
daraus resultierende Symptomatik. Die weitaus meisten der dokumentierten Vergiftungsverdachtsfälle werden durch
Arzneimittel verursacht, vor allem solche mit mittelschwerem bis tödlichem Verlauf. Andere Gifte, die relativ häufig zu
schweren bis tödlichen Vergiftungen führten, waren chemische Produkte, Pestizide, Drogen oder Pflanzen. Viele
Vergiftungen, vor allem bei Kindern, sind akzidenteller Natur. Darüber hinaus sind Vergiftungen im Rahmen von
Suizid(versuch)en von Bedeutung.
Die Klinische Toxikologie beschäftigt sich mit der Diagnose und Therapie von Vergiftungen, insbesondere solchen akuter
Natur. Neben einer sorgfältigen (Fremd)anamnese kann die Symptomatik u.U. Hinweise auf die mögliche
Vergiftungsursache geben. In der Regel erfordert die eindeutige Diagnose einer Vergiftung jedoch den Einsatz
analytischer Methoden. So muss vor allem bei unklarem Vergiftungsverdacht zunächst die Noxe identifiziert werden, die
für die Vergiftung verantwortlich ist. Dies erfolgt in der Regel durch eine Systematische Toxikologische Analyse (STA) einer
Urinprobe des Patienten mit dem Ziel möglichst viele Substanzen in möglichst kurzer Zeit zu erfassen. Nach Identifizierung
der Noxe sollte diese, sofern möglich, in einer Blutprobe des Patienten quantitativ bestimmt werden, um die Schwere und
Prognose der Vergiftung abzuschätzen. Die Ergebnisse der klinisch-toxikologischen Analyse werden gemeinsam mit dem
behandelnden Arzt unter Berücksichtigung von Symptomatik und Vergiftungsverslauf interpretiert. Auf dieser Basis kann
dann die (gezielte) Therapie des Patienten z.B. mit Antidota erfolgen.
Die Forensische Toxikologie beschäftigt sich mit allen toxikologischen Fragestellung von rechtlicher Relevanz, angefangen
bei Fragen zur Fahr(un)tüchtigkeit durch Alkohol und Drogen im Straßenverkehr über Fragen der Schuldfähigkeit bei
Straftaten unter Einfluss berauschender Mittel bis hin zur post-mortem Toxikologie in der Abklärung unklarer
Todesursachen oder eines Vergiftungsverdachts. Bei der Bearbeitung all dieser Fragestellungen sind analytisch-
toxikologische Methoden von entscheidender Bedeutung. Die Verfahren können dabei auf einen einzelnen Analyten (z.B.
Ethanol), auf eine definierte Gruppe von Substanzen (z.B. Fahren unter Drogeneinfluss gemäß §24a StVG) oder im Sinne
einer STA auf eine Vielzahl von Substanzen (z.B. post-mortem Toxikologie) ausgerichtet sein. Im letzteren Fall ist die
Herangehensweise ähnlich wie bei klinisch-toxikologischen Fällen. Allerdings ist zu beachten, dass aufgrund häufig
fehlender Angaben zur Symptomatik quantitativen Bestimmungen der involvierten Substanzen eine ungleich höhere
Bedeutung zukommt, da die Schwere der Vergiftung und somit ihre Bedeutung als potentielle Todesursache in solchen
Fällen praktisch ausschließlich über die Analytik erfolgen kann.
Ablauf der Veranstaltung
Klinische versus forensische Toxikologie
Zunächst werden die Grundlagen der Klinischen und Forensischen Toxikologie vermittelt. Bezüglich der Klinischen
Toxikologie werden u.a. wichtige Aspekte der Anamnese, sowie die Eignung verschiedener Probenmaterialien für die
klinisch-toxikologisch Analytik und der Wert der Analysenergebnisse für die Behandlung gemeinsam mit den DozentInnen
erarbeitet. Entsprechend wird dann für die forensische Postmortem-Toxikologie vorgegangen.
Pharmakologie und Toxikologie der Rauschmittel
In diesem Teil der Veranstaltung wird die Pharmakologie und Toxikologie wichtiger Rauschmittel wie Alkohol, Cannabis,
Amphetaminen, Cocain und Opiaten diskutiert und dabei auch pharmakologische Aspekte der Konsumformen im Dialog
erarbeitet. Diese Lerninhalte bilden dann auch die Basis für den sich anschließenden Teil zur verkehrsmedizinischen
Relevanz von Drogen und Arzneistoffen.
Einfluss von Drogen und Medikamenten auf die Fahrtüchtigkeit
Die DozentInnen geben zunächst einen Überblick über Verkehrsordnungswidrigkeiten (§ 24a Straßenverkehrsgesetz) und
-straftaten (§§ 315c und 316 Strafgesetzbuch). Die Unterschiede der Tatbestände werden mit den Studierenden
besprochen. Anschließend werden potentielle Auswirkungen von Alkohol, Arzneistoffen und Drogen auf die
Fahrsicherheit erarbeitet und anschließend für spezielle Wirkstoffgruppen detailliert besprochen. Auf Besonderheiten der
Pharmakokinetik wird dabei ebenso eingegangen, wie auf die Informationsbeschaffung und Beratung bezüglich
arzneimittelbedingter Beeinträchtigungen der Fahrsicherheit.
Für alle Teilbereiche werden zur Verdeutlichung der Lerninhalte auch konkrete Fallbeispiele besprochen. Zum Abschluss
der Veranstaltung erhalten die Studierenden Gelegenheit, das toxikologische Labor im Institut für Rechtsmedizin zu
besichtigen.
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Thema 4:
Auswirkungen von akuter Hypoxie auf Kreislaufregulation und Säure-Basen-Haushalt
Prof. Dr. R. Bauer, Institut für Molekulare Zellbiologie, Zentrum für Molekulare Biomedizin, Ebene 3,
Hans-Knöll Straße 2
Ziel
Die Studenten sollen lernen, pathogenetisch relevante Kompensationsmechanismen des Organismus bei akuter Störung
des Gasaustausches quantitativ zu erfassen und zu beurteilen. Dabei soll die Einsicht über die neuro-humorale Steuerung
der Kreislaufumstellung zur Sicherung vitaler Funktionen (Gewährleistung zerebraler O2 Versorgung) auf Kosten anderer
Organfunktionen vertieft werden.
Die Wirkung von Inhalationsnarkotika, Katecholaminen, Muskelrelaxatien, Antikoagulanzien und Blutersatz wird im
Verlauf des Experiments jeweils demonstriert und dokumentiert.
Versuchsdurchführung: Demonstration des Versuchsablaufs durch Videoclips und Darstellung des Verlaufs der
Vitalparameter an Originaldaten
Die Untersuchungen wurden an Schweinen (neugeborene Ferkel (Alter 7 Tage) im Rahmen eines Forschungsprojektes
(„Hirnprotektion bei frühkindlicher hypoxisch-ischämischer Encephalopathie“) durchgeführt. Die Wahl der Spezies
erfolgte aufgrund methodischer Notwendigkeiten und der weitgehenden Übertragbarkeit der Ergebnisse auf den
humanen Bereich. Die Untersuchungen erfordern eine fortlaufende Kontrolle und intensivmedizinische Beeinflussung
einer Reihe von Vitalparametern, häufige Blutentnahmen und eine künstliche Beatmung. Das Schwein ist hinsichtlich der
perinatalen Reifung von Funktionen des autonomen Nervensystems und metabolischer Funktionen dem Menschen
ähnlich.
Alle Untersuchungen wurden am narkotisierten Tier durchgeführt. Es wurde eine Inhalationsnarkose (0,9-1,2% Isofluran
in 70% Lachgas und 30% Sauerstoff) angewandt. Die Narkoseeinleitung erfolgte bei den neugeborenen Ferkeln mittels
des Narkosegas-Gemisches (Isoflurankonzentration 2%) über eine Gesichtsmaske. Hautdurchtrennungen erfolgten jeweils
nach zusätzlicher Lokalanästhesie mit 2% Lidokain (s.c.). Die Instrumentierung dauerte etwa 2h und die Durchführung &
Auswertung des Experimentes dauert 3h.
Beschreibung der Instrumentierung:
• Tracheotomie und Muskelrelaxation (Pancuroniumbromid 0,1 mg/kg); künstliche Beatmung
®
• (Servo-Ventilator 900C, Siemens-Elema ).
• Verlegen von Kathetern: A. femoralis zur fortlaufenden Messung des arteriellen Blutdruckes
• und zur Entnahme von arteriellen Blutproben für die Blutgasanalyse und Erfassung des Säure-Basen-Status; venöser
Katheter via V. jugularis in die obere Hohlvene für Flüssigkeitsersatz und zur Arzneimittelgabe.
• Fortlaufende Messung der Rektaltemperatur; Konstanthalten der Körpertemperatur mit Hilfe
• einer rückgekoppelten Wärmeeinheit (Wärmeplatte und Rotlichtlampe) bei 38°C ± 0,3°C.
• Erfassung der Hirndurchblutung (CBF) mittels Laser-Doppler-Flowmetrie (LDF). Hierfür wird der Schädelknochen
freigelegt, durch Bohrloch- Trepanation die harte Hirnhaut (Dura mater) dargestellt und eine LDF-Sonde mittels
®
Knochenwachs und Kaltpolymerisat (Kallocryl ) fixiert.
• Erfassung der Nierendurchblutung (NBF) mittels Laser-Doppler-Flowmetrie (LDF). Hierfür wird auf der rechten Seite
ein Flankenschnitt durchgeführt und der untere Nierenpol dargestellt. Nachfolgend wird eine LDF- Sonde mittels
Sekundenkleber auf der Niere befestigt.
• Erfassung des EEG mittels unipolarer Schraubenelektroden, die im Schädelknochen eingebracht und durch
®
Kaltpolymerisat (Kallocryl ) fixiert und isoliert werden.
• Ableitung des EKG mittels Einstichelektroden an beiden Vorderläufen und dem rechten Hinterlauf (Einthoven-
Ableitung) und fortlaufende Kalkulation der Herzfrequenz.
Versuchsablauf
Nach Beendigung der Instrumentierung wurde den Versuchstieren eine ca. 1-stündige Erholungsperiode eingeräumt. In
dieser Zeit wurden die Beatmungsparameter adjustiert und die erforderlichen Kalibrierungen durchgeführt. Dabei werden
den Studenten die notwendigen Mess- und Qualitätssicherungsprozeduren erläutert und demonstriert, wie sie bei der
Durchführung komplexer Untersuchungsvorhaben unabdingbar sind.
Die Studenten werden dabei mit der Nutzung von Erfassungs-Software vertraut gemacht und lernen dabei einige
Qualitätsmerkmale aktueller Online-Datenerfassung und -analyse kennen. Außerdem werden die Studenten in den
Umgang mit Blutgas- und Säure-Basen Analysegeräten eingeführt. Unter Benutzung formalisierter Versuchsablaufbögen
wird von den Studenten eine eigenständige Protokollierung des Versuchsablaufes vorgenommen.
Das Versuchsprotokoll bildet die Grundlage für die nachgeschaltete Auswertung des Versuchs mit Abgabe des Protokolls.
Nachfolgend beginnt die Demonstration des Experimentes. Zunächst wurden über 15 min unter normoxischen
Ausgangsbedingungen die Parameter zur Kennzeichnung der systemischen (ABP, HF) und regionalen (CBF, NBF)
Kreislaufdynamik aufgezeichnet. Außerdem wurde der Blutgas- und Säure- Basenstatus durch Gewinnung einer
arteriellen Blutprobe erfasst.
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Nachfolgend erfolgte die Umstellung auf eine schwere hyperkapnische Hypoxie durch Verminderung des FiO2 von 0.30
auf 0.06 und Zusatz von ~10% CO2 zum Atemgas für 15 min. Dabei wurden die Veränderungen in den systemischen und
regionalen Kreislaufparametern aufgezeichnet und für die nachfolgende quantitative Analyse gespeichert. Nach jeweils 5,
10 und 15 min wurden Blutproben entnommen und der Blutgas- und Säure- Basenstatus ermittelt.
Im Anschluss an die Periode „schwere hyperkapnische Hypoxie“ wurde die Beatmungsgaszusammensetzung wieder auf
den prähypoxischen Zustand eingestellt und über weitere 15 min die Normalisierung der Kreislaufparameter während der
Reoxignierungsperiode erfasst. Außerdem wurde nach jeweils 5, 10 und 15 min Blutproben entnommen und der Blutgas-
und Säure- Basenstatus ermittelt.
Zum Abschluss des Experiments wurden die Wirkungen von Medikamenten demonstriert, die bei kardiopulmonaler
Reanimation (CPR) eingesetzt werden. So wird zunächst die Wirkung von Natriumbikarbonat zur Pufferung einer
metabolischen Azidose nach schwere hypoxische Hypoxie gezeigt. Nachfolgend wird die systemische und regionale
Kreislaufreaktion auf intravenöse Applikation von Adrenalin (0,05 mg/Kg Körpergewicht) erfasst.
Auswertung
Herzkreislauf:
Die ermittelten Daten der kontinuierlichen Aufzeichnung werden einer Off-line Datenanalyse unterzogen. Dazu wird eine
Mehrkanal-Analyse der aufgezeichneten Parameter ABP, HF, CBF und NBF unter Nutzung der Software „Watisa for
Windows“ und „MS Excel“ durchgeführt.
Zunächst werden vorgegebene Zeitabschnitte festgelegt und von repräsentativen Kurvenabschnitten deskriptive
Parameter zur zusammenfassenden Dokumentation des Untersuchungsablaufes ermittelt. Diese Parameter werden
nachfolgend in geeigneter numerischer und graphischer Form dargestellt und dienen der im Anschluss an die
Datenanalyse stattfindenden Interpretation der Versuchsergebnisse.
Blutgas- und Säure- Basenstatus, Elektrolyt- und metabolische Daten:
Die ermittelten Daten der Blutprobenanalytik werden von den Studenten in analoger Weise in vorgegebene
Tabellenvorlagen in „MS Excel“ übertragen und in geeigneter numerischer und graphischer Form dargestellt.
Interpretation der Versuchsergebnisse
In einer abschließenden Diskussionsrunde werden die Studenten Gelegenheit haben, die ermittelten Ergebnisse zu
erörtern. Dabei wird schwerpunktmäßig zur Sprache kommen, wie die Verlaufsbeurteilung der ermittelten Kreislaufdaten
zu bewerten sind. Darüber hinaus werden die Mechanismen der zugrunde liegenden Kompensationsvorgänge erörtert
werden und die Rolle der erfassten Stoffwechselveränderungen, insbesondere die erheblichen Auswirkungen auf den
Säure- Basenhaushalt besprochen.
Vorausgesetzes Wissen
• Pathophysiologie systemischer Kreislaufregulation bei akutem O2 Mangel
• Adaptation und Kompensation bei Hypoxie
• Störungen des Säure-Basen-Haushaltes
___________________________________________________________________
Fragen:
1. Nenne und charakterisieren Sie die 4 Grundtypen von Hypoxie!
2. Welche Grundmechanismen sind für Redistribution des zirkulierenden Blutvolumens bei akuter hypoxischer bzw.
hyperkapnischer Hypoxie verantwortlich?
3. Wodurch ist metabolische Azidose gekennzeichnet? Welche Kompensationsmechanismen hat der
Säugetierorganismus, die Auswirkungen von vermehrtem Anfall fixer Säuren zu reduzieren?
Literatur: Bauer, R.: Stupor and coma: pathophysiology of hypoxia-ontogenetic aspects. Suppl Clin Neurophysiol. 2004;57:681-7.
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Thema 5: „Pharmakogenetik von Cyp-Enzymen“
Prof. Dr. Eva Neuhaus, Pooja Dasgupta, Julia Karius; Inst. für Pharmakologie/Toxikologie, Drackendorfer Str. 1, 1. OG, C22
Bei der Verabreichung der Standarddosis bestimmter Medikamente treten bei einigen Patienten unerwünschte
Nebenwirkungen auf, während andere nicht auf die Behandlung ansprechen. Das Ansprechen auf eine medikamentöse
Behandlung wird von zahlreichen persönlichen und umweltbedingten Faktoren wie Begleiterkrankungen, Alter, Ethnie,
Begleitmedikation, Ernährung und Tabakkonsum, aber auch von genetischen Variablen bestimmt. In der
Pharmakogenetik wird der Einfluss des genetischen Profils auf das Ansprechen auf eine medikamentöse Behandlung
untersucht. Ziel ist es dabei, die Arzneimitteltherapie zu personalisieren und damit zu optimieren. Ein Großteil der
genetischen Variabilität ist in der Superfamilie der Cytochrom-P450- Monooxigenasen (CYP) zu finden, welche für die
Metabolisierung zahlreicher endogener und exogener Substanzen, hauptsächlich in der Leber, verantwortlich sind.
Tests zur Genotypisierung von Enzymen des Cytochrom-P450-Systems können die Therapiesicherheit bezüglich der
Wirkspiegel und Nebenwirkungen verbessern. Die orale Antikoagulation mit Warfarin oder Phenprocoumon, stellt die
Standardtherapie zur Prävention von thromboembolischen Ereignissen dar. Neben der niedrigen therapeutischen Breite,
ist die klinische Anwendung durch die hohe individuelle Variabilität in der notwendigen Dosierung mit Komplikationen
behaftet. Genetische Faktoren haben einen großen Einfluss auf die Dosierung, der aber im Prinzip gut vorhersagbar ist.
Die angeborene Variabilität bei der Metabolisierung von Coumarinen hängt hauptsächlich von zwei Genen ab, CYP2C9
und VKORC1, das für eine Untereinheit des Vitamin K Epoxid-
Reduktase-Komplexes kodiert. Die Variationen, die die Coumarin-Dosierung beeinflussen, sind CYP2C9 430C>T
(CYP2C9*2), CYP2C9 1075A>C (CYP2C9*3), und VKORC1 1639G>A. Relativ zum homozygoten Wildtyp, sind Träger einer
der Varianten empfindlicher gegenüber Coumarinen, das heißt es besteht ein höheres Risiko für unerwünschte
Wirkungen durch zu starke Antikoagulation bei Standartdosierung. Personen, die zwei Kopien des Wildtyp-CYP2C9-Gens
CYP2C9*1 besitzen, metabolisieren Warfarin sehr gut. Träger der Varianten CYP2C9*2 und CYP2C9*3 (Punktmutationen
in Exon 3 und 7 von CYP2C9) haben weniger Kapazität.
VKORC CYP2C9 CYP2C9 CYP2C9 CYP2C9 CYP2C9 CYP2C9
Genotyp *1/*1 *1/*2 *1/*3 *2/*2 *2/*3 *3/*3
GG 5-7 mg 5-7 mg 3-4 mg 3-4 mg 3-4 mg 0,5-2 mg
AG 5-7 mg 3-4 mg 3-4 mg 3-4 mg 0,5-2 mg 0,5-2 mg
AA 3-4 mg 3-4 mg 0,5-2 mg 0,5-2 mg 0,5-2 mg 0,5-2 mg
Warfarin-Dosierung in Abhängigkeit vom CYP2C9 und VKORC1 Genotyp, zusätzlich abhängig von der jeweiligen
pharmazeutischen Coumarin-Präparation ab. Cleveland Clinic Journal of Medicine. 2011 April;78(4):243-257
Da insbesondere Variationen im CYP2C9 Gen relativ häufig sind, die CYP2C9*2 Variante kommt bei bis zu 20% der
kaukasischen Bevölkerung vor, soll im Praktikum die Genotypisierung exemplarisch an dieser Variante durchgeführt
werden. Dabei kann jeder, der das möchte, seinen eigenen Genotyp bestimmen. Zu diesem Zweck wird zunächst aus
einem Bluttropfen, der aus der Fingerbeere genommen wird, genomische DNA isoliert. Dann wird mit Hilfe eines „Duplex
Allele-specific Amplification“ ASA-PCR Ansatzes der Genotyp bestimmt. Die PCR Reaktion läuft dabei mit zwei Primer-
Paaren gleichzeitig ab: Ein externes Primerpaar (forward und reverse) wird mit zwei Allel-spezifischen Primern, die
entweder das wildtypische oder das mutierte Nukleotid in Position 30 erkennen (T-forward, C-reverse), kombiniert. Der
interne Wild-typ Primer in vorwärts Richtung (T-forward) amplifiziert die Region zwischen dem Wild-typ Primer und dem
reversen externen Primer nur, wenn das Wild-typ Allel vorhanden ist. Der interne Mutations-spezifische Primer in
rückwärts Richtung (C-reverse) amplifiziert die Region zwischen diesem Primer und dem forward externen Primer nur,
wenn das mutierte Allel vorhanden ist. Die PCR Produkte vom Wildtyp-Allel und vom mutierten Allel können durch die
Größe mittel Agarose-Gelelektrophorese unterschieden werden. Ein drittes Fragment entsteht durch Amplifikation der
Region zwischen den externen Primern, dieses dient als interne Kontrolle.
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CYP2C9*2 Primer
C2C9-E3-forward AATAGTAACTTCGTTTGCTGTTATCTC
C2C9-E3-reverse CAGTAGAGAAGATAGTAGTCCAGTAAGGT
C2C9-E3-T-forward GGAAGAGGAGCATTGAGGACT
C2C9-E3-C-reverse GGGCTTCCTCTTGAACACG
Primer-Kombination Bandengröße
C2C9-E3-forward und C2C9-E3-reverse 581 bp
C2C9-E3-T-forward und C2C9-E3-reverse (T Allel) 127 bp
C2C9-E3-C reverse und C2C9-E3-forward (C Allel) 493 bp
Das Gel sieht bei erfolgreicher PCR folgendermaßen aus:
Wild-typ heterozygot
PCR Methode: Spohn et al., Mol Diagn Ther 2011; 15 (1)
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Thema 6:
Dosis/Wirkungs-Beziehungen von M-Rezeptor-Agonisten und -Antagonisten: Messung von
Calciumantworten mittels FLIPR.
Frau Dr. D. Schütz, Praveen Kumar; Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Drackendorfer Str. 1, 1. OG, B22
Heptahelikale Rezeptoren, die an Gq Proteine koppeln, induzieren intrazellulär einen Anstieg der Calciumkonzentration.
Dieser Prozess kann in Zellkulturen mit calciumsensitiven Farbstoffen und einem Fluorometric Imaging Plate Reader
Device gemessen werden. Die Technologie wird in der akademischen und der industriellen Forschung zur Identifizierung
neuer GPCR-Liganden im high throughput Maßstab eingesetzt.
Im Praktikum wird das Modell der humanen embryonalen Nierenzelllinie HEK293 verwendet, um die FLIPR-Technologie
zu demonstrieren. Die HEK293-Zellen werden kultiviert und am Versuchstag mit Calciumfarbstoff beladen. Die Calcium-
Antworten werden nach M-Agonsit-/M-Antagonist-Behandlung mit dem FLIPR-Gerät ausgelesen und anschließend
computergestützt ausgewertet. Dabei sollen Dosis-Wirkungsbeziehungen von Agonisten sowie allosterische und
kompetitive Eigenschaften von Antagonisten ermittelt werden.
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