Befall mit dem Kleinen Beutenkäfer - (Aethina tumida) Amtliche Methode und Falldefinition
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Amtliche Methode und Falldefinition Befall mit dem Kleinen Beutenkäfer (Aethina tumida) Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Stand 06.05.2021
Befall mit dem Kleinen Beutenkäfer (Aethina tumida) Inhaltsverzeichnis Amtliche Methode ..................................................................................................... 3 1. Charakterisierung des Befalls ..................................................................................... 3 1.1 Erreger ........................................................................................................... 3 1.2 Klinische Symptomatik ........................................................................................ 3 1.3 Differenzialdiagnose ........................................................................................... 3 1.4 Diagnostische Indikation ...................................................................................... 4 1.5 Zuständige Untersuchungseinrichtung ...................................................................... 4 1.6 Rechtsgrundlagen ............................................................................................. 4 2. Untersuchungsmaterial ............................................................................................ 5 2.1 Untersuchungsmaterial Gemüll .............................................................................. 5 2.2 Untersuchungsmaterial Waben ............................................................................... 5 2.3 Untersuchungsmaterial aus Käferfallen ..................................................................... 6 3. Untersuchungsgang ................................................................................................. 6 3.1 Identifizierung der adulten Käfer und Larven .............................................................. 6 3.2 Molekularbiologische Methoden: real-time PCR ........................................................... 6 3.3 Serologische Tests ............................................................................................. 8 Literatur .................................................................................................................... 9 Falldefinition – Befall mit dem Kleinen Beutenkäfer; Aethina tumida ............................... 10 2 | Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Stand 06.05.2021
Befall mit dem Kleinen Beutenkäfer (Aethina tumida) Amtliche Methode 1. Charakterisierung des Befalls 1.1 Erreger Der Kleine Beutenkäfer, Aethina tumida Murray, Coleoptera: Nitidulidae (Murray 1867), kommt ursprünglich aus Afrika, südlich der Sahara. Er hat sich inzwischen auf andere Kontinente ausgebreitet, wahrscheinlich vor allem durch Importe von Bienen. Der Käfer sucht seine Wirte, die Bienenvölker, zum Verbleib und zur Vermehrung auf. Nach der Verpaarung im Bienenvolk werden die Eier in unregelmäßigen Gelegen, bevorzugt in Spalten der Beuten oder in Waben, die Pollen und Brut enthalten, abgelegt. Nach zwei bis sechs Tagen schlüpfen die Larven und beginnen zu fressen. Nach zehn bis 29 Tagen haben die Larven ihr Wachstum abgeschlossen und sind ca. zehn Millimeter lang. Nun verlassen die Larven das Bienenvolk in der Regel durch den Stockeingang und graben sich meist in unmittelbarer Nähe des befallenen Volkes in den Boden. Sie können aber auch größere Entfernungen zurücklegen, um geeigneten Boden zu finden. Im Boden bauen sie glattwandige Erdzellen, in denen sie sich verpuppen. Die Verpuppung dauert je nach Temperatur und Feuch tigkeit zwei bis acht Wochen. Danach schlüpfen die adulten Käfer und suchen neue Beuten mit Bienenvölkern auf. Damit ist der Lebenszyklus des Kleinen Beutenkäfers abgeschlossen. 1.2 Klinische Symptomatik Der Käfer lebt und vermehrt sich hauptsächlich in Bienenvölkern und in gelagerten Bienenprodukten, z. B. Honigwaben. Die Larven fressen Honig, Pollen und Brut und zerstören dabei nicht nur die Wabe, sondern verderben auch den Honig. Leicht befallene Waben zeigen Fressgänge der Larven, sowie Verschleimung des Honigs. Stark befallene Waben können komplett zerfallen. Am Beutenboden verbleibt bei starkem Befall häufig nur ein schwärzlich trockenes Mehl (Fraßmehl) aus dem Kot der Larven und zerstörtem Wachs. Sind Honigwaben befallen, so läuft der vergorene, schleimige Honig aus den Waben auf den Beutenboden und aus dem Flugloch. Es entsteht fauliger Geruch. 1.3 Differenzialdiagnose Der adulte Kleine Beutenkäfer kann z. B. mit dem nahe verwandten Glanzkäfer, Cychramus luteus, der ebenfalls in Bienenvölkern vorkommen kann, leicht verwechselt werden. Die Eier des Kleinen Beutenkäfers sind mit im Mittel 1,4 × 0,26 mm etwa um ein Drittel kleiner als Eier der Honigbiene. Käferlarven können von Wachsmottenlarven anhand ihrer morphologischen Merkmale leicht unterschieden werden: Wachsmot tenlarven haben Bauchfüße am 3. und 6. Hinterleibsegment, Käferlarven besitzen sechs voll ausgebildete Beine in unmittelbarer Nähe des Kopfes und dorsale Stachelreihen (siehe auch: https://www.o penagrar.de/receive/openagrar_mods_00012498). Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Stand 06.05.2021 | 3
Befall mit dem Kleinen Beutenkäfer (Aethina tumida) 1.4 Diagnostische Indikation ▪ Tierverkehr ▪ Klinischer oder epidemiologischer Verdacht ▪ Untersuchung im Rahmen des Nachweises der Seuchenfreiheit (Gesundheitszeugnisse für das Verbringen der Bienenvölker an einen anderen Standort) 1.5 Zuständige Untersuchungseinrichtung ▪ Veterinäruntersuchungsämter, Tiergesundheitsämter bzw. staatliche Lebensmittel- und Veterinärunter suchungsämter der Bundesländer ▪ Friedrich-Loeffler-Institut (NRL für Bienenkrankheiten), Südufer 10, 17493 Greifswald-Insel Riems, Tel. 0383517-0 1.6 Rechtsgrundlagen (in der jeweils geltenden Fassung) ▪ Tiergesundheitsgesetz ▪ Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen ▪ Bienenseuchenverordnung ▪ Binnenmarkt-Tierseuchenschutzverordnung ▪ Verordnung (EU) Nr. 206/2010 der Kommission vom 12. März 2010 zur Erstellung von Listen der Dritt länder, Gebiete und Teile davon, aus denen das Verbringen bestimmter Tiere […] in die Europäische Union zulässig ist […] ▪ Entscheidung 2003/881/EG der Kommission vom 11. Dezember 2003 über die Tiergesundheitsbedin gungen und -bescheinigungen für die Einfuhr von Bienen […] ▪ Richtlinie 92/65/EWG des Rates vom 13. Juli 1992 über die tierseuchenrechtlichen Bedingungen für den Handel mit Tieren […] ▪ Gesetz zur Vorbeugung vor und Bekämpfung von Tierseuchen (Tiergesundheitsgesetz – TierGesG) ▪ Bienenseuchen-Verordnung (BienSeuchV) ▪ Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen (TierSeuchAnzV) ▪ Verordnung über das innergemeinschaftliche Verbringen sowie die Einfuhr und Durchfuhr von Tieren und Waren (Binnenmarkt-Tierseuchenschutzverordnung – BmTierSSchV) ▪ Verordnung (EU) 2016/429 des Europäischen Parlaments und des Rates vom 9. März 2016 zu Tierseuchen und zur Änderung und Aufhebung einiger Rechtsakte im Bereich der Tiergesundheit (…) ▪ Verordnung (EU) 2017/625 des Europäischen Parlaments und des Rates vom 15. März 2017 über amtliche Kontrollen und andere amtliche Tätigkeiten zur Gewährleistung der Anwendung des Lebens- und Futter mittelrechts und der Vorschriften über Tiergesundheit und Tierschutz (…) ▪ Delegierte Verordnung (EU) 2020/689 der Kommission vom 17. Dezember 2019 zur Ergänzung der Ver ordnung (EU) 2016/429 des Europäischen Parlaments und des Rates hinsichtlich Vorschriften betreffend Überwachung, Tilgungsprogramme und den Status „seuchenfrei“ (…) 4 | Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Stand 06.05.2021
Befall mit dem Kleinen Beutenkäfer (Aethina tumida) ▪ Delegierte Verordnung (EU) 2020/692 der Kommission vom 30. Januar 2020 zur Ergänzung der Verord nung (EU) 2016/429 des Europäischen Parlaments und des Rates hinsichtlich Vorschriften für den Eingang von Sendungen von bestimmten Tieren (…) ▪ Durchführungsverordnung (EU) 2020/2235 der Kommission vom 16. Dezember 2020 mit Durchführungs bestimmungen zu den Verordnungen (EU) 2016/429 und (EU) 2017/625 des Europäischen Parlaments und des Rates hinsichtlich der Muster für Veterinärbescheinigungen (…) ▪ Durchführungsverordnung (EU) 2021/403 der Kommission vom 24. März 2021 mit Durchführungsbestim mungen zu den Verordnungen (EU) 2016/429 und (EU) 2017/625 des Europäischen Parlaments und des Rates hinsichtlich der Muster für Veterinärbescheinigungen (…) ▪ Durchführungsverordnung (EU) 2021/404 der Kommission vom 24. März 2021 zur Festlegung der Listen von Drittländern, Gebieten und Zonen derselben, aus denen der Eingang in die Union von Tieren, Zucht material und Erzeugnissen tierischen Ursprungs (…) ▪ Durchführungsverordnung (EU) 2021/619 der Kommission vom 15. April 2021 zur Änderung der Durch führungsverordnungen (EU) 2020/2235, (EU) 2020/2236 und (EU) 2021/403 im Hinblick auf Übergangs bestimmungen für die Verwendung von Veterinärbescheinigungen (…) 2. Untersuchungsmaterial Zur Untersuchung bieten sich der adulte Käfer, die Larven, die Eier, der Beutenboden (Bodeneinlagen) und die Waben bzw. Honigwaben an. 2.1 Untersuchungsmaterial Gemüll Eine einfache Methode zur Diagnose des Kleinen Beutenkäfers besteht in der Untersuchung des Beutenbo dens. Bei starkem Befall trockener Waben (Pollen und/oder Brut) verbleibt häufig nur noch ein schwärzliches trockenes Pulver (Fraßmehl) aus dem Kot der Larven und zerstörtem Wachs, das sich auf dem Boden der Beute anhäuft. In diesem Pulver können sich die Larven oder Käfer verstecken. So kann der Beuteboden direkt makroskopisch auf vorhandene Käfer oder Larven untersucht werden. Das Gemüll kann auch moleku larbiologisch mit der unter 2.3 beschriebenen Methode untersucht werden. Vor der Extraktion wird 1 g Ge müll mit 10 ml 1 × PBS homogenisiert und anschließend für zwei Stunden bei 37 °C geschüttelt. Davon werden 2 ml abgenommen und bei etwa 20.000 × g (maximale Drehzahl) für 10 Minuten zentrifugiert. An schließend wird das Pellet in 1 ml 1 × PBS gelöst und 80 µl davon für die Extraktion eingesetzt. 2.2 Untersuchungsmaterial Waben Durch das Fressen und Kotabsetzen der Larven des Kleinen Beutenkäfers werden die Honigwaben stark be schädigt und bekommen ein „schleimiges“ Aussehen. Der Honig ist verdorben und unbrauchbar. Leere Wa ben und Brutwaben weisen Fraßgänge der Larven auf. Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Stand 06.05.2021 | 5
Befall mit dem Kleinen Beutenkäfer (Aethina tumida) 2.3 Untersuchungsmaterial aus Käferfallen Die Käfer verstecken sich vor Licht oder den sie attackierenden Bienen meist in Spalten und Ritzen, bevor zugt in der Nähe des Bodenbretts. Man kann daher am Beutenboden Käferfallen auslegen. Diese können im einfachsten Fall aus einem Stück Wellpappe bestehen, unter dem sich die Käfer sammeln. Effektiver kann man die Käfer mit modifizierten Beutenböden, in Boden- bzw. Wandfallen oder in Ölfallen, welche zwischen die Wabengassen platziert werden, fangen (https://www.fli.de/de/kaeferfallen). 3. Untersuchungsgang 3.1 Identifizierung der adulten Käfer und Larven Die Bestimmung des Käfers und der Larven erfolgt aufgrund ihres Aussehens und der morphologischen Be sonderheiten. Weiteres hierzu siehe in der Broschüre des Bundesministeriums für Verbraucherschutz, Ernäh rung und Landwirtschaft „„Der Kleine Beutenkäfer“– Erkennen und Bekämpfen“ bzw. in der Broschüre „Der Kleine Beutenkäfer Aethina tumida“, welche auf der Internetseite des NRL für Bienenkrankheiten zum Download zur Verfügung gestellt wird (siehe auch Link unter 1.3). Als Vergleichsmaterial dienen abgestor bene Käfer bzw. Larven. 3.2 Molekularbiologische Methoden: real-time PCR Das auf der Publikation von Ward et al. (2007) basierende qPCR SHB Mix 1 FAM-System ermöglicht den sensitiven und spezifischen Nachweis von Aethina tumida. Für die Untersuchung eignen sich adulte Käfer, Puppen, Larven, Eier und Teile von Käfern. Der Assay wird in dem hier vorgestellten Protokoll mit einem internen Kontroll-Assay in einer Duplex-qPCR kombiniert. Bei der internen Kontrolle handelt es sich um ein universelles internes Kontrollsystem (Hoffmann et al., 2006) basierend auf IC2-DNA. Die DNA-Extraktion sollte mit dem QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) oder einem vergleichbaren System durchgeführt werden. Die Amplifizierung der Feldprobe und der internen Kontrolle (IC) erfolgt als duplex-qPCR in einem Reakti onsansatz auf Basis des QuantiTect Multiplex PCR NoROX Kit (oder eines vergleichbaren Systems) in 25 µl Gesamtvolumen. Sollte eine andere chemische Basis für die Detektion genutzt werden, muss in Vergleichs- experimenten die Sensitivität und Spezifität der verwendeten Reagenzien gezeigt werden. Als Kontrollen sollten neben der „No Template“ Kontrolle (NTC) und mindestens einer positiven Kontrolle (PC) auch eine geeignete Anzahl von DNA-Isolierungskontrollen (DIC) mitgeführt werden. Die DNA-Isolierungskontrollen soll ten im optimalen Falle negatives Untersuchungsmaterial in der gleichen Art wie die Feldproben darstellen (z. B. andere Insekten, aber auch negatives Serum). Dies hat den Vorteil, dass suboptimale Extraktionen und partielle Inhibierungen von Feldproben festgestellt werden können. Zu den vorgelegten 20 µl Mastermix werden 5 µl DNA-Template pipettiert. 6 | Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Stand 06.05.2021
Befall mit dem Kleinen Beutenkäfer (Aethina tumida) Auswertung: HEX-Kanal: Für alle Feldproben und DICs sollte ein vergleichbarer Cycle of quantification-HEX Wert (Cq-Wert) nach weisbar sein. Sind die Cq-Werte für die genannten Proben vorhanden, ist von einer erfolgreichen DNA-Iso lierung und qPCR auszugehen. Werden Cq-HEX-Werte von > 30 festgestellt, kann eine suboptimale Extraktion und/oder eine partielle Inhibition der Extraktion vorliegen. Diese sollte durch Vorverdünnung der zu extra hierenden Probe eliminiert werden. Ist kein Cq-Wert für die IC feststellbar und gleichzeitig auch keine A. tumida-spezifische Amplifizierung aufgetreten, ist die qPCR nicht auswertbar und somit die DNA-Isolierung und/oder die qPCR zu wiederholen. Ist auch bei der DIC kein Cq-HEX-Wert feststellbar, muss die Funktiona lität des Primer-Sonden-Mixes zum Nachweis von EGFP überprüft werden. Für die NTC sollte kein Cq-HEX- Wert feststellbar sein. FAM-Kanal: Für die PC sollte ein FAM Cq-Wert um 30 feststellbar sein. Hiermit wird die Funktion des SHB Mix 1 FAM- Detektionssystems sichergestellt. Ist für die PC kein Cq-Wert feststellbar, ist die qPCR mit neuen SHB Mix 1 FAM und/oder einer neuen PC zu wiederholen. Für die DIC und die NTC sollte kein Cq-FAM-Wert feststellbar sein. Wenn alle eingesetzten Kontrollen in richtiger Weise reagieren, ist eine Auswertung der Feldproben ansätze möglich. Eine Aethina tumida-Verdachtsprobe wird dann als positiv/verdächtig in der qPCR gewer tet, wenn ein FAM Cq-Wert für die entsprechende Probe festgestellt wird oder ein signifikanter Anstieg der FAM-Fluoreszenz über das Basislevel festzustellen ist. Eine zusätzliche Bestätigung der Resultate kann mit weiteren, differenten qPCR/PCR-Assays oder Sequenzierung erfolgen. Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Stand 06.05.2021 | 7
Befall mit dem Kleinen Beutenkäfer (Aethina tumida) SHB Mix 1 FAM: Volumen Oligo (Konzentration) Sequenz der Primer/Sonde (5΄- 3΄) 20 µl SHB207F (100 pmol/µl) TCT AAA TAC TAC TTT CTT CGA CCC ATC (A/G) 20 µl SHB315R (100 pmol/µl) TCC TGG AAT TAA AAT ATA AAC TTC TGG 2,5 µl SHB245T (100 pmol/µl) ATC CAA TCC TAT ACC AAC ACT TAT TTT GAT TCT TCG GAC 157,5 µl 0,1 x TE (pH 8,0) 200,0 µl Primer-Sonden-Mix Die Länge des Amplikons aus diesen Primern beträgt 109 bp (Ward et. al 2007). EGFP-Mix 4 (5) HEX: (Hoffmann et al., 2006) Volumen Oligo (Konzentration) Sequenz der Primer/Sonde (5΄- 3΄) 5,0 µl EGFP-11-F (100 pmol/µl) CAG CCA CAA CGT CTA TAT CAT G 5,0 µl EGFP-10-R (100 pmol/µl) CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 2,5 µl EGFP-1HEX (100 pmol/µl) AGC ACC CAG TCC GCC CTG AGC A 187,5 µl 0,1 x TE (pH 8,0) 200,0 µl Primer-Sonden-Mix 3.3 Serologische Tests Geprüfte Antiseren sind zurzeit nicht käuflich zu erwerben. 8 | Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Stand 06.05.2021
Befall mit dem Kleinen Beutenkäfer (Aethina tumida) Literatur ▪ Hoffmann, B., Depner, K., Schirrmeier, H., Beer, M., (2006): A universal heterologous internal control system for duplex real-time RT-PCR assays used in a detection system for pestiviruses, Journal of Viro logical Methods 136: 200–209. ▪ Schäfer, M. O., Pettis, J. S., Ritter, W., Neumann, P., (2008): A scientific note on qualitative diagnosis of small hive beetles, Aethina tumida, in the field, Apidologie 39: 564-565. ▪ Ward, L., Brown, M., Neumann, P., Wilkins, S., Pettis, J., Boonham, N., (2007): A DNA method for screening hive debris for the presence of small hive beetle (Aethina tumida), Apidologie 38: 272–280. Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Stand 06.05.2021 | 9
Falldefinition – Befall mit dem Kleinen Beutenkäfer; Aethina tumida Klinisches Bild Das klinische Bild hängt von der Größe der Käferpopulation ab: ▪ Adulte Kleine Beutenkäfer im Bienenvolk ▪ Larven des Kleinen Beutenkäfers minieren die Brut und Futterwaben ▪ Massenhaftes Auftreten von Wanderlarven auf dem Bodenbrett oder vor der Bienenbeute ▪ Befallene Waben haben ein schleimiges Aussehen ▪ Honig tropft von den Waben und läuft aus dem Flugloch Inkubationszeit: keine Labordiagnostischer Nachweis Erregernachweis: ▪ Visuelle Bestimmung der adulten Käfer und der Larven mithilfe eines Bestimmungsschlüssels ▪ Molekulargenetische Untersuchung: PCR mit Differenzierung der DNA des Käfers in Eiern, Larven und Adulten Epidemiologischer Zusammenhang Die Übertragung des Kleinen Beutenkäfers erfolgt durch Verbringen von Bienenvölkern, dem Handel mit Bienenmaterial (Wachs, Waben, Gerätschaften, Beuten) und Verflug des Käfers. Der Käfer kann sich auch außerhalb des Bienenvolks auf Bienenwaben, auf bestimmten Blüten und Früchten, in Hummelvölkern und in Nestern anderer Bienen vermehren. Voraussetzung für den Verdacht Vorkommen des Käfers (im Bienenvolk, im imkerlichen Betrieb sowie außerhalb des Betriebs in Hummelvöl kern etc.) oder Vorliegen klinischer Symptome. Durch TSN zu übermittelnder Fall Voraussetzungen für die Feststellung eines Falles: Labordiagnostischer Nachweis des Käfers 10 | Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Stand 06.05.2021
Befall mit dem Kleinen Beutenkäfer (Aethina tumida) Rechtsvorschriften (in der jeweils geltenden Fassung) ▪ Tiergesundheitsgesetz (TierGesG) in der jeweils geltenden Fassung ▪ Bienenseuchen-Verordnung (BienSeuchV) in der jeweils geltenden Fassung ▪ Gesetz zur Vorbeugung vor und Bekämpfung von Tierseuchen (Tiergesundheitsgesetz – TierGesG) ▪ Bienenseuchen-Verordnung (BienSeuchV) ▪ Verordnung über anzeigepflichtige Tierseuchen (TierSeuchAnzV) ▪ Verordnung über das innergemeinschaftliche Verbringen sowie die Einfuhr und Durchfuhr von Tieren und Waren (Binnenmarkt-Tierseuchenschutzverordnung – BmTierSSchV) ▪ Verordnung (EU) 2016/429 des Europäischen Parlaments und des Rates vom 9. März 2016 zu Tier seuchen und zur Änderung und Aufhebung einiger Rechtsakte im Bereich der Tiergesundheit (…) ▪ Verordnung (EU) 2017/625 des Europäischen Parlaments und des Rates vom 15. März 2017 über amtliche Kontrollen und andere amtliche Tätigkeiten zur Gewährleistung der Anwendung des Le bens- und Futtermittelrechts und der Vorschriften über Tiergesundheit und Tierschutz (…) ▪ Delegierte Verordnung (EU) 2020/689 der Kommission vom 17. Dezember 2019 zur Ergänzung der Verordnung (EU) 2016/429 des Europäischen Parlaments und des Rates hinsichtlich Vorschriften be treffend Überwachung, Tilgungsprogramme und den Status „seuchenfrei“ (…) ▪ Delegierte Verordnung (EU) 2020/692 der Kommission vom 30. Januar 2020 zur Ergänzung der Ver ordnung (EU) 2016/429 des Europäischen Parlaments und des Rates hinsichtlich Vorschriften für den Eingang von Sendungen von bestimmten Tieren (…) ▪ Durchführungsverordnung (EU) 2020/2235 der Kommission vom 16. Dezember 2020 mit Durchfüh rungsbestimmungen zu den Verordnungen (EU) 2016/429 und (EU) 2017/625 des Europäischen Par laments und des Rates hinsichtlich der Muster für Veterinärbescheinigungen (…) ▪ Durchführungsverordnung (EU) 2021/403 der Kommission vom 24. März 2021 mit Durchführungsbe stimmungen zu den Verordnungen (EU) 2016/429 und (EU) 2017/625 des Europäischen Parlaments und des Rates hinsichtlich der Muster für Veterinärbescheinigungen (…) ▪ Durchführungsverordnung (EU) 2021/404 der Kommission vom 24. März 2021 zur Festlegung der Lis ten von Drittländern, Gebieten und Zonen derselben, aus denen der Eingang in die Union von Tieren, Zuchtmaterial und Erzeugnissen tierischen Ursprungs (…) ▪ Durchführungsverordnung (EU) 2021/619 der Kommission vom 15. April 2021 zur Änderung der Durchführungsverordnungen (EU) 2020/2235, (EU) 2020/2236 und (EU) 2021/403 im Hinblick auf Übergangsbestimmungen für die Verwendung von Veterinärbescheinigungen (…) Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit Südufer 10, D-17493 Greifswald – Insel Riems, www.fli.de Amtliche Methode und Falldefinition | FLI | Stand 06.05.2021 | 11
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