Bruchpunktlokalisation beim Nijmegen Breakage Syndrome

 
Aus der Strahlenklinik
                               der
        Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
                  Direktor: Prof. Dr. R. Fietkau

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Bruchpunktlokalisation beim Nijmegen Breakage
                  Syndrome

                     Inaugural-Dissertation
                 zur Erlangung der Doktorwürde
                   der Medizinischen Fakultät
                               der
                 Friedrich-Alexander-Universität
                       Erlangen-Nürnberg

                         vorgelegt von
                         Daniel Blischke
                               aus
                       Frankfurt am Main
Gedruckt mit Erlaubnis der
  Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
                    Erlangen-Nürnberg

Dekan:                        Prof. Dr. J. Schüttler

Referent:                     PD Dr. L. Distel

Korreferent:                  Prof. Dr. R. Fietkau

Tag der mündlichen Prüfung:   29.06.2011
Diese Arbeit widme ich meinen Eltern, die mich auf meinem Weg immer
                          unterstützt haben
Inhaltsverzeichnis

Zusammenfassung.............................................................................................. 1
Abstract ............................................................................................................... 3
1.      Einleitung ..................................................................................................... 5
     1.1. Historie zum Nijmegen Breakage Syndrome ......................................... 5
     1.2. Das NBS1-Gen ...................................................................................... 5
     1.3. Proteinstruktur von Nbs1........................................................................ 5
     1.4. Zelluläre Aufgaben des Nbs1-Proteins .................................................. 6
     1.5. Molekulare Ursachen für NBS................................................................ 8
     1.6. Relevanz für die Tumortherapie............................................................. 9
     1.7. Ziel der Arbeit......................................................................................... 9
2.      Material und Methoden .............................................................................. 11
     2.1. Untersuchungsmaterial ........................................................................ 11
     2.2. Fluoreszenz in situ Hybridisierung ....................................................... 11
        2.2.1. Präparation/Auftropfen ..................................................................... 12
        2.2.2. Fixierung/Vorbereitung..................................................................... 13
        2.2.3. Denaturierung/Prähybridisierung ..................................................... 14
        2.2.4. Hybridisierung .................................................................................. 14
        2.2.5. Detektion .......................................................................................... 15
        2.2.6. Amplifikation..................................................................................... 15
        2.2.7. Gegenfärbung .................................................................................. 15
     2.3. Auswertung .......................................................................................... 16
        2.3.1. Kriterien zur Bruchstellenanalyse..................................................... 16
        2.3.2. Bildverarbeitung ............................................................................... 16
        2.3.3. Datenverarbeitung............................................................................ 17
3.      Ergebnisse ................................................................................................. 19
     3.1. FISH-Analyse ....................................................................................... 19
     3.2. Mitoseindex .......................................................................................... 22
     3.3. Bruchereignisse P122 .......................................................................... 22
     3.4. Statistische Analyse ............................................................................. 28
4.      Diskussion.................................................................................................. 30
Literaturverzeichnis ........................................................................................... 37
Abkürzungsverzeichnis ..................................................................................... 43
     Abkürzungen von Fachausdrücken ............................................................... 43
Abkürzungen von Einheiten........................................................................... 44
   Vorsätze bei Größeneinheiten ....................................................................... 44
Anhang .............................................................................................................. 45
   Verwendete Lösungen................................................................................... 45
   Bezugsquellen für die benutzten Substanzen ............................................... 49
Danksagung ...................................................................................................... 50
1

Zusammenfassung

Hintergrund und Ziele: Jede Körperzelle ist ständig durch umweltbedingte
DNA-Schäden bedroht, wie sie beispielsweise durch Bestrahlung verursacht
werden. Diese können eine existenzielle Gefahr für die Zelle darstellen. Zellen
von Nijmegen Breakage Syndrome (NBS) Patienten sind auf Grund ihres
defekten NBS1-Gens nur eingeschränkt in der Lage diese DNA-Schäden zu
reparieren. Ursächlich dafür ist die eingeschränkte Funktionsfähigkeit des vom
NBS1-Gen codierten und zur DNA-Reparatur und Zellzykluskontrolle benötigten
Proteins   Nbs1.         Infolgedessen       treten         bei     NBS-Patienten               gehäuft
Chromosomenschäden und maligne Erkrankungen auf. Ziel dieser Arbeit war
es, die Frage zu beantworten, ob die Chromosomenschäden von NBS-
Patienten ein für NBS charakteristisches Muster zeigen.
Methoden: Exemplarisch für die gesamte DNA wurden die Chromosomen 1, 2
und 4 von Lymphozyten eines NBS-Patienten analysiert. Dazu wurden Zellen
unbestrahlt oder nach einer in vitro Bestrahlung mit 0,7 Gy bzw 2,0 Gy im
Mitosestadium mittels Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) angefärbt. Um
abzuschätzen, inwieweit bestrahlte NBS-Lymphozyten noch in der Lage sind,
das für die FISH-Färbung notwendige Mitosestadium zu erreichen, ging der
FISH-Färbung eine Mitoseindexbestimmung voraus. Unter dem Mikroskop
gefundene schadhafte Chromosomen wurden fotografiert und mit einem
Bildanalyseprogramm vermessen.
Ergebnisse und Beobachtungen: Der Vergleich der NBS-Gruppe mit den
Kontrollgruppen zeigte Unterschiede in drei verschiedenen Aspekten: Erstens
überstieg die Anzahl der Chromosomenschäden bei Lymphozyten der NBS-
Gruppe die in den Kontrollgruppen. Darüber hinaus waren im Gegensatz zu
den   Kontrollgruppen         Chromosomenbrüche               in     der      NBS-Gruppe           der
zweithäufigste Aberrationstyp nach den Translokationen. Schließlich zeigten
sich auch im Bezug auf die Lokalisation der Aberrationen entlang der
Chromosomen             charakteristische         Unterschiede.              Der       Anteil      der
Chromosomenaberrationen in den p-telomer-proximalen Abschnitten und in den
p-Armen    war     in     NBS-Lymphozyten           wesentlich        geringer        als   in     den
Kontrollgruppen.         Dahingegen         war       die         relative         Häufigkeit      der
Chromosomenaberrationen im Zentromerbereich von NBS-Lymphozyten mit 20
bis 30% drei bis fünfmal höher als in den Kontrollgruppen. Im q-Armbereich gab
2

es   chromosomenspezifische      Unterschiede,    da    in   NBS-Lymphozyten
Aberrationen im zentralen Bereich des q-Arms von Chromosom 4 nur etwa halb
so häufig vorkamen wie in den Kontrollgruppen. Auf den q-telomer-proximalen
Bereich von Chromosom 2 der NBS-Lymphozyten dagegen entfiel ein circa
dreimal so großer Anteil an Aberrationen wie in den Kontrollgruppen.
Praktische Schlussfolgerungen: An Hand dieser in der vorliegenden Arbeit
gefundenen charakteristischen Unterschiede in den Chromosomenaberrationen
zwischen NBS-Lymphozyten und den Lymphozyten der Kontrollgruppen sollte
in Zukunft eine verbesserte Identifikation von NBS-Patienten möglich sein.
3

Abstract

Background and aims: Every somatic cell is continuously threatened by
environmentally induced DNA damage. For example the DNA damage may be
caused by radiation. This damage can pose an existential danger to the cells.
Cells of Nijmegen Breakage Syndrome patients have a limited capability to
repair DNA damage due to their defective NBS1 gene. The protein encoded by
the NBS1 gene, also called Nbs1, is important for DNA repair and cell cycle
control. However its function is reduced in NBS patients. Consequently, NBS
patients more frequently suffer from chromosomal instability and cancer.
Methods: The aim of this study was to examine whether the DNA of NBS
patients is damaged in a pattern that is characteristic for NBS. Chromosomes 1,
2 and 4 from lymphocytes of an NBS patient were selected as representative of
the entire genome and analyzed in this study. Non-irradiated lymphocytes and
lymphocytes irradiated in vitro with either 0,7 Gy or 2,0 Gy were stained with
triple-color FISH. To estimate whether NBS lymphocytes are still able to
undergo mitosis as required for analysis by FISH, the mitosis index was
determined before performing the FISH staining. Chromosomes were analyzed
by fluorescence microscopy. Damaged chromosomes were photographed, the
type of aberrations was determined and their localization measured using
image analysis software.
Results and observations: Comparing the NBS group with controls, three
main differences were found: Firstly, the number of chromosomal aberrations
was higher in NBS lymphocytes than in control lymphocytes. Secondly, while
translocations were the most frequent type of aberration in both NBS and
control groups, chromosomal breaks were the second most frequent type in the
NBS group as opposed to dicentric chromosomes in the control groups. Finally,
characteristic differences were found regarding the localization of aberrations
along the chromosomes. The number of chromosomal aberrations in the p
telomere-proximal region and in the p arms was markedly lower in the NBS
group than in the control groups. On the other hand, the relative frequency of
chromosomal aberrations located within the centromere region was three to five
times higher in NBS lymphocytes than in control lymphocytes. Within the q arm
region, chromosome-specific differences were observed: Aberrations in the
central part of the q arm of chromosome 4 occurred only about half as often in
4

NBS lymphocytes as in the control group. However, aberrations in the q
telomere-proximal part of chromosome 2 were found about three times as often
in NBS as among the control groups.
Practical conclusions: The characteristic differences between chromosomal
aberrations of NBS and control lymphocytes that were found in this study
should enable us to more easily identify NBS patients in the future.
5

1. Einleitung

1.1. Historie zum Nijmegen Breakage Syndrome
Das Nijmegen Breakage Syndrom (NBS, OMIM 251260) ist eine seltene
autosomal-rezessive Krankheit, die wie auch das Bloom-Syndrom, die Ataxia
Teleangiectasia (AT), die Fanconi-Anämie und die Xeroderma Pigmentosum
der Gruppe der chromosomalen Instabilitätssyndrome zugeordnet wird (Hiel et
al., 2000). Cirka 200 Patienten sind weltweit bekannt, wovon die Mehrzahl in
Osteuropa ansässig ist (Tauchi et al., 2002b, Czornak et al., 2008). Weemaes
et al. berichteten erstmalig 1981 von diesem Krankheitsbild (Weemaes et al.,
1981). NBS Patienten zeigen eine Reihe typischer Symptome, wie z.B. erhöhte
Strahlensensibilität, Mikrozephalie, häufig mentale Retardierung, Minderwuchs,
Immundefizite und eine erhöhte Prädisposition für maligne Erkrankungen. Auf
Grund dieser zum Teil mit AT überlappenden Symptome wurde NBS lange als
eine Variante von AT angesehen (Jaspers et al., 1988, Wegner et al., 1988).

1.2. Das NBS1-Gen
Der Ort des krankheitsverursachenden Genschadens beim NBS wurde 1997
auf ein 1 cM (Centi-Morgan) großes Intervall des Chromosoms 8q21
eingegrenzt (Saar et al., 1997), wohingegen die genetische Ursache der AT auf
Chromosom 11q22-23 zu suchen ist (Savitsky et al., 1995). Somit war NBS als
eigenständige Krankheit abgegrenzt. Ein Jahr später veröffentlichten Varon et
al. die Erkenntnis, dass ein Defekt im NBS1-Gen für die Entstehung des
Nijmegen Breakage Syndroms verantwortlich ist (Varon et al., 1998). Das
NBS1-Gen besteht aus 16 Exons und codiert für das Protein Nbs1 (auch Nibrin
oder p95 genannt). Über 90% der NBS-Patienten sind homozygot für die
Gründermutation 657del5 im Exon 6. Diese Deletion von 5 Basenpaaren, die
bevorzugt bei Patienten slawischer Abstammung anzutreffen ist (Maurer, 2007)
verursacht eine Leserasterverschiebung, in deren Folge die Biosynthese von
Nbs1 verfrüht abgebrochen wird.

1.3. Proteinstruktur von Nbs1
Bei intakter Proteinbiosynthese besteht Nbs1 aus 754 Aminosäuren (AS) und
hat ein molekulares Gewicht von 85 kDa. Drei funktionelle Regionen des Nbs1
werden unterschieden: Im N-terminalen Abschnitt befinden sich die forkhead-
6

associated (FHA) (AS 24-108) und die breast cancer carboxy-terminal (BRCT)
Domänen (AS 108-196). Beide Domänen werden für die Akkumulierung von
Nbs1 und seiner angelagerten Proteinen in den irradiation-induced foci (IRIF)
benötigt (Cerosaletti und Concannon, 2003). Im mittleren Abschnitt (AS 278-
343) liegen zwei Serinmoleküle, die beispielsweise in Folge von ionisierender
Bestrahlung phosphoryliert werden können, um den intra S-Phasencheckpoint
regulieren (Lim et al., 2000, Zhao et al., 2000). Im C-terminalen Abschnitt (AS
665-693) liegen die hMre11-bindende Domäne, drei „nuclear localization
signals (NLS)“ (Tauchi et al., 2002b) sowie eine ATM-Bindungsdomäne zur
ATM-Aktivierung (You et al., 2005, Cerosaletti et al., 2006).

1.4. Zelluläre Aufgaben des Nbs1-Proteins
Nbs1 nimmt in der Zelle vielfältige Aufgaben wahr. Es wirkt beim Erkennen,
Anzeigen und Beseitigen von DNA-Doppelstrangbrüchen (DSB) mit, ist aber
auch an der Zellzykluskontrolle beteiligt, trägt zum Erhalt der Telomerstabilität
bei und spielt eine Rolle bei der DNA-Replikation (Tauchi et al., 2002b). Um die
DSBs im Zellkern zu erkennen, muss Nbs1 zunächst im Zytoplasma mit dem
hMre11/hRad50-Komplex eine Verbindung eingehen (Carney et al., 1998). Der
Transfer des funktionstüchtigen Nbs1/hMre11/hRad50 (N/M/R) Komplexes in
den Zellkern erfolgt mit Hilfe der NLS im C-Terminus von Nbs1 (Tauchi et al.,
2002b). Nbs1 als Teil des N/M/R-Komplexes bindet im Zellkern entweder direkt
(Kobayashi et al., 2002) oder indirekt über den mediator of DNA damage
checkpoint 1 (MDC1) (Lukas et al., 2004, Stucki et al., 2005) an phosphorylierte
H2AX Histone (γ-H2AX) und zeigt so den nachgeschalteten Reparatur-
Proteinen den DNA-Schaden an. Tauchi et al. schlagen außerdem eine
anschließende Bindung des N/M/R-Komplexes an die DNA über hMre11 als
Teil eines zweistufigen Prozesses vor, in dem der N/M/R-Komplex auch
während der Reparatur des DSB beteiligt ist (Tauchi et al., 2002b).
Nach der Detektion eines DSB durch den N/M/R-Komplex und der Bindung an
γ-H2AX oder MDC1 folgt die Rekrutierung von ATM zur Schadensstelle. Es
kommt zu einer intensiven Interaktion zwischen ATM und dem N/M/R-Komplex
(Difilippantonio und Nussenzweig, 2007), in deren Verlauf das zunächst inaktive
ATM Dimer durch die Bindung an die entsprechende ATM-Bindungsstelle des
Nbs1 in zwei aktive ATM-Monomere überführt wird (Cerosaletti et al., 2006).
7

Nach einer Schädigung der DNA durch exogene Noxen wie ionisierende
Strahlung oder Chemotherapeutika, aber auch durch endogene Noxen wie freie
Radikale reicht eine geringe Anzahl von DSBs aus, um einen zweiten
möglichen Weg zur ATM-Aktivierung zu beschreiten: Die Autophosphorylierung
von ATM (Bakkenist und Kastan, 2003, Buscemi et al., 2004). Das aktivierte
ATM interagiert im Rahmen der anschließenden DNA-Reparaturprozesse der
Zelle mit 700 weiteren Proteinen (Matsuoka et al., 2007), wodurch die
Bedeutung der Nbs1 abhängigen ATM-Aktivierung klar wird.
Zur Reparatur von chromosomalen Schäden stehen der eukaryotischen Zelle
prinzipiell zwei unterschiedliche Verfahren zur Verfügung, die je nach den
strukturellen Eigenschaften des DSBs und des zellulären Zustands ausgewählt
werden (Iijima et al., 2008): Das Non-homologous end joining (NHEJ) und die
Homologous recombination (HR)-Reparatur. Das NHEJ wird zur schnellen
Reparatur während aller Phasen des Zellzykluses benutzt. Ein Verlust von
Basenpaaren ist dabei möglich, wenn bei diesem Verfahren die DNA-
Abschnitte zu beiden Seiten des DSBs mit Nukleasen bearbeitet werden, bevor
sie zusammengefügt werden. An diesem raschen Verfahren sind Proteine wie
Ku70/80, DNA-PK oder der XRCC4/DNA Ligase IV-Komplex beteiligt. Die HR-
Reparatur ist langwieriger und kann innerhalb des Zellzyklus nur während der
späten S-Phase und der G2-Phase angewandt werden, weil der entsprechende
intakte DNA-Abschnitt der Schwesterchromatide bei der Reparatur des
unterbrochenen DNA-Stranges als Matrize dient (Iijima et al., 2008). Da bei
diesem Reparaturverfahren eine Vorlage zur Verfügung steht, kann es ohne
Verlust oder Vertauschen von Basenpaaren durchgeführt werden. Nbs1 spielt
in beiden Verfahren eine Rolle, wobei es aber im Gegensatz zum NHEJ bei der
HR-Reparatur unverzichtbar ist, da es die Positionierung des Proteins hMre11
an die Stelle des DNA-Schadens ermöglicht (Tauchi et al., 2002a, Tauchi et al.,
2002b, Sakamoto et al., 2007, Iijima et al., 2008).
Angesichts der zentralen Rolle des N/M/R-Komplexes für die DNA-Reparatur
und die ATM-abhängigen Prozesse der Zelle wird deutlich, wie essentiell ein
funktionierender N/M/R-Komplex für eine nachhaltige Zellgesundheit ist. Beim
Nijmegen Breakage Syndrom jedoch ist der Nbs1-Bestandteil des N/M/R-
Komplexes fehlerhaft, sodass die durch Noxen- wie beispielsweise ionisierende
Strahlung bei der Stahlentherapie- verursachten Chromosomenschäden nicht in
adäquater Weise behoben werden können.
8

1.5. Molekulare Ursachen für NBS
Der häufigsten Ursache für das NBS - der NBS1del657 Mutation liegt die
Tatsache zu Grunde, dass zum einen durch einen vorzeitigen Abbruch der
Nbs1-Biosynthese ein N-terminales Fragment von 26kDa (Nbs1p26) entsteht
und zum anderen wegen eines internen Translationsstarts auf dem Nbs1-Gen
ein C-terminales Fragment von ca. 70kDa (Nbs1p70) hergestellt wird (Maser et
al., 2001). In Folge der Expression zweier Nbs1-Fragmente, werden die FHA
und BRCT-Domänen im N-terminalen Abschnitt von den funktionalen Domänen
im C-terminalen Abschnitt getrennt. Dies führt zur beeinträchtigten Interaktion
des Nbs1p70 mit Mdc1 bzw. zum Verlust der stabilen Verbindung zwischen
dem N/M/R-Komplex und dem mit γ-H2AX modifizierten Chromatin. Der N/M/R-
Komplex kann daher nur noch eingeschränkt seiner Aufgabe nachkommen, die
Positionen von Chromosomenschäden anzuzeigen und die DNA-Reparatur in
die Wege zu leiten (Lukas et al., 2004). Die trotz reduzierter Zellfunktionen
erhaltene Überlebensfähigkeit von NBS-Patienten beruht auf der verbliebenen
hMre11-Bindungsdomäne des Nbs1p70 Proteins, womit das hMre11 an den
N/M/R-Komplex gebunden und somit im Zellkern gehalten werden kann. Im
Tiermodell erwies sich ein NBS1-Null-Phänotyp als mit dem Leben nicht
vereinbar (Maser et al., 2001, Zhu et al., 2001).
Es wird angenommen, dass ein Teil des Phänotyps von NBS-Patienten auf den
Funktionsverlust des N-terminalen Nbs1p70 zurückzuführen ist, da im
Tierversuch Zellen mit einem Schaden im Bereich der FHA-Domäne des Nbs1
die gleichen Symptome aufweisen wie hNBS1 657del5 Mäuse: Fehlerhafte T-
Zellen, Defekte im G2/M- bzw. intra-S Phasen Checkpoint-Arrest und
suboptimale     Phosphorylierung     von   ATM-Substraten     (Difilippantonio   und
Nussenzweig, 2007). Durch die mangelnde Anzeige und Reparatur von DSBs
einerseits     sowie    den    defekten    intra-S-Phasen-Checkpoint     und     die
eingeschränkte Funktionsfähigkeit des Nbs1p70-Mre11-Komplex andererseits
wird die DNA-Replikation auch im Falle eines Chromosomenschadens
fortgeführt,   sodass    die      DNA-Defekte   sich   auch    in   nachfolgenden
Zellgenerationen manifestieren. Diese „radio-resistant DNA synthesis“ (RDS) ist
ein wesentliches Kennzeichen von NBS und könnte eine Erklärung für die in
NBS-Patienten beobachtete Tumoranfälligkeit liefern (Lim et al., 2000, Zhao et
al., 2000, Maser et al., 2001).
9

Klinisch relevant sind diese aufgezählten Aspekte vor allem für die Bestrahlung
von     NBS-Patienten,           da    danach           auf   Grund        von      nicht     adäquat
Reparaturmechanismen vermehrt Chromosomenbrüche in den Tochterzellen
erhalten bleiben und somit die iatrogen bedingt Tumorentwickelung begünstigt
wird sowie schwerste Nebenwirkungen zu erwarten sind.

1.6. Relevanz für die Tumortherapie
Im Rahmen der Tumortherapie bestrahlt man Patienten und induziert damit
Chromosomenbrüche. Im Bezug auf die Strahlenempfindlichkeit gibt es eine
große intraindividuelle Streubreite (Burnet et al., 1998, Vineis, 2004), wobei
NBS-Patienten         aus        den   oben        beschriebenen          Gründen         eine        hohe
Strahlenempfindlichkeit aufweisen. Wünschenswert wäre bei der Behandlung
eine optimal an die jeweilige Strahlenempfindlichkeit angepasste Strahlendosis
applizieren     zu         können,        um       dadurch      Patienten           vor     unnötigen
Strahlennebenwirkungen zu bewahren. Dazu sind jedoch eine individuelle
Bestimmung der Strahlenempfindlichkeit und ein Erkennen von Patienten mit
einer erhöhten Strahlenempfindlichkeit im Voraus notwendig.
Ein     möglicher       Marker         für        die     Strahlenempfindlichkeit            ist       das
Chromosomenbruchverhalten.                 Im      Hinblick    darauf       wurde     bereits         eine
Untersuchung         des     Chromosomenbruchverhaltens                    durchgeführt,         in    der
retrospektiv         Lymphozyten           von          Patienten     mit        einer       erhöhten
Strahlenempfindlichkeit Lymphozyten gesunder Probanden gegenübergestellt
wurden (Schilling et al., 2006). Es zeigte sich, dass die absolute Anzahl an
Bruchereignissen für die betrachteten Chromosomen 1, 2 und 4 in der Gruppen
der erhöht strahlensensiblen Patienten jeweils größer war als in der gesunden
Kontrollgruppe. Auch bei der Bruchpunktlokalisation gab es Auffälligkeiten im
Vergleich      zur     gesunden           Negativkontrolle:         Die     Schäden         bei       den
strahlensensiblen Patienten häuften sich im Bereich des q-Arms.

1.7. Ziel der Arbeit
Ziel dieser Arbeit ist es die Frage zu klären, ob eine Häufung der Bruchstellen in
einem    bestimmten          Bereich       des      Chromosoms            mit   Defekten         in    der
Reparaturfähigkeit         der    Zelle      im    Zusammenhang            steht.    Dafür       werden
Lymphozyten eines Patienten verwendet, der am Nijmegen Breakage Syndrom
erkrankt ist. Charakteristisch für dieses Chromosomeninstabilitätssyndrom ist,
10

dass das Nbs1-Protein mit seiner zentralen Rolle für das Erkennen von DSBs
und für die Zellzykluskontrolle auf Grund einer Mutation im NBS1-Gen nicht
mehr vollständig funktionstüchtig ist. Ein möglicher Einfluss des defekten Nbs1
Proteins auf die Bruchstellenverteilung der Chromosomen 1, 2 und 4 soll
analysiert werden.
11

2. Material und Methoden

2.1. Untersuchungsmaterial
Für die vorliegende Arbeit wurden lymphoblastoide Zelllinien eines Patienten
mit Nijmegen Breakage Syndrome (P122) verwendet. Um die Ergebnisse
besser vergleichen zu können, wurden darüber hinaus auch Zellen von
Patienten mit erhöhter Strahlensensibilität (im weiteren Verlauf Strahlensensible
genannt) und Zellen von Patienten mit einer Tumorerkrankung (Tox 1-2)
benutzt.    Die       Strahlensensiblen   wurden    retrospektiv     untersucht.   Als
Kontrollkollektiv (im Folgenden Kontrolle genannt) wurden gesunde Zellen für
diese Arbeit herangezogen. Die Zellen wurden in vitro mit 0,7 Gy oder 2 Gy
bestrahlt, wobei von jeder Population eine Kontrollprobe unbestrahlt blieb. Nach
der Präparation wurden die Chromosomen der Zelllinien mittels Fluoreszenz in
situ Hybridisierung (FISH) angefärbt, wie von Keller et al. 2004 beschrieben
(Keller et al., 2004). 2002 haben Neubauer et al. dargelegt, dass FISH geeignet
ist, Chromosomenschäden bei lymphoblastoiden Zellen von NBS-Patienten
nachzuweisen (Neubauer et al., 2002).

2.2.   Fluoreszenz in situ Hybridisierung
Seit Ende der 60iger Jahre des letzten Jahrhunderts ist es möglich, DNA in situ
nachzuweisen (Gall und Pardue, 1969, John et al., 1969). Damals wurden zur
Darstellung der DNA radioaktiv markierte Sonden verwendet. In der
vorliegenden          Arbeit     wurden     zur     Chromosomenabbildung           mit
Fluoreszenzfarbstoffen markierte Sonden verwendet. Von der unterschiedlichen
Art der Sondenmarkierung abgesehen hat sich am Grundprinzip der in situ
Hybridisierung seit 1969 nichts verändert. Daher trägt das hier benutzte
Verfahren die Bezeichnung Fluoreszenz in situ Hybridisierung und wurde 1986
von Pinkel et al. Beschrieben (Pinkel et al., 1986): Durch eine geeignete
Vorbereitung erreicht man, dass die Zellen bzw. die Gewebe für die
anschließenden Arbeitsschritte optimal vorbereitet sind und nachfolgend auf
dem Objektträger gut auswertbar vorliegen. Die Doppelstrang-DNA des
Materials      wird            durch   Hitzeeinwirkung    denaturiert,     d.h.    die
Wasserstoffbrückenbindungen            zwischen    den   zwei      Strängen   werden
aufgebrochen. An die beiden entstandenen DNA-Einzelstränge lagern sich die
12

(für die jeweiligen Chromosomen spezifischen) DNA-Sonden an. Das
entstandene Gebilde aus natürlichem DNA- und synthetischen DNA-Abschnitt
wird als Hybrid bezeichnet (Pschyrembel, 2002). Diese DNA-Sonden tragen ein
Antigen auf ihrer Oberfläche, an dem dann ein mit Fluoreszenzfarbstoff
markierten Antikörper binden kann. Dieser Prozess wird als Detektion
bezeichnet und führt mit einem entsprechenden Mikroskop betrachtet zu grün
leuchtenden Chromosomen. Für diesen Effekt ist der Fluoreszenzfarbstoff FITC
verantwortlich. Durch die Amplifikation mit Rhodamin erscheinen die passenden
Chromosomen      unter    dem    Fluoreszenzmikroskop     in    roter     Färbung.
Abschließend werden die Chromosomen noch mit DAPI gegengefärbt, wodurch
sie durch geeignete Filter betrachtet blau erscheinen.

2.2.1. Präparation/Auftropfen
Die Zellkulturen wurden entweder mit 0 Gy, 0,7 Gy oder aber mit 2 Gy bestrahlt
und anschließend bei 37°C für 48 h inkubiert. 3,5 Stunden vor der Präparation
wurde Colcemid (Gebrauchslösung 5 µg/ml) in die Zellkultur gegeben, um die
Mitosen in der Metaphase zu stoppen und so eine gesteigerte Anzahl an
kondensierten und damit sichtbaren Chromosomen zu erhalten. Zur Gewinnung
von Zellmaterial wurde die Zellsuspension in Röhrchen überführt und für 8
Minuten bei 1000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde bis auf 0,5 cm über
dem Sediment abgesaugt, wobei der Bodensatz auf dem Rüttler anschließend
wieder resuspendiert wurde. Danach wurden 20 Tropfen einer 0,56%igen KCl-
Lösung auf dem Rüttler hinzugegeben und bis auf Ständerhöhe aufgefüllt. Die
Kulturen wurden für 20 Minuten im Brutschrank (37°C, 5% CO2) inkubiert.
Die hypotone KCl-Lösung bewirkt ein Anschwellen der Zellen, wodurch die
Entwirrung und spätere Spreitung der Chromosomen erleichtert wird (Leitch et
al., 1994). Durch langsame Zugabe von 0,6 ml frischer Fixierlösung erfolgt die
Konservierung der Zellstrukturen. Proteine fällen aus und der DNA-Abbau wird
unterbrochen.
Die Röhrchen wurden mit einem Parafilm verschlossen, der Inhalt durchmischt
und dann 8 Minuten lang bei 1000 U/min zentrifugiert. Der Überstand in den
Röhrchen wurde abgesaugt und das Sediment auf dem Rüttler resuspendiert.
Unter Rütteln wurden langsam 20 Tropfen Fixierlösung hinzugegeben und
anschließend    soviel   Fixierlösung   in   die   Röhrchen    gefüllt,   bis   der
Flüssigkeitsspiegel auf Ständerhöhe lag. Die Röhrchen wurden 30 min bei 4°C
13

inkubiert und danach zentrifugiert (1000 U/min 8 min). Der Überstand wurde
entfernt, das Sediment resuspendiert und 4-5 ml Fixierlösung zugesetzt. Nach
dreimaligem Zentrifugieren, Absaugen des Überstands und Resuspendieren mit
Fixierlösung   wurde   solange Fixierlösung zugesetzt,    bis   eine   milchige
Suspension entstand. 3-4 Tropfen der Suspension wurden aus wenigen
Zentimetern Höhe auf einen feuchten Objektträger fallen gelassen und durch
Schwenken getrocknet. Die Objektträger wurden anschließend unter dem
Mikroskop auf die Dichte der Zellen in der Metaphase untersucht. Objektträger
mit einer relativ hohen Dichte an Zellen in der Metaphase und einer
ausreichenden Spreitung der Chromosomen wurden für das weitere Verfahren
und die Analyse verwendet. Zur Vorbereitung der Zellen auf die nächsten
Schritte der in situ-Hybridisierung wurden die Präparate für mindestens 24
Stunden in -20°C kaltem Ethanol gelagert (optimal 2-3 Tage).

2.2.2. Fixierung/Vorbereitung
Für die weiteren Arbeitsschritte wurden abgetrocknete Objektträger verwendet.
Diese wurden 5 min in 1xPBS-Lösung bei Raumtemperatur auf dem Rüttler
belassen und anschließend je 5 Minuten in 70%, 90% und 100% Ethanol auf
dem Schüttler dehydriert, um ein Verdünnen der Sonden bei nachfolgenden
Prozessen zu verhindern (Leitch et al., 1994). Da die Sonden nur mit DNA-
Sequenzen der Zellen interagieren sollen, wurde die RNA des Zytoplasmas und
des Zellkerns durch RNase abgebaut: 100 µl RNase-Lösung wurden auf jeden
Objektträger pipettiert und mit einem Deckglas luftblasenfrei abgedeckt. Nach
der Inkubation im Wasserbad (30 min, 37°C) wurde am Mikroskop kontrolliert,
ob die Menge an RNase ausreichend war. Dreimal wurden die Objektträger
unter Rütteln in 2xSSC-Lösung je 5 min lang gewaschen. Für den vierten
Waschgang wurde 1xPBS-Lösung verwendet. Die Objektträger wurden 10 min
mit frischer, 37°C warmer Pepsinlösung behandelt, um an die DNA angelagerte
Proteine abzubauen, und damit den Sonden einen leichteren Zugang zu
ermöglichen. Das Ergebnis wurde mikroskopisch kontrolliert. Zum Stoppen der
Pepsinwirkung wurden die Objektträger 5 min bei Raumtemperatur auf dem
Schüttler in 1xPBS-Lösung mit MgCl2 inkubiert. Die Nachfixierung erfolgte
für 10 Minuten in 1xPBS-Lösung mit MgCl2 und Formaldehyd unter dem Abzug,
das anschließende Waschen in 1xPBS-Lösung auf dem Schüttler (5 min). Zum
Entwässern der Präparate wurden sie je 5 Minuten bei Raumtemperatur auf
14

dem Schüttler in 70%, 90% und 100% Ethanol gegeben. Aufbewahrt wurden
die Objektträger trocken oder bei -20°C, wenn sie länger als 2 Wochen nicht
weiter verarbeitet wurden.

2.2.3. Denaturierung/Prähybridisierung
Bevor die Chromosomen der Zellen hybridisiert werden können, müssen die
DNA-Sonden (T. Liehr, Humangenetik Jena) vorbehandelt werden: Zum
Sondenmix     werden    Dextransulfat    und    COT    (eingedampft)       gegeben.
Dextransulfat erhöht durch Volumeneinengung die Probenkonzentration (Wahl
et al., 1979, Harper et al., 1981), und beschleunigt damit die Hybridisierung um
den Faktor 100, ohne jedoch das Signal zu Hintergrundverhältnis nachteilig zu
beeinflussen. Die Zugabe von COT-1 DNA sättigt hochrepetitive DNA-
Abschnitte im Bereich der Zentromere ab (Landegent et al., 1987). Ohne diesen
Schritt würden die hochrepetitiven DNA-Sequenzen mit ihrer im Vergleich zur
normalen DNA-Sequenz unterschiedlichen Hybridisierungskinetik nach der
FISH ein sehr starkes Fluoreszenzsignal erzeugen, was die Bildqualität bzw.
die Bildverarbeitung stark beeinträchtigen würde (Lichter et al., 1988).
Die Sonden wurden zum Denaturieren für 5 Minuten in ein 75°C warmes
Wasserbad gegeben, danach für weitere 35 Minuten in ein 37°C warmes
Wasserbad. Bis zum Hybridisieren der Präparate wurden die DNA-Sonden auf
Eis gelagert. Jeder Objektträger wurde in je 100 µl Denaturierungslösung unter
einem Deckglas für 110 Sekunden im Wasserbad (72°C) unter dem Abzug
inkubiert, um die DNA zu denaturieren. In der Denaturierungslösung ist unter
anderem Formamid, das die Schmelztemperatur der DNA absenkt und so das
genetische Material schont. Der Prozess wurde durch Inkubation der
Objektträger je 5 Minuten in 70, 90 und 100% Alkohol (eiskalt) beendet. Nach
dem Trocknen wurden sie für die Hybridisierung vorbereitet.

2.2.4. Hybridisierung
Dreimal 3,3 µl der Sonde wurden auf jeden Objektträger (Maße 24x24 mm)
appliziert und das Deckglas mit Fixogum versiegelt. Über 2 Tage hinweg
wurden die Objektträger im Brutschrank (37°C) inkubiert, um anschließend in
2xSSC-Lösung gestellt zu werden. Das weitere Posthybridisierungswashing
erfolgte in FA/4xSSC-Lösung (45°C) auf dem Schüttler für 5 min unter dem
Abzug bei Raumtemperatur und wurde dreimal wiederholt. Ebenfalls dreimal
15

wurden die Präparate 5 min lang bei Raumtemperatur auf dem Schüttler in
0,1xSSC-Lösung (60°C) gewaschen.
Durch das Postwashing wird hauptsächlich unspezifisch gebundene DNA
entfernt und so das Intensitätsverhältnis Signal/Hintergrund zu Gunsten des
Signals verschoben (Göhlert, 2002).

2.2.5. Detektion
Vor der eigentlichen Detektion wurden die Objektträger für kurze Zeit in
4xSSC/Tween-Lösung          gelegt.   Um      die   unspezifischen   Antikörper-
Bindungsstellen abzublocken wurde jedes Präparat mit 100 µl 5% BSA-Lösung
überschichtet, mit einem Deckglas luftblasenfrei abgedeckt und für 20-30 min
im Wasserbad (37°C) inkubiert. Abermals wurden die Objektträger kurz mit
4xSSC/Tween-Lösung gespült. Danach wurden pro Objektträger 100 µl FITC-
Lösung (1:500 in 5% BSA) aufgetragen und mit einem Deckglas luftblasenfrei
abgedeckt. Für 60 min wurden die Präparate im Wasserbad (37°C) inkubiert.
Zum Spülen wurden sie dreimal für je 5 min unter Rütteln in 37°C warme
4xSSC/Tween-Lösung gegeben.

2.2.6. Amplifikation
Zur Amplifikation wurden 100 µl der Antiavidin 1:100/Rhodamin 1:35-Lösung
auf jeden Objektträger gegeben und mit einem Deckglas luftblasenfrei
abgedeckt. Die Inkubation erfolgte für 1,5-2 h im 37°C warmen Wasserbad.
Gespült wurden die Objektträger dreimal 5 min in 37°C warmer 4xSSC/Tween-
Lösung auf dem Schüttler. Anschließend wurde 100 µl FITC-Lösung auf jedes
Präparat pipettiert. Die Präparate wurden anschließend mit einem Deckglas
luftblasenfrei abgedeckt für 30 min bei 37°C im Wasserbad inkubiert. Durch
dreimal 3 min auf dem Schüttler in 37°C warmer 4xSSC/Tween-Lösung wurden
die Objektträger gespült.

2.2.7. Gegenfärbung
Nach dem Abtrocknen wurden die Präparate mit jeweils 50 µl DAPI-
Gebrauchslösung überschichtet und 5 min im Dunkeln aufbewahrt. Nach dem
Spülen mit Aqua bidest und Trocknen wurden die Objektträger mit jeweils 20 µl
Vectashield®    eingedeckt.     Dieses     Antifading-Reagenz   verhindert   das
16

Ausbleichen der Präparate und intensiviert die Fluoreszenz (Longin et al.,
1993).

2.3. Auswertung
Die Auswertung der Objektträger erfolgte an einem Zeiss Axioplan Mikroskop,
ausgestattet mit Filtersätzen für DAPI-, FITC- und Rhodamin-Fluoreszenz und
einer CCD-Kamera (Hitachi, HV-C20A, bzw. UI-2240 C, Imaging Development
Systems GmbH). Die Bildverarbeitung erfolgte mit Hilfe der Software Biomas
(Erlangen, Germany) und die Datenerfassung mittels Microsoft Excel 2003
(Redmond, WA 98052, USA).

2.3.1. Kriterien zur Bruchstellenanalyse
Zur Vermessung der Chromosomen in der Metaphase wurden folgende
Kriterien angelegt: Alle sechs zu untersuchenden mit FISH gefärbten
Chromosomen      müssen    vorhanden         sein,   sie   müssen   den   gleichen
Kondensationsgrad haben, sie dürfen nicht zu dicht oder übereinander liegen,
sie dürfen keine starken Krümmungen aufweisen und es dürfen keine
komplexen Aberrationen vorliegen (d.h. mehr als zwei Brüchstücke pro
homologem Chromosomenpaar). Ausgewertet wurden nur Aberrationen, die
sich eindeutig in die Kategorien Translokation, dizentrisches Chromosom,
Bruch oder Deletion einordnen ließen.

2.3.2. Bildverarbeitung
Jede in Frage kommende aberrante Metaphase wurde zweimal mit der CCD-
Kamera fotografiert. Die erste Aufnahme wurde mit dem DAPI/FITC/Rhodamin-
Filtersatz, die zweite mit dem DAPI-Filtersatz angefertigt. Beide Fotos wurden
zur weiteren Bildverarbeitung automatisch an das Programm Biomas überführt.
Auf dem ersten Bild stellten sich die beiden Chromosomen 1 rot, die beiden
Chromosomen 2 grün und die beiden Chromosomen 4 gelb dar. Die übrigen
Chromosomen erschienen auf Grund der DAPI-Gegenfärbung blau. Dieses Bild
diente zur Vorbereitung der eigentlichen Vermessung, indem darauf die sechs
gefärbten Chromosomen und ihre Bruchstücke identifiziert wurden, sowie der
jeweilige Aberrationstyp bestimmt wurde. Dazu wurden auf der Abbildung die
entsprechenden Strukturen mittels Curser markiert und anschließend auf die
mit dem DAPI-Filtersatz angefertigte zweite Aufnahme übertragen. Dort wurden
17

die Chromosomen und ihre Fragmente vermessen, da sie nur dort in
Originallänge erscheinen. Auf dem ersten Bild wäre ein präzises Ausmessen
der jeweiligen Chromosomenlänge nicht möglich: Durch die Verwendung von
DNA-Sonden, die wegen des FISH-Verfahrens mit Fluoreszenzfarbstoffen
markiert sind, werden die Längen der Chromosomen verfälscht wider gegeben.

2.3.3. Datenverarbeitung
Die in Biomas ermittelten Daten wurden automatisch in eine Excel-Tabelle
übertragen. Jedes unbeschädigte Chromosom 1, 2 bzw. 4 wurde in 100 gleiche
große Abschnitte aufgeteilt (Schilling et al., 2006), basierend auf der von
Morton       1991    ermittelten   Chromosomengesamtlänge                  von   2,63
Megabasenpaaren (Mbp), 2,55 Mbp bzw. 2,03 Mbp für die Chromosomen 1, 2
bzw.     4    (Morton,   1991).    Die        Berechnung       der     chromosomalen
Bruchpunktlokalisation erfolgte dann nach folgender Formel:

p repräsentiert hier die Distanz der Bruchstelle vom Telomer des p-Arms und q
steht für die Distanz der Bruchstelle bis zum Telomer des q-Arms.
Die 0% Längenmarke befindet sich hierbei am Telomerende des p-Arms.
Prinzipiell wurde vom intakten Arm bis zur Aberration gemessen, danach
erfolgte die Vermessung des Bruchstücks (siehe auch Abbildung 1 am Beispiel
eines Chromosomenbruchs).
Vor der statistischen Weiterverarbeitung des Datensatzes wurden die
Bruchereignisse     auf den   ersten     und letzten    fünf     Längenprozent    der
Chromosomen         ausgenommen,         da     sie    durch         die   vorhandene
Messungenauigkeit keine verlässlichen Daten liefern würden.
18

                                       p = gemessen vom kurzen Arm (p-
                                       Arm) bis zur Bruchstelle

                                       q= gemessen von der Bruchstelle
                                       bis zum Telomer des q-Arms.

Abbildung 1: Illustration einer Bruchstellenanalyse (nach (Tucker und Senft, 1994)) am Beispiel
eines Bruchs im q-Arm.
19

3. Ergebnisse

3.1. FISH-Analyse
Die     Zellen       der     Nijmegen-Breakage-Syndrom-Patienten                  sind    durch       das
fehlerhafte Nbs1 Protein nicht in der Lage Chromosomenschäden zuverlässig
zu erkennen, eine adäquate Zellzykluskontrolle durchzuführen und die DNA-
Schäden zufriedenstellend zu beheben. An Lymphozyten, die von einem NBS-
Patienten        abstammen,             wird   eine    FISH-Analyse        durchgeführt         und   die
gewonnenen Daten in Tabelle 1 bzw. in den Diagrammen 1a-e zwei anderen
Patientengruppen, sowie einer Kontrollgruppe gegenübergestellt. Ist im
unbestrahlten Zustand die Anzahl der Brüche pro Mitose in der Gruppe P122
noch auf dem Niveau der Vergleichsgruppen, so treten bei Lymphozyten mit
NBS-Abstammung nach einer Bestrahlung mit 0,7 Gy bereits bis zu circa zehn
mal mehr Bruchereignisse pro Mitose als bei den anderen Gruppen auf.
Translokationen und Brüche sind in den Kontrollgruppen bei 0,7 Gy mehr als
1000 mal bzw. rund 500 mal seltener als bei der P122-Gruppe. 2 Gy
verursachen in Lymphozyten von NBS Patienten vier mal mehr Brüche pro
Mitose als in den Vergleichsgruppen. Der Anteil der Translokationen bzw.
Brüche in den Vergleichsgruppen liegt circa 500 mal bzw. circa 250 mal
niedriger als bei der Gruppe der NBS-Lymphozyten.

 0 Gy            N         Anteil         Anteil der        Anteil der   Anteil der      Brüche pro
                           aberranter     Trans-            Dizentri-    Brüche in %     Mitose
                           Mitosen        lokationen        schen in %
                           in %           in %
 P122                      0,041          0,025             0,003        0,015           0,07
 Strahlen-       5         0,06±0,027     0,06±0,030        0,01±0,007   0,010±0,006     0,16±0,073
 sensible
 Tox 1-2         15        0,04±0,042     0,04±0,036        0,01±0,016   0,008±0,009     0,10±0,107
 Kontrolle       12        0,01±0,004     0,01±0,004        0,00±0,002   0,003±0,002     0,03±0,007

 0,7 Gy          N         Anteil         Anteil der        Anteil der   Anteil der      Brüche pro
                           aberranter     Trans-            Dizentri-    Brüche in %     Mitose
                           Mitosen        lokationen        schen in %
                           in %           in %
 P122                      32,25          31,20 (*)         7,75 (*)     4,80 (*)        0,77 (*)
 Strahlen-       5         0,05±0,020     0,05±0,029        0,02±0,014   0,01±0,005      0,14±0,073
 sensible                                 (*)               (*)          (*)             (*)
 Tox 1-2         15        0,04±0,022     0,03±0,030        0,01±0,010   0,01±0,010      0,09±0,054
                                          (*)               (*)          (*)             (*)
 Kontrolle       12        0,04±0,015     0,03±0,010        0,01±0,005   0,02±0,011      0,08±0,028
                                          (*)               (*)          (*)             (*)
20

    2,0 Gy      N   Anteil       Anteil der        Anteil der   Anteil der    Brüche pro
                    aberranter   Trans-            Dizentri-    Brüche in %   Mitose
                    Mitosen      lokationen        schen in %
                    in %         in %
    P122            51,67        49,00 (*)         16,70 (*)    12,70 (*)     1,43 (*)
    Strahlen-   5   0,22±0,034   0,20±0,033 0,08±0,036 0,07±0,021          0,61±0,091
    sensible                     (*)            (*)          (*)           (*)
    Tox 1-2  15    0,18±0,049 0,12±0,045 0,05±0,047 0,06±0,023             0,41±0,151
                                 (*)            (*)          (*)           (*)
 Kontrolle   12    0,17±0,029 0,09±0,037 0,05±0,016 0,05±0,023             0,35±0,059
                                 (*)            (*)          (*)           (*)
Tabelle 1: Vergleich der quantitativen Chromosomenschäden in Zellen eines Nijmegen-
Breakage-Syndrom-Patienten (P122) mit Chromosomenaberrationen bei gesunden Probanden
beziehungsweise Patienten, die an einer erhöhten Strahlenempfindlichkeit oder einer
Tumorerkrankung leiden. Die Daten sind erhoben worden sowohl an unbestrahlten Zellen, als
auch an Zellen nach einer Bestrahlung mit 0,7 Gy bzw. 2 Gy. (*): Diese Daten sind korrigiert
um den physiologischen Anteil an Aberrationen im unbestrahlten Zustand.

a

b
21

c

d

e
Diagramm 1: Graphische Darstellung der Strahlenwirkung auf P122 (jeweils linkes Diagramm
bei a-e), sowie auf die Gruppen Strahlensensible, Tox 1-2 und Kontrolle (zusammengefasst
jeweils auf dem rechten Diagramm a-e). Aufgrund der deutlich höheren Aberrationsrate bei
P122 sind die Ordinaten der Diagramme mit einer anderen Skalierung versehen als die der
Vergleichsgruppe.
(*): Die auftretenden Werte bei der applizierten Strahlendosis von 0,7 Gy bzw. 2 Gy sind
korrigiert um den physiologischen Anteil der Chromosomenaberrationen.
22

3.2. Mitoseindex
Der Mitoseindex dient als Maßstab für den Proliferationsstatus einer
Zellpopulation. Um den Mitoseindex zu ermitteln, wird die Anzahl der Zellen pro
Sichtfeld, die sich in Zustand der Mitose befinden dividiert durch die
Gesamtzahl der Zellen pro Sichtfeld. Der für Zellen eines Nijmegen-Breakage-
Syndrom-Patienten ermittelte Mitoseindex ist abhängig von der applizierten
Strahlendosis. Die einzelnen Werte können der Tabelle 2 und dem Diagramm
2 entnommen werden.

 Mitoseindex
                 P122               Strahlensensible Tox 1-2          Kontrolle
 N               1                  5                15               12
 0 Gy            0.027              0,034±0,033      0,035±0,031      0,029±0,006
 0,7 Gy          0,019              0,025±0,027      0,028±0,028      0,026±0,010
 2,0 Gy          0,008              0,026±0,026      0,019±0,025      0,020±0,009
Tabellen 2: Mitoseindex von P122 Zellen in Gegenüberstellung zu den   Vergleichsgruppen
aufgeschlüsselt nach der Strahlendosis

Diagramm 2: Graphische Darstellung des Mitoseindex von NBS-Patienten und den
verschiedenen Referenzgruppen in Abhängigkeit von der verwendeten Strahlendosis.

3.3. Bruchereignisse P122
Als Grundlage für die deskriptive Auswertung dienen 572 Bruchereignisse in
den Metaphasen von Nijmegen-Breakage-Syndrom Zellen. Der größte Teil der
Aberrationen entfällt davon auf die Kategorie der Translokationen (70%),
gefolgt von den einfachen Brüchen (rund 17,5%) (Tabelle 3). Die unbestrahlten
Chromosomen sind am wenigsten von Aberrationen betroffen. Die Bestrahlung
mit 2 Gy verursacht komplexe und multiple Bruchmuster, sodass sie oft nicht
mehr eindeutig einem bestimmten Chromosom zugeordnet werden können.
23

Demzufolge treten die meisten verwertbaren Strahlenschäden nach der
Applikation von 0,7 Gy auf. Dizentrische Chromosomen stellen zahlenmäßig
die kleinste Gruppe der verschiedenen Aberrationen dar. Wie sich die
jeweiligen Bruchereignisse im Einzelnen auf die Chromosomen in Abhängigkeit
von der applizierten Strahlendosis aufteilen ist der Tabelle 4 zu entnehmen.

 Translokationen                                70,10%
 Brüche                                         17,48%
 Deletionen                                     8,22%
 Dizentrische Chromosomen                       4,20%
 ∑                                             572 Bruchereignisse
Tabelle 3: Prozentuale Aufschlüsselung der verschiedenen strukturellen Aberrationen innerhalb
der untersuchten Zelllinie P122.

                                        P122        P122         P122         P122
                                        gesamt      0 Gy         0,7 Gy       2 Gy
 Chromosom 1       Translokationen      119         1            75           43
                   Dizentrische         7           1            1            5
                   Chromosomen
                   Brüche               36          2            20           14
                   Deletionen           17          5            8            4
                   ∑                    179         9            104          66

 Chromosom 2       Translokationen      177         4            124          49
                   Dizentrische         7           0            5            2
                   Chromosomen
                   Brüche               37          0            21           16
                   Deletionen           18          7            7            4
                   ∑                    239         11           157          71

 Chromosom 4        Translokationen      105         2          55            48
                    Dizentrische         10          0          5             5
                    Chromosomen
                    Brüche               27          0          21            6
                    Deletionen           12          5          5             2
                    ∑                    154         7          86            61
Tabelle 4: Anzahl der Aberrationen und ihre intrachromosomale Verteilung in Abhängigkeit von
der Stahlendosis

In den Diagrammen 3 bis 5 ist jeweils für das Chromosom 1, 2 bzw. 4
aufgeschlüsselt, wie oft sich insgesamt Aberrationen an einer bestimmten
prozentualen Längenmarke des Chromosoms ereignen. Die Abszissen
repräsentieren die Gesamtlänge des jeweiligen Chromosoms aufgeteilt in 100
gleichgroße Einheiten. Das Chromosomenschema unterhalb der Abszisse
dient zur Orientierung auf dem Chromosom und der Pfeil stellt die Position des
Centromers dar. An den Ordinaten wird angetragen, wie oft ein Schaden an
der entsprechenden Stelle auf dem Chromosom auftritt. Auffällig ist eine
Häufung von Bruchereignissen im Bereich der q-Arme.
24

Diagramm 3: Häufigkeit von Aberrationen in Abhängigkeit von der Lokalisation auf Chromosom
1. Das Chromosom wird in 100 gleichgroße Abschnitte aufgeteilt. 1% der
Chromosomengesamtlänge entspricht 2,63 Megabasenpaaren. Der Pfeil symbolisiert die
Position des Centromers.

Diagramm 4: Häufigkeit von Aberrationen in Abhängigkeit von der Lokalisation auf Chromosom
2. Das Chromosom wird in 100 gleichgroße Abschnitte aufgeteilt. 1% der
Chromosomengesamtlänge entspricht 2,55 Megabasenpaaren. Der Pfeil symbolisiert die
Position des Centromers.
25

Diagramm 5: Häufigkeit von Aberrationen in Abhängigkeit von der Lokalisation auf Chromosom
4. Das Chromosom wird in 100 gleichgroße Abschnitte aufgeteilt. 1% der
Chromosomengesamtlänge entspricht 2,03 Megabasenpaaren. Der Pfeil symbolisiert die
Position des Centromers.

Die Präzision der Chromosomenvermessung mit Biomas wird bestimmt, indem
die ermittelte Länge des intakten Chromosoms der Summe der Bruchstücke
des beschädigten Schwesterchromosoms gegenübergestellt wird. Die Länge
des intakten Chromosoms wird als 100% definiert und die prozentuale
Längenabweichung der Aberration an den Abszissen der Diagramme 6a bis 6c
als prozentualer Messfehler dargestellt. An der Ordinate von Diagramm 6a
werden     die    absolute     Anzahl     der    Vermessungsabweichungen             aller
Aberrationstypen kumuliert angetragen (jeweils nach den drei verschiedenen
Chromosomen aufgeschlüsselt). Analog dazu wird bei Diagramm 6b mit den
dizentrischen     Bruchereignissen       und    beim       Diagramm     6c    mit    den
Translokationen verfahren, wobei jedoch hier an den Ordinaten im Gegensatz
zum Diagramm 6a die relative Häufung der Vermessungsabweichungen
angetragen wird. Das Messverfahren mit Biomas kann als zuverlässig
angesehen werden, da von 572 insgesamt vermessenen Bruchereignissen 514
mit einer Abweichung von maximal 5% vermessen wurden. Damit sind 89,9%
der Chromosomen relativ genau vermessenen worden. Ähnliche Ergebnisse
erhält man, wenn man die Werte aufgeschlüsselt nach Dizentrischen oder
Translokationen ansieht: 87,5% der dizentrischen Bruchereignisse wurden mit
einer   Abweichung      von    maximal     5%    erfasst    (21   von   insgesamt      24
Dizentrischen). Bei insgesamt 401 vermessenen Translokationen liegen 358 im
26

Bereich der Messungenauigkeit von maximal 5% (entspricht 89,3% relativ exakt
vermessenen Translokationen).

Diagramm 6a: Absolute Anzahl der Messfehler bei allen aberranten Chromosom 1, 2 und
4. Die jeweiligen Positionen der Säulen an der Abszisse stellen die prozentuale
Längenabweichung der aberranten Chromosomen und ihrer Bruchstücke von den Längen
der intakten Chromosomen dar, welchen definitionsgemäß die Länge 100% zugewiesen
wird.

Diagramm 6b: Relative Häufung der Messfehler bei allen dizentrischen Chromosomen 1,
2 und 4. Die jeweiligen Positionen der Säulen an der Abszisse stellen die prozentuale
Längenabweichung der dizentrischen Chromosomen und ihrer Bruchstücke von den
Längen der intakten Chromosomen dar, welchen definitionsgemäß die Länge 100%
zugewiesen wird.
27

Diagramm 6c: Relative Häufung der Messfehler bei allen Translokationen nach
Chromosom 1, 2 und 4 aufgeschlüsselt. Die jeweiligen Positionen der Säulen an der
Abszisse stellen die prozentuale Längenabweichung der Translokationen und ihrer
Bruchstücke von den Längen der intakten Chromosomen dar, welchen definitionsgemäß
die Länge 100% zugewiesen wird.

Auf    Grund     der     Messungenauigkeit,       die    durch     Benutzung        von
fluoreszenzmarkierten Antikörpern im Rahmen der FISH herrührt und die
tatsächliche Chromosomen- bzw. Bruchstücklänge verfälschen kann, werden
die Bruchereignisse im Bereich der Telomere (also den ersten und letzten fünf
Längenprozent) aus der Wertung genommen. Dadurch reduziert sich die
Anzahl der verwertbaren Aberrationen auf 563 und bilden so die Grundlage für
Tabelle 5 und Diagramm 7 (bei Chromosom 1 können alle Bruchpunkte
gewertet werden, bei Chromosom 2 scheiden 8 Messwerte aus und bei
Chromosom 4 wird ein Bruchpunkt aus der Wertung genommen). Zusätzlich
werden dafür noch die Chromosomen in fünf Abschnitte eingeteilt: Der Bereich
um die Telomere herum wird als „p-“ respektive „q-Telomer proximal“ definiert
und entspricht dem Chromosomenbereichen zwischen 5 und 10% bzw.
zwischen 89 und 95% (Schilling et al., 2006). Die Centromerregion für das
Chromosom 1 liegt zwischen 45 und 54%, für das Chromosom 2 zwischen 35
und 44% und für das Chromosom 4 zwischen 23 und 32% der
Chromosomengesamtlänge. Die Abschnitte zwischen dem Centromerbereich
und telomerproximalen Regionen werden als p-Arm bzw. q-Arm definiert.
28

                          Chromosom 1        Chromosom 2         Chromosom 4
  p-Telomer proximal      1,7%               1,2%                0,7%
  p-Arm                   30,7%              13,4%               3,9%
  Centromerregion         10,0%              7,8%                9,2%
  q-Arm                   56,4%              68,0%               84,3%
  q-Telomer proximal      1,1%               9,5%                2,0%
Tabelle 5: Prozentuale Verteilung der Bruchereignisse von Chromosom 1, 2 und 4. Zur
Definition der fünf Regionen des Chromosoms wird das Chromosom in 100 gleich große Stücke
unterteilt und jeder Region ein exakter Bereich zugewiesen. Aberrationen auf den ersten und
letzten fünf Prozent der Chromosomenlänge werden wegen der Messungenauigkeit nicht
gewertet.

Diagramm 7: Prozentuale Verteilung der Aberrationen von Chromosom 1, 2 und 4
aufgeschlüsselt nach telomerproximalen Regionen, Centromerregion (Centro.) sowie p- bzw q-
Region. Zur Bildung der verschiedenen Regionen werden die Chromosomen 1, 2 und 4 in 100
gleichgroße Abschnitte aufgeteilt. Bruchereignisse, die sich auf den ersten 5% bzw. den letzten
5% der Chromosomengesamtlänge befinden, werden wegen der Messungenauigkeit nicht
berücksichtigt.

3.4. Statistische Analyse
Für die statistische Analyse (Chi-Quadratbestimmung und Ermittlung der
Irrtumswahrscheinlichkeit p), die mit Hilfe des Statistikprogramms SPSS erfolgt
werden 572 Bruchereignisse herangezogen. Hierzu werden die Chromosomen
in 5 gleichgroße Abschnitte unterteilt. Im einzelnen sind dies also die zwei
telomernahen Abschnitte, die Region um das Centromer herum, sowie der
Bereich zwischen Centromer und Telomer auf den beiden Schenkeln des
Chromosoms. Es zeigen sich für die Bruchhäufung auf allen drei Chromosomen
höchstsignifikante Abweichungen von den erwarteten Verteilungen auf allen
Chromosomenabschnitten: Für das erste Chromosom werden pro Abschnitt
29

rund 36 Ereignisse erwartet. Tatsächlich treten jedoch höchstsignifikante
Abweichungen       sowohl      nach    oben      als    auch   nach      unten     auf.   Die
Irrtumswahrscheinlichkeit p ist ebenfalls höchst signifikant und liegt bei p ≤
0,001. Die Nullhypothese kann somit verworfen werden. Beim zweiten
Chromosom werden pro Chromosomenabschnitt rund 48 Aberrationen erwartet.
Die gefundenen Residuen zeigen höchstsignifikante Abweichungen in beide
Richtungen. Für p wird ein Wert kleiner oder gleich 0,001 ermittelt, womit die
Alternativhypothese           angenommen           werden        kann.         Rund       31
Chromosomenschäden werden für das vierte Chromosom je Abschnitt erwartet.
Höchstsignifikante Abweichungen zeigen sich auch hier im positiven und
negativen Bereich. Durch einen p-Wert kleiner gleich 0,001 kann ebenfalls die
Nullhypothese        abgelehnt        werden.          Die     betragsmäßig         höchste
Wahrscheinlichkeit für eine Chromosomenaberration wird bei allen drei
Chromosomen         jeweils     im    Bereich      zwischen      61      und     80%      der
Chromosomengesamtlänge erwartet (Tabelle 6).

                               Beobachtete Anzahl       Erwartete Anzahl   Residuum
 Chromosom 1

 p-telomerproximale Region     9 (5,0%)                 35,8 (20%)         -26,8
 p-Arm                         39 (21,8%)               35,8 (20%)         3,2
 Centromer                     39 (21,8%)               35,8 (20%)         3,2
 q-Arm                         73 (40,8%)               35,8 (20%)         37,2
 q-telomerproximale Region     19 (10,6%)               35,8 (20%)         -16,8
 ∑                             179 (entsprechen 100%)

 Chromosom 2

 p-telomerproximale Region     14 (5,9%)                47,8 (20%)         -33,8
 p-Arm                         30 (12,6%)               47,8 (20%)         -17,8
 Centromer                     51 (21,3%)               47,8 (20%)         3,2
 q-Arm                         76 (31,8%)               47,8 (20%)         28,2
 q-telomerproximale Region     68 (28,5%)               47,8 (20%)         20,2
 ∑                             239 (entsprechen 100%)

 Chromosom 4

 p-telomerproximale Region 7 (4,5%)                    30,8 (20%)          -23,8
 p-Arm                         31 (20,1%)              30,8 (20%)          0,2
 Centromer                     48 (31,1%)              30,8 (20%)          17,2
 q-Arm                         54 (35,1%)              30,8 (20%)          23,2
 q-telomerproximale Region 14 (9,1%)                   30,8 (20%)          -16,8
 ∑                             154 (entsprechen 100%)
Tabelle 6: Gegenüberstellung der erwarteten und tatsächlich eingetretenen Bruchereignisse
(Chi-Quadrattest). Die Chromosomen werden in fünf gleichgroße Abschnitte unterteilt. Erwartet
wird eine gleichmäßige Verteilung der Bruchereignisse.
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