Das intestinale Mikrobiom bei Patienten mit amyotropher Lateralsklerose
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Universitätsklinikum Ulm
Klinik für Neurologie
Direktor: Prof. Dr. med. A. C. Ludolph
Das intestinale Mikrobiom
bei Patienten mit amyotropher
Lateralsklerose
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin
der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm
Vorgelegt von
Carolin Isabel Adis, geboren in Mainz
Ulm, 2021
Amtierender Dekan: Prof. Dr. rer. nat. Thomas Wirth 1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Jochen Weishaupt 2. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Barbara Spellerberg Tag der Promotion: 15. April 2021
Auszüge aus dieser Dissertation wurden im Rahmen der Publikation „The fecal microbiome of ALS patients“, David Brenner, Andreas Hiergeist, Carolin Adis, Benjamin Mayer, André Gessner, Albert C. Ludolph, Jochen H. Weishaupt in der Fachzeitschrift Neurobiology of Aging (2018, 132-137) veröffentlicht.
Das intestinale Mikrobiom bei Patienten mit amyotropher Lateralsklerose
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................. III
Abbildungsverzeichnis .................................................................................................. IV
Tabellenverzeichnis ...................................................................................................... IV
1 Einleitung ............................................................................................................... 1
1.1 Amyotrophe Lateralsklerose – eine Motoneuronerkrankung...................................... 1
1.1.1 Definition und Klassifikation .......................................................................................... 1
1.1.2 Epidemiologie ................................................................................................................ 2
1.1.3 Ätiologie und Pathologie ............................................................................................... 2
1.1.4 Diagnostik und Therapie ................................................................................................ 2
1.1.5 Neuroinflammation und die Rolle des Immunsystems bei ALS ..................................... 3
1.2 Das Mikrobiom .......................................................................................................... 5
1.2.1 Allgemeines und Definition ........................................................................................... 5
1.2.2 Next-Generation-Sequencing (NGS) .............................................................................. 5
1.2.3 16S-rDNA-Sequenzierung versus Metagenom-Shotgun-Sequenzierung ...................... 5
1.2.4 16S-rDNA ....................................................................................................................... 6
1.2.5 Mikrobiom-Darm-Hirnachse und der Einfluss auf das Immunsystem ........................... 6
1.2.6 Mikrobiom und neurologische Erkrankungen ............................................................... 7
1.3 Das Mikrobiom bei ALS .............................................................................................. 8
1.4 Ziel der Studie ............................................................................................................ 9
2 Material und Methodik ........................................................................................ 10
2.1 Material ................................................................................................................... 10
2.1.1 Studienpopulation ....................................................................................................... 10
2.1.2 Stuhlprobenentnahme-Kit ........................................................................................... 10
2.1.3 Stuhlprobenaufbereitung und Analyse ....................................................................... 10
I
Carolin Adis
Das intestinale Mikrobiom bei Patienten mit amyotropher Lateralsklerose
2.2 Methodik ................................................................................................................. 11
2.2.1 Studienablauf im Überblick ......................................................................................... 11
2.2.2 Ethikantrag .................................................................................................................. 11
2.2.3 Erhebung der Probanden ............................................................................................ 12
2.2.4 Aufklärung und Einwilligungserklärung ....................................................................... 14
2.2.5 Stuhlprobenentnahme ................................................................................................ 14
2.2.6 Stuhlprobenaufbereitung und DNA-Extraktion ........................................................... 14
2.2.7 Quantifizierung der 16S rDNA mittels Echtzeit-PCR (qRT-PCR) ................................... 15
2.2.8 PCR-Amplifikation von V3-V6 16S rDNA und 454-Pyrosequenzierung ........................ 15
2.2.9 Auswertung der Rohdaten und statistische Analyse ................................................... 16
2.2.10 Vorhersage des Metagenoms ...................................................................................... 17
3 Ergebnisse ............................................................................................................ 18
3.1 Die Studienpopulation ............................................................................................. 18
3.2 Quantität des fäkalen Mikrobioms ........................................................................... 19
3.3 Diversität des fäkalen Mikrobioms ........................................................................... 20
3.3.1 a-Diversität.................................................................................................................. 20
3.3.2 b-Diversität .................................................................................................................. 20
3.4 Relative Häufigkeit von bakteriellen Taxa................................................................. 22
3.5 Vorhersage des Metagenoms ................................................................................... 28
4 Diskussion ............................................................................................................ 31
4.1 Zusammenstellung und Bedeutung der Ergebnisse ................................................... 31
4.2 Vergleich mit bisherigem Wissensstand ................................................................... 34
4.3 Schlussfolgerung ...................................................................................................... 36
5 Zusammenfassung ............................................................................................... 37
6 Literaturverzeichnis.............................................................................................. 39
7 Anhang ................................................................................................................ 47
Danksagung ................................................................................................................. 48
Lebenslauf – Curriculum vitae ...................................................................................... 49
II
Carolin Adis
Das intestinale Mikrobiom bei Patienten mit amyotropher Lateralsklerose
Abkürzungsverzeichnis
ALS Amyotrophe Lateralsklerose
ALSFRS(-R) (revised) ALS Functional Rating Scale
BDNF brain derived neurotrophic factor
EAE experimental autoimmune encephalomyelitis
fALS familiäre ALS
FDR False Discovery Rate
FTD Frontotemporale Demenz
GF germ-free; keim-frei
HBV Hepatits-B-Virus
HC healthy controls
HCV Hepatits-C-Virus
HIV human immunodeficiency virus
KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes
MND-NET motor neuron disease – network
MS Multiple Sklerose
NGS next generation sequencing
NIV nicht-invasive Beatmung
OTU operational taxonomic unit, operative taxonomische Einheit
PBS Phosphate buffered saline, Phosphat-gepufferte Salzlösung
PD Parkinson Disease
PEG perkutane endoskopische Gastrostomie
PLS Primäre Lateralsklerose
PMA Progressive muskuläre Atrophie
qRT-PCR real-time quantitative polymerase chain reaction
RKU Universitäts- und Rehabilitationsklinikum Ulm
sALS sporadische ALS
SCFA short-chain fatty acid
SOD1 superoxide dismutase 1
III
Carolin Adis
Das intestinale Mikrobiom bei Patienten mit amyotropher Lateralsklerose
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Studienablauf im Überblick ........................................................................................................ 11
Abbildung 2: Quantität des fäkalen Mikrobioms ............................................................................................ 19
Abbildung 3: Diversität des fäkalen Mikrobioms............................................................................................. 21
Abbildung 4: Verteilung bakterieller Taxa auf Stamm-Ebene ......................................................................... 23
Abbildung 5: Verteilung bakterieller Taxa auf Klassen-Ebene ......................................................................... 24
Abbildung 6: Verteilung bakterieller Taxa auf Ordnungs-Ebene ..................................................................... 25
Abbildung 7: Verteilung bakterieller Taxa auf Familien-Ebene ....................................................................... 26
Abbildung 8: Verteilung der bakteriellen Taxa auf Genus-Ebene ................................................................... 27
Abbildung 9: Vorhersage des Metagenoms auf Level 2 .................................................................................. 29
Abbildung 10: Vorhersage des Metagenoms auf Level 3 ................................................................................ 30
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Ein- und Ausschlusskriterien ........................................................................................................... 13
Tabelle 2: Klinische Parameter der Studienpopulation.................................................................................... 18
IV
Carolin Adis
Einleitung
1 Einleitung
1.1 Amyotrophe Lateralsklerose – eine Motoneuronerkrankung
1.1.1 Definition und Klassifikation
Die amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine neurodegenerative Erkrankung, welche das
erste und zweite Motoneuron befällt. Bei der klassischen ALS kommt es zu einem Mischbild
aus schlaffen atrophischen und spastischen Paresen. Erstmals wurde die Erkrankung im
Jahr 1874 von Jean Martin Charcot beschrieben [23]. Etwa 20-30% der Betroffenen weisen
zu Beginn der Erkrankung (pseudo-)bulbäre Symptome (wie beispielsweise Dysphagie,
Dysarthrie, Pseudohypersalivation, Atrophie der Kaumuskulatur und der fazialen
Muskulatur) auf, was eine Affektion der entsprechenden Hirnnervenkerne anzeigt [40].
Weiterhin können Faszikulationen, gesteigerte Reflexe, ein erhöhter Muskeltonus und
Pyramidenbahnzeichen auftreten [35]. Sensibilitätsstörungen und Schmerzen sind nicht
typisch, schließen die Erkrankung jedoch nicht aus [68]. Etwa 5% der Betroffenen
entwickeln klinische Zeichen frontaler kognitiver Defizite oder Verhaltensstörungen [40].
Eine reduzierte Nahrungsaufnahme infolge der Paresen und Dysphagie sowie ein gestörter
Energiemetabolismus führen regelmäßig zur Malnutrition [16]. Außerdem kommt es im
Verlauf zur Atrophie der Atemmuskulatur, was eine respiratorische Insuffizienz bedingt.
Von der klassischen Form der ALS (erstes und zweites Motoneuron betroffen) lassen sich
klinisch mehrere Unterformen abgrenzen. Dazu gehört die primäre Lateralsklerose (PLS),
die den reinen Befall des ersten Motoneurons meint oder als Pseudobulbärparalyse
ausschließlich die Hirnnerven befällt. Außerdem gehört das Flail-Arm/Flail-Leg-Syndrom
dazu, welches initial zu einer schlaffen Paraparese der oberen bzw. unteren Extremität
führt [68]. Wenn klinisch (noch) keine Beteiligung des ersten Motoneurons vorliegt, wird
dies als progressive Muskelatrophie (PMA) bezeichnet [68]. Sowohl PLS als auch PMA
gehen im Verlauf häufig in eine klassische ALS über. Bei 5-10% der Patienten liegt eine
Unterform vor, bei der die frontotemporale Demenz (FTD) und ALS komorbid auftreten
[68].
1
Carolin Adis
Einleitung
1.1.2 Epidemiologie
Die Inzidenz der ALS in Europa liegt bei 2,5 pro 100.000 Einwohner. Das Verhältnis Männer
zu Frauen beträgt 1,1:1. Männer sind somit geringfügig häufiger betroffen als Frauen. Das
mittlere Erkrankungsalter bei Männern liegt bei 63,8 Jahren (SD = 11,9), bei Frauen liegt es
bei 66,0 Jahren (SD = 12,2) [57]. Das Lebenszeitrisiko an ALS zu erkranken beträgt etwa
1:400 [61].
1.1.3 Ätiologie und Pathologie
Bei etwa 90% der Betroffenen ist die Erkrankung sporadisch (sALS) bedingt und ätiologisch
unklar, 10% der Fälle treten familiär auf und weisen meist einen autosomal-dominanten
Erbgang auf [61]. Klinisch-neurologisch lässt sich oft kein Unterschied zwischen familiärer
und sporadischer ALS feststellen. In den letzten Jahren wurden Mutationen in über 20
Genen entdeckt, die eine familiäre ALS (fALS) auslösen können [13, 33, 42]. Zum Teil sind
die betroffenen Gene funktionell synergistisch (Fehlfunktionen des RNA-Metabolismus,
der Autophagie, des Zytoskeletts und der DNA-Reparatur) [60]. Neuropathologische
Charakteristika der sALS und der meisten fALS-Formen sind zytoplasmatische TDP-43-
positive Inklusionen in kortikalen, bulbären und spinalen Motoneuronen sowie eine
reaktive Astro- und Mikrogliose [47]. Auch systemisch kommt es zu immunologischen
Veränderungen des angeborenen und des erworbenen Immunsystems [44, 66].
1.1.4 Diagnostik und Therapie
Die Diagnose einer ALS erfolgt vorwiegend aufgrund klinischer Kriterien und stellt eine
Ausschlussdiagnose dar. Vor allem im Frühstadium der Erkrankung sind
differentialdiagnostische Überlegungen fundamental. Ein klassisches diagnostisches
Vorgehen kann aus den deutschen Leitlinien für Diagnostik und Therapie in der Neurologie
entnommen werden [68]. Die Verwendung der El Escorial Kriterien kann hierbei zur
Abschätzung der Wahrscheinlichkeit, ob es sich um ALS handelt, hilfreich sein [41].
Mit Hilfe der ALSFRS (Amyotrophic Lateral Sclerosis Functional Rating Scale) werden
funktionelle Fähigkeiten der Patienten genauer erfasst, was eine objektive
Verlaufsbeurteilung ermöglicht.
2
Carolin Adis
Einleitung
Beim ALSFRS-R handelt es sich um eine erweiterte Form der ALSFRS mit zwei zusätzlichen
Kriterien, welche besonderen Schwerpunkt auf die Atmung legen. Die Verwendung der
ALSFRS ist in allen Stadien möglich und umfasst folgende Punkte: Sprache, Speichelfluss,
Schlucken, Handschrift, Essen, Ankleiden und Körperpflege, Umdrehen im Bett bzw. Bett
richten, Gehen, Treppensteigen und Atmung. Maximal können 40 Punkte erreicht werden.
Je höher der Wert, desto geringer ist die Beeinträchtigung durch die Krankheit.
Bislang ist keine kurative Therapie der ALS verfügbar. Die Patienten versterben in der Regel
nach 2-5 Jahren, meist aufgrund respiratorischer Insuffizienz. Die mittlere Überlebenszeit
von Beginn der Krankheit bis zum Tod liegt zwischen 20 und 48 Monaten, etwa 10-20% der
ALS-Patienten überleben jedoch mehr als 10 Jahre [12]. Riluzol (Handelsname Rilutek) mit
seiner antiglutamatergen Wirkung ist bislang das einzig zugelassene Medikament, welches
lebensverlängernd wirkt [61].
Prognostisch und für die Lebensqualität mindestens ebenso relevant sind symptomatische
Therapiemaßnahmen wie die frühe Anpassung einer nicht-invasiven Heimbeatmung (NIV)
[6, 18] bei beginnender respiratorischer Beeinträchtigung, regelmäßige Ergotherapie und
Krankengymnastik, eine hochkalorische Ernährung [38], die Anlage einer perkutanen
endoskopischen Gastrostomie (PEG) bei relevanter Dysphagie und Kachexie [10, 15, 19],
eine suffiziente psychosoziale Betreuung und eine bedarfsgerechte Hilfsmittelversorgung
[20, 68].
1.1.5 Neuroinflammation und die Rolle des Immunsystems bei ALS
Neurodegenerative Erkrankungen wie Morbus Parkinson und Amyotrophe Lateralsklerose
gehen mit einer Neuroinflammation einschließlich einer Aktivierung von Mikroglia und
Astrozyten einher [30, 37, 48].
Durch Versuche mit transgenen Mäusen, die humanes mutantes SOD1 in allen Zellen
überexprimieren außer in Astrozyten bzw. Mikroglia und Oligodendroglia, konnte gezeigt
werden, dass alle drei Gliatypen einen wesentlichen Einfluss auf die Krankheitsprogression
im gebräuchlichsten ALS-Tiermodell haben [7, 64, 65]. Eine Korrelation zwischen dem
Ausmaß von Mikrogliaaktivierung und Schädigung der Motoneurone konnte indirekt
bildgebend auch in sporadischen ALS-Patienten nachgewiesen werden [56].
3
Carolin AdisEinleitung
Weiterhin wird der Krankheitsverlauf im ALS-Tiermodell nicht nur durch eine lokale
Entzündungsreaktion, sondern sowohl durch periphere Leukozyten der angeborenen
(Monozyten, Makrophagen) als auch der erworbenen Immunabwehr (regulatorische T-
Zellen, CD4+- und CD8+-T-Zellen) moduliert [2, 11, 14]. So scheinen auch bei ALS-Patienten
Veränderungen des peripheren zellulären Immunsystems eine Rolle zu spielen. Eine
Dysregulation der im Blut zirkulierenden Monozyten und regulatorischen T-Zellen konnte
nachgewiesen werden, welche in letzterem Falle mit der Krankheitsprogression korreliert
[2].
4
Carolin AdisEinleitung
1.2 Das Mikrobiom
1.2.1 Allgemeines und Definition
Das Mikrobiom bezeichnet die Gesamtheit aller den Menschen besiedelnden
Mikroorganismen, schätzungsweise die 10- bis 100-fache Menge an menschlichen
Körperzellen, zusammengefasst über 1014 Lebewesen [69]. Auch in der Anzahl der Gene
übersteigt das Mikrobiom die menschliche Zelle um das 10.000-fache [46].
Allgemein wird zwischen den beiden Begriffen Mikrobiom und Mikrobiota unterschieden.
Mikrobiota bezeichnet die Gesamtheit aller existierenden Mikroorganismen, während das
Mikrobiom im engeren Sinne die Gesamtheit aller den menschlichen Körper besiedelnden
Mikroorganismen und damit ihre mikrobiellen Gene definiert.
Die Entschlüsselung des intestinalen Mikrobioms hat in den letzten Jahren erheblich an
Bedeutung gewonnen, da man sich Erkenntnisse über die Zusammensetzung und Funktion
der Darmflora und Rückschlüsse auf die Entstehung und Ursache von bisher unklaren
Erkrankungen erhofft. Die erste Kolonisierung des Menschen durch Bakterien beginnt
bereits mit der Geburt und der Aufnahme der ersten Nahrung. Im Laufe des Lebens kommt
es zunehmend zu Veränderungen, aerobe Bakterien werden durch fakultativ aerobe und
anaerobe Arten ersetzt [69].
1.2.2 Next-Generation-Sequencing (NGS)
Aufgrund Nicht-Vorhandensein entsprechender Technologie war es lange Zeit nicht
möglich eine genaue Analyse des intestinalen Mikrobioms durchzuführen, da ein Großteil
der Mikroorganismen in vitro nicht kultivierbar sind. Mittels NGS gelingt es nun mikrobielle
Taxa in kurzer Zeit zu identifizieren und quantifizieren ohne diese zu kultivieren.
1.2.3 16S-rDNA-Sequenzierung versus Metagenom-Shotgun-Sequenzierung
Für die Analyse des Mikrobioms kommen prinzipiell zwei verschiedene
Sequenzierungsmöglichkeiten in Betracht. Steht die funktionelle Charakterisierung der
genetischen Information im Vordergrund, wird eine Metagenom-Shotgun-Sequenzierung
bevorzugt, welche ohne vorherige PCR-Amplifikation den vollständigen DNA-Gehalt einer
5
Carolin AdisEinleitung
Probe erfasst. Ist wie im vorliegenden Fall primär die bakterielle Zusammensetzung von
Interesse, kann die sogenannte 16S-rDNA-Amplikon-Sequenzierung angewandt werden, in
der zuvor generierte Amplifikate eines Gens sequenziert werden [69].
1.2.4 16S-rDNA
Das 16S-rDNA-Gen kodiert einen Teil der kleinen 30S-Untereinheit des bakteriellen
Ribosoms. Es kommt nahezu in allen Bakterien vor und setzt sich aus konstanten und
variablen Regionen zusammen. Primer setzen an den konstanten Regionen des 16S-rDNA-
Gens an und können so universell eingesetzt werden. Dieses bietet den Vorteil, dass ohne
vollständige Sequenzierung des Genoms ein guter Einblick in die bakterielle
Zusammensetzung geworfen werden kann. Gleiche bzw. ähnliche Sequenzabschnitte
werden anschließend mittels Datenbankabgleich in sogenannte OTUs (operational
taxonomic unit) zusammengefasst (sogenanntes Clustering). Als OTU wird eine Gruppe von
Organismen beschrieben, die auf Sequenzebene bis zu einem vorher bestimmten
Schwellenwert, beispielsweise 95%, identisch sind.
1.2.5 Mikrobiom-Darm-Hirnachse und der Einfluss auf das Immunsystem
Das Mikrobiom ist an der Verdauung von Nährstoffen sowie an der Regulation des
Stoffwechsels beteiligt. Adipöse Patienten weisen im Vergleich zu schlanken Patienten eine
effizientere Energiegewinnung auf [55]. Überdies ist das Mikrobiom an der Regulierung der
Blut-Hirn-Schranke, der Myelinisierung, der Neurogenese sowie am Wachstum und der
Differenzierung von Neuronen beteiligt [50, 53]. Zudem wurde gezeigt, dass kurzkettige
Fettsäuren (SCFA), die durch mikrobiotische Fermentation entstehen, an der Mikroglia-
Homöostase mitwirken [21]. Dies lässt vermuten, dass die Aktivierung von Mikroglia und
die Entstehung von neurodegenerativen Erkrankungen durch komplexe Mikrobiota
beeinflusst werden können.
Der Einfluss des Mikrobioms auf das Immunsystem wird im Modell mit keimfreien
(GF=germ-free) Mäusen ersichtlich. GF-Mäuse zeigen eine überschießende Reaktion der
Hypothalamus-Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse mit folglich erhöhtem Cortison-
Spiegel, sowie einem erniedrigten BDNF (brain-derived neurotrophic factor) [54]. BDNF
stimuliert wiederum die Neurogenese und das Wachstum der Synapsen.
6
Carolin AdisEinleitung
Während sich das Mikrobiom in jungen Jahren aufbaut und entwickelt, kann es Einfluss in
die vulnerablen Phasen der Hirnentwicklung nehmen [17].
1.2.6 Mikrobiom und neurologische Erkrankungen
Die physiologische und pathophysiologische Rolle des intestinalen Mikrobioms gewinnt
schließlich zunehmend an Bedeutung. Mittlerweile wurden über 25 Erkrankungen oder
Syndrome mit Veränderungen des intestinalen Mikrobioms in Verbindung gebracht [59].
Eine Veränderung der Mikrobiomzusammensetzung wurde bereits bei mehreren
neurologischen Erkrankungen beschrieben. Unter anderem zeigte sich bei Patienten mit
Multipler Sklerose eine erhöhte Besiedlung von Methanobrevibacter- und
Akkermansiastämmen, sowie eine verminderte Anzahl von Butyricimonas [5, 31]. Derartige
mikrobielle Veränderungen können mit einer veränderten Expression von Interferon- und
NFkB-Signalweg-Genen korrelieren und somit Einfluss auf die Immunantwort des Körpers
haben [31]. Das experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE)-Mausmodell zeigte,
dass, in Abwesenheit von pathogenen Erregern, die Darmflora bei der Progression
autoimmuner Erkrankungen mitwirkt [5].
Auch M. Parkinson scheint durch das Mikrobiom beeinflusst zu werden. So zeigten
Patienten mit M. Parkinson eine deutliche Reduktion (77,6%) an Prevotella-Stämmen.
Zudem ergab sich ein Zusammenhang zwischen der Quantität bestimmter Enterobakterien
und posturaler Instabilität [51, 52]. In a-Sync-überexprimierenden Mäusen konnte gezeigt
werden, dass die intestinalen Mikroorganismen die Synucleinopathie, die
Neuroinflammation und die motorischen Symptome negativ beeinflussen. Durch die
Behandlung mit Antibiotika verbesserte sich die neuropathologischen und klinischen
Symptome, während sich der Zustand der Tiere nach einer mikrobiellen Rekolonisation
verschlechterte [49].
Ferner wurde in einem Mausmodell für M. Alzheimer eine Zunahme der zerebraler
Amyloid-b-Ablagerung zusammen mit einer veränderten Zusammensetzung des
Mikrobioms beobachtet [8, 27].
Des Weiteren scheinen sich auch die Darmflora und zerebrovaskuläre Erkrankungen
wechselseitig zu beeinflussen. So zeigte sich nach Antibiotikagabe eine Reduktion von
akuten zerebralen Ischämien [4].
7
Carolin AdisEinleitung
1.3 Das Mikrobiom bei ALS
Die amyotrophe Lateralsklerose gehört zwar zu den degenerativen
Motoneuronenerkrankung, die meisten ALS-Patienten leiden aber auch an relevanten,
nicht die Motorik betreffenden Symptomen, wie beispielsweise metabolische
Dysregulation und Mangelernährung, welche die Progression der Krankheit mitbestimmen.
Die Aggregation von fehlgefalteten Proteinen wird als Ursache der Erkrankung diskutiert.
In Mäusen mit ALS-relevanter SOD1-Mutation, sogenannte SOD1-G93A-Mäuse, fand man
eine intestinale Permeabilitätszunahme sowie eine Zunahme von abnormalen Paneth-
Körnerzellen [63], welche zum Erhalt des Immunsystems beitragen. Auch in ihrer
mikrobiellen Zusammensetzung wiesen SOD1-G93A-Mäuse Unterschiede zu Wildtyp-
Mäusen auf. Es fanden sich reduzierte Anteile von Butyrivibrio fibrisolvens, E. coli und
Firmicutes in SOD1-G93A-Mäusen [63]. Des Weiteren berichteten Zhang et al. über ein
verlängertes Überleben von SOD1-G93A-Mäusen, die mit dem intestinalen Metabolit
Butyrat ernährt wurden [67].
Erst vor kurzem wurden erstmalig in einer Studie das Mikrobiom von 6 ALS-Patienten und
5 gesunden Kontrollen miteinander verglichen. Wissenschaftler fanden bei ALS-Patienten
ein verringertes Verhältnis an Firmicutes zu Bacteroidetes, eine erhöhte relative Häufigkeit
von Dorea-Stämmen und eine reduzierte relative Häufigkeit von Oscillibacter, Anaerostipes
und Lachnospiraceae im Vergleich zu gesunden Probanden [22].
8
Carolin AdisEinleitung
1.4 Ziel der Studie
Angesichts seiner weitreichenden Auswirkungen auf (patho-)physiologische Wirtsvorgänge
verdient das fäkale Mikrobiom eine genaue Analyse bei Patienten mit ALS. Das Ziel dieser
Studie ist es, die mikrobielle Zusammensetzung von Stuhlproben von ALS-Patienten mit der
von gesunden Kontrollpersonen zu vergleichen.
9
Carolin AdisMaterial und Methodik
2 Material und Methodik
2.1 Material
2.1.1 Studienpopulation
• 25 an ALS erkrankte Patienten aus der neurologischen Abteilung des RKU
• 32 in Alter und Geschlecht angepasste gesunde Kontrollprobanden
2.1.2 Stuhlprobenentnahme-Kit
• Stuhlfänger, Papier (r-biopharm)
• Bettpfanne (im stationären Bereich)
• Stuhlprobenröhrchen 76x20mm mit deckelintegiertem Löffel (Sarstedt)
• Gefrierschrank auf -80°C
• Styroporbox mit Trockeneis
2.1.3 Stuhlprobenaufbereitung und Analyse
• MagNA Pure 96 system (Roche)
• Platinum Taq polymerase (Life Technologies), 341F/1061R primer
• KAPA Library Quant Real-time PCR Kit (KAPA Biosystems)
• Roche 454 GS Junior+, GS FLX+, GS FLX Titanium XL+
• SILVA 123 release 16S-rRNA gene database
• PiCrust 1.1.0 Software, KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)
Orthologen
Für eine vollständige Aufzählung und Beschreibung siehe [28, 29].
10
Carolin AdisMaterial und Methodik
2.2 Methodik
2.2.1 Studienablauf im Überblick
Abbildung 1: Studienablauf im Überblick
Erhebung der Probanden, Einschluss von 25 ALS-Patienten und 32 gesunden Kontrollen;
Stuhlprobenentnahme und Aufbewahrung bei -80°C am Universitätsklinikum Ulm; Stuhlprobenaufbereitung
und DNA-Extraktion; PCR-Amplifikation und next-generation sequencing von V3-V6 16S rDNA; OTU-
Clustering und Vergleich mit bakteriellen Taxa mittels Referenzdatenbank; Datenanalyse und statistische
Auswertung. Der Studienablauf erstreckte sich von 2015 bis 2017 am Universitätsklinikum Ulm sowie in
Kollaboration mit dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene in Regensburg.
ALS = Amyotrophe Lateralsklerose, HC = healthy controls, (r)DNA = (ribosomal) deoxyribonucleic acid, PCR =
polymerase chain reaction, NGS = Next-generation sequencing, OTU = operational taxonomic unit [9]
(Abdruck mit freundlicher Genehmigung von Elsevier)
2.2.2 Ethikantrag
Der Antrag Nr. 19/12 – Deutsches Netzwerk für Motoneuronenerkrankung – German
Network for Motor Neuron Diseases (MND-NET): A Registry and Trace Study wurde mit
einer Ergänzung (Stuhlprobensammlung) der Ethikkommission der Universität Ulm
vorgelegt und genehmigt. Siehe hierzu auch Anhang 1 (7.1. Ethikantrag).
11
Carolin AdisMaterial und Methodik
2.2.3 Erhebung der Probanden
Die Patientenerhebung erfolgte im Zeitraum von Oktober 2015 bis September 2016 in der
neurologischen Abteilung des Universitäts- und Rehabilitationsklinikum Ulm (RKU).
Insgesamt wurden Stuhlproben von 25 ALS-Patienten, davon 3 familiär und 22 sporadisch,
mit denen von 32 Kontrollprobanden verglichen. Für die Studie geeignete ALS-Patienten
wurden mit Unterstützung der Mitarbeiter des MND-NET ermittelt. Die 25 ALS-Patienten
wurden nach den revidierten El-Escorial-Kriterien diagnostiziert.
Ein Fragebogen, siehe Anhang 3 (7.3. Fragebogen zur Probensammlung), diente dem
Erkennen, Eingrenzen und Ausfiltern von Störfaktoren. Wichtige Ausschlusskriterien waren
eine vorangegangene Einnahme von Antibiotika, Cortison oder anderen
Immunsuppressiva. Außerdem wurden Patienten mit stark eingeschränkter bulbärer
Symptomatik (ausgeprägte Dysphagie und Dysarthrie), respiratorischer Insuffizienz,
chronisch-entzündlicher Darmerkrankung oder anderer Autoimmunerkrankungen, sowie
mit einer zum Zeitpunkt der Untersuchung manifesten Infektion ausgeschlossen. Für eine
detaillierte Auflistung siehe Tabelle 1: Ein- und Ausschlusskriterien.
Bei der Kontrollgruppe handelt es sich um Personen aus dem Familien- und Bekanntenkreis
der Doktorandin sowie um Mitarbeiter der Universität Ulm, die im süddeutschen Raum
leben und mit dem gleichen Fragebogen unterzogen wurden. Beide Gruppen wurden
bezüglich Alter und Geschlecht aufeinander abgestimmt.
12
Carolin AdisMaterial und Methodik
Tabelle 1: Ein- und Ausschlusskriterien
Die Tabelle zeigt die Ein- und Ausschlusskriterien der teilgenommenen Probanden, die im Zeitraum von
Oktober 2015 bis September 2016 in die Studie am Universitätsklinikum Ulm aufgenommen wurden.
ALS = amyotrophe Lateralsklerose; MMSE = Mini-Mental State Examination, GDS = Geriatric Depression Scale,
HIV = human immunodeficiency virus, HBV = Hepatitis-B-Virus, HCV = Hepatitis-C-Virus [9] (Abdruck mit
freundlicher Genehmigung von Elsevier)
13
Carolin AdisMaterial und Methodik
2.2.4 Aufklärung und Einwilligungserklärung
Vor Probenentnahme wurden die Patienten und das zuständige Pflegepersonal von der
Doktorandin über das Prozedere und die Abnahme informiert und von den Mitarbeitern
des MND-NET mittels Einwilligungserklärung, siehe Anhang 2 (7.2. Einwilligungserklärung
für Patienten und gesunde Probanden), in das Netzwerk aufgenommen.
2.2.5 Stuhlprobenentnahme
Nach Defäkation wurde mit Hilfe eines speziellen Plastiklöffels ein Teil der Stuhlprobe in
ein dafür vorhergesehenes Probengefäß überführt und umgehend auf -80°C tiefgefroren.
So konnte ein Zerfall von DNA und eine Veränderung der Stuhlflora durch unterschiedliches
bakterielles Wachstum bei Raumtemperatur verhindert werden. Der Transport und die
Verarbeitung der Proben erfolgten stets auf Trockeneis. Bei der Stuhlprobenentnahme war
zu beachten, dass die Probe möglichst von der freien Oberfläche des Stuhls entnommen
wurde und damit eine Kontamination mit Urin oder anderen Flüssigkeiten sowie dem
Auffanggehäuse ausgeschlossen werden konnte. Um das Absinken des Stuhls in das
Spülwasser zu verhindern, wurde im stationären Bereich ein zusätzlicher Auffangbehälter
in die Toilette eingesetzt. Im ambulanten Umfeld diente ein dafür angefertigter
Papierstreifen als Stuhlfänger. Da im ambulanten Bereich kein Spezialgefrierschrank zur
Verfügung stand, wurden die Proben sofort eingefroren und mit Trockeneis zügig zum
Universitäts- und Rehabilitationsklinikum Ulm (RKU) überführt. Anschließend wurden alle
Proben pseudonymisiert, auf Trockeneis gesetzt und gesammelt nach Regensburg an das
Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene des Universitätsklinikums geschickt. In
Kooperation erfolgte hier die weitere Aufarbeitung und Analyse der Proben [28, 29].
2.2.6 Stuhlprobenaufbereitung und DNA-Extraktion
Für die Präparation der Stuhlprobensuspension wurden die tiefgefrorenen Proben mit
sterilem PBS (Phosphatgepufferte Salzlösung) versetzt und homogenisiert. Aufgrund der
Unterschiede der einzelnen Bakterienstämme im Aufbau und Zusammensetzung der
Zellwand, lässt sich die DNA der verschiedenen Bakterien nicht gleichermaßen gut
isolieren. Deshalb wurden die Proben mit Proteinase K vorbehandelt.
14
Carolin AdisMaterial und Methodik
Dieses sorgt für den Abbau von Proteinen aus Zelllysaten und es kommt zur Freisetzung
der DNA. Es folgte die Aufbereitung mittels sogenanntem Bead-beating. Für die eigentliche
Aufreinigung der DNA wurde das MagNA Pure 96 System (Roche, früher 454 Life Sciences)
verwendet.
2.2.7 Quantifizierung der 16S rDNA mittels Echtzeit-PCR (qRT-PCR)
Die Vervielfältigung der gewonnen DNA-Sequenzabschnitte des 16S-rRNA-Gens wurde wie
bereits vorab beschrieben [29] mit Hilfe von Echtzeit-PCR im LightCycler 480 II (Roche)
durchgeführt. Dabei wird ein Amplifikat für verschiedene Bakterienspezies der Mikrobiota
erzeugt. Speziesspezifische Primer (764F und 907R), Hydrolysesonden und LightCycler 480
Probes Master Reagenzien halfen bei der Detektion der entsprechenden
Sequenzabschnitte. Als Quantifikationsstandard dienten pGEM-T.Easy-Vektoren, welche
16S-rDNA-Amplifikate enthielten und in einer Verdünnungsreihe mitgeführt wurden. Die
Anzahl von 16S-rDNA-Kopien kann so aus der bereits durch bekannte Konzentrationen
berechneten Standardgerade bestimmt werden.
2.2.8 PCR-Amplifikation von V3-V6 16S rDNA und 454-Pyrosequenzierung
Anschließend folgte die Vervielfältigung der extrahierten DNA zur Prüfung ihrer
Homogenität. Hierfür wurden die hypervariablen V3-V6-Regionen des 16S-rRNA-Gens
insgesamt 30 PCR-Zyklen unterzogen. Dabei Verwendung fanden die Platinum Taq-
Polymerase (Life Technologies) und sequenzspezifische Primer (341F/1061R) mit
Titanium/Lib-L-Adapter. Derartige Primer ermöglichen die speziesübergreifende
Amplifikation der 16S-rDNA.
Für die anschließende Next-Generation-Sequenzierung wurden die beiden Systeme GS
Junior+ und GS FLX+ von Roche/454 Life Science und parallel dazu das neue
Sequenzierungskit GS FLX Titanium XL + verwendet. Die Pyrosequenzierung beruht auf der
Detektion von emittiertem Licht. Die Anzahl der erzeugten Lichtsignale ist proportional zu
den eingebauten Nukleotiden. Die Lichtsignale werden aufgezeichnet, mittels Software
analysiert und die entsprechende Sequenz der DNA ermittelt. Für eine detailliertere
Beschreibung siehe Hiergeist et al. [29].
15
Carolin AdisMaterial und Methodik
2.2.9 Auswertung der Rohdaten und statistische Analyse
Nach dem Next-Generation-Sequencing wurden die gewonnenen DNA-Moleküle auf
Sequenzebene miteinander verglichen und mit einem Schwellenwert von 97%
Übereinstimmung in sogenannten OTUs (operational taxonomic unit) geordnet. Gleiche
bzw. ähnliche DNA-Sequenzabschnitte wurden so zusammengefasst. Anschließend wurden
die einzelnen OTUs mit Hilfe von öffentlich zugänglichen Referenzdatenbanken (SILVA 123
release 16S-rRNA gene database) der jeweiligen bakteriellen Taxonomie zugeordnet.
Die statistische Auswertung erfolgte durch Alpha- und Beta-Diversitätsbestimmung. Die
Vielfalt innerhalb einer Stuhlprobe wird mittels Alpha-Diversität beschrieben, welche durch
verschiedene Indices, beispielsweise Simpson-Index, berechnet werden kann. Je höher
dieser Index, desto höher die Diversität, sprich die Artenvielfalt in der Probe.
Um die Gesamtzahl von rRNA-Kopien zu vergleichen wurde der Kruskal-Wallis-Test
verwendet. Für den direkten Vergleich zwischen den beiden Gruppen (ALS und HC), dient
die Beta-Diversitätsanalyse. Die Beta-Diversität kann über verschiedene Distanzen
berechnet werden. In der Mikrobiomanalyse wird dabei der Bray-Curtis-Algorithmus am
häufigsten zur Berechnung des Distanzmaßes verwendet, so auch in unserer Studie.
Anschließend wurden die errechneten Distanzmatrixen in einer Hauptkoordinatenanalyse
(PCoA) graphisch dargestellt.
Durch Sequenzierung der markierten hypervariablen V3-V6 Region wurden
phylogenetische Profile des 16S-Gens erstellt. Anschließend wurden die relativen
Häufigkeiten verschiedener Taxa in den jeweiligen Gruppen (ALS und HC) auf diversen
taxonomischen Ebenen (Stamm, Klasse, Ordnung, Familie, Spezies) miteinander verglichen.
Dafür wurde der Kruskal-Wallis-Test verwendet, der innerhalb einer Varianzanalyse prüft
ob unabhängige Stichproben einer gemeinsamen Population entstammen. Um der
Alphafehler-Kumulierung entgegen zu wirken und Fehler durch multiples Vergleichen
möglichst gering zu halten, wurden die Korrekturen nach Bonferroni und Benjamini-
Hochberg (FDR = False Discovery Rate) angewandt.
Das Signifikanzlevel lag bei allen angewandten Tests stets bei a < 0,05. Für weitere
ausführlichere Informationen über statistische Analysen siehe auch Hiergeist et al. [29].
16
Carolin AdisMaterial und Methodik
2.2.10 Vorhersage des Metagenoms
Mit Hilfe der PiCrust 1.1.0 Software können Vorhersagen zu Metagenomprofilen basierend
auf KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) Orthologen getroffen werden. Nach
OTU-Clustering und Zuordnung der Taxonomie der gefilterten Stränge, wurden diese mit
der Referenzdatenbank (greengenes 16S rDNA database version 13.5) verglichen. Die
daraus resultierende OTU-Tabelle wurde mit der entsprechend vorhergesagten 16S-rRNA-
Genkopiezahlen genormt.
17
Carolin AdisErgebnisse
3 Ergebnisse
3.1 Die Studienpopulation
Tabelle 2: Klinische Parameter der Studienpopulation
Dauer der
n= Geschlecht
Durchschnittsalter BMI ALS-FRS-R Erkrankung FVC in %
Probenanzahl (m:w)
(Monate)
Patienten 25,58 41,28 21,85 90,64
25 57,56 ± 11,24 12:13
(ALS) ± 4,65 ± 3,90 ± 16,71 ± 20,13
Kontrollen 25,74
32 56,00 ± 11,65 16:16
(HC) ± 3,57
Die Tabelle zeigt die im Zeitraum von Oktober 2015 bis September 2016 in die Studie eingeschlossenen ALS-
Patienten sowie die gesunden Kontrollen. Die klinischen Parameter der Probanden wurden in der Neurologie
des Universitätsklinikums Ulm erhoben. BMI = Body-mass-Index, ALS = Amyotrophe Lateralsklerose, HC =
healthy controls, ALS-FRS-R = revised ALS functional scale, FVC = forcierte Vitalkapazität
Insgesamt wurden Stuhlproben von 25 ALS-Patienten (ALS), davon 3 familiär und 22
sporadisch bedingt, mit Proben von 32 hinsichtlich Alter und Geschlecht gematchten
gesunden Probanden (HC) verglichen. Unter den 3 familiär-bedingten ALS-Patienten
befanden sich zwei Patienten mit C9orf72-Mutation und eine mit unbekannter Mutation.
Da eine Dysphagie das Risiko von respiratorischen Infektionen erhöht und dies die
Zusammensetzung des intestinalen Mikrobioms beeinflussen kann, wurden ALS-Patienten
mit bulbärer Symptomatik, relevanter respiratorischer Beeinträchtigung oder nicht-
invasiver Beatmung aus der Studie ausgeschlossen (siehe auch Tabelle 1: Ein- und
Ausschlusskriterien im Methodik-Teil). Die ALS-Patienten befanden sich möglichst im
Frühstadium ihrer Erkrankung. Im Mittel lag die Zeit seit Beginn der Symptome bei etwa
21,85 Monaten. Der durchschnittliche ALSFRS-R-Score lag bei 41,28 Punkten. Bezüglich
Alter, BMI und Geschlecht waren beide Gruppen sehr ähnlich angeordnet und wurden
oben in Tabelle 2 gegenübergestellt. Die mittlere forcierte Vitalkapazität lag in der ALS-
Gruppe bei 90,64%. Eine detailliertere Auflistung klinischer Parameter der Probanden
können aus Anhang 4 (7.4. Detailed characteristics of ALS patients and HC) entnommen
werden.
18
Carolin AdisErgebnisse
3.2 Quantität des fäkalen Mikrobioms
Um die gesamte bakterielle Darmflora zu quantifizieren, wurden die bei qPCR gewonnen
16S-rRNA Kopien (pro 1g Fäzes) sowie die Anzahl der ermittelten operational taxonomic
units (OTU) quantitativ bestimmt. Wie Abbildung 2 A verdeutlicht, unterscheiden sich ALS-
Patienten und Kontrollgruppe quantitativ nicht in ihrer Anzahl an 16S-rRNA-Kopien (p =
0,91). Jedoch zeigte sich eine signifikant erhöhte Anzahl an OTUs in der ALS-Gruppe
verglichen zur Kontrollgruppe (916 ± 183 im Gegensatz zu 808 ± 186; p = 0,048). Siehe
hierzu Abbildung 2 B.
Abbildung 2: Quantität des fäkalen Mikrobioms
Die Abbildung zeigt die Quantität des fäkalen Mikrobioms von ALS-Patienten und gesunden Kontrollen im
Vergleich, gesammelt am Universitätsklinikum Ulm im Zeitraum von Oktober 2015 bis September 2016.
(A) Anzahl der mittels qPCR gewonnenen 16S rRNA-Kopien pro 1g Fäzes (p = 0,91); (B) Anzahl der
ermittelten OTUs (p = 0,048).
ALS = Amyotrophe Lateralsklerose; HC = healthy controls; rRNA = ribosomal ribonucleic acid; OTU =
operational taxonomic unit; qPCR = quantitative polymerase chain reaction [9] (Abdruck mit freundlicher
Genehmigung von Elsevier)
19
Carolin AdisErgebnisse
3.3 Diversität des fäkalen Mikrobioms
Für die Einschätzung der mikrobiologischen Vielfalt und die Verteilung der bakteriellen
Taxa in der Darmflora wurden die Proben einer 16S-rDNA Sequenzierung unterzogen.
Zur Beschreibung der Vielfalt wurden anschließend a- und b-Diversität berechnet. Die a-
Diversität umfasst die Vielfalt der operativen taxonomischen Einheiten (OTUs), das heißt
Gruppen aus Mikroorganismen mit ähnlicher 16S-rDNA, die innerhalb einer Probe
enthalten sind. Die Beta-Diversität hingegen gibt die Unterschiede zwischen den einzelnen
Proben an.
3.3.1 a-Diversität
Die Vielfalt innerhalb einer Stuhlprobe lässt sich über den Simpson- oder Shannon-Index
bestimmen. In unserer Studie ergaben sich sowohl mit dem Shannon-Diversitäts-Index (p
= 0,115) als auch mit dem Simpson-Diversitäts-Index (p = 0,199; siehe Abbildung 3 C)
ähnliche Werte. Damit unterscheidet sich die a-Diversität des intestinalen Mikrobioms in
der ALS-Gruppe nicht von der Kontrollgruppe.
3.3.2 b-Diversität
Um die Ähnlichkeit zwischen den einzelnen Proben zu bestimmen, führten wir eine
Hauptkoordinatenanalyse der Bray-Curtis dissimilarity matrix durch. Wie in Abbildung 3 D
dargestellt, unterscheiden sich ALS-Patienten hinsichtlich der Vielfalt der einzelnen Proben
nicht von gesunden Kontrollpersonen. Die b-Diversität ist in beiden Gruppen ähnlich. Auch
in der Permutational multivariate - Analyse fanden sich keine signifikanten Unterschiede
(R2 = 0,02; p = 0,42) zwischen ALS-Patienten und gesunden Probanden.
20
Carolin AdisErgebnisse
Abbildung 3: Diversität des fäkalen Mikrobioms
Die Abbildung zeigt die Diversität des fäkalen Mikrobioms von ALS-Patienten und gesunden Kontrollen im
Vergleich, gesammelt am Universitätsklinikum Ulm im Zeitraum von Oktober 2015 bis September 2016.
(C) Analyse der alpha-Diversität mittels Simpson-Diversitäts-Index (p = 0,199); (D) Hauptkoordinatenanalyse
mittels Bray-Curtis dissimilarity matrix (R2 = 0,02; p = 0,42); Es zeigten sich keine signifikanten Unterschiede
in der Vielfalt zwischen den beiden Gruppen.
ALS = Amyotrophe Lateralsklerose; HC = healthy controls; PC1/2 = principal coordinate 1/2 [9] (Abdruck mit
freundlicher Genehmigung von Elsevier)
21
Carolin AdisErgebnisse
3.4 Relative Häufigkeit von bakteriellen Taxa
Durch Sequenzierung der markierten hypervariablen V3-V6 Regionen des 16S rRNA-Gens
wurden phylogenetische Profile des Darmmikrobioms erzeugt. Anschließend wurden die
relativen Häufigkeiten verschiedener OTUs beziehungsweise Taxa in den jeweiligen
Gruppen (ALS- und Kontrollgruppe) auf den verschiedenen taxonomischen Ebenen
(Stamm, Klasse, Ordnung, Familie, Spezies) miteinander verglichen. Die Bonferroni- und
FDR-Methode wurde verwendet, um Mehrfachvergleiche zu korrigieren.
Übereinstimmend mit bisherigen Mikrobiom-Studien bestätigte sich auch in unserer Studie
die hohe interindividuelle Variabilität sowohl innerhalb der ALS- als auch der
Kontrollgruppe. Abseits einem zwischen ALS-Patienten und Kontrollprobanden signifikant
unterschiedlichem Anteil an nicht kultivierbaren Ruminococcaceae (Stamm: Firmicutes,
Klasse: Clostridia, Ordnung: Clostridiales) auf Genus-Ebene (p = 0,027), zeigten sich
zwischen ALS-Patienten und Kontrollprobanden keine signifikanten Veränderungen in der
Dichte der OTUs bzw. veränderten Taxa (Abbildung 8). Der Anteil an Ruminococcaceae
stellt lediglich 1 von 336 auf Genus-Ebene detektierten mikrobiellen Spezies dar. Auch das
Verhältnis von Firmicutes zu Bacteroidetes unterschied sich nicht zwischen ALS-Patienten
und Kontrollprobanden (p = 0,46). Eine genaue Darstellung der relativen Häufigkeiten von
OTUs auf verschiedenen taxonomischen Ebenen können aus Abbildung 4, Abbildung 5,
Abbildung 6 und Abbildung 7 entnommen werden. Für weitere statistische Analysen siehe
Anhang 5 (7.5 Single relative abundances of bacterial taxa from ALS patients and HC at
the different taxonomic levels).
22
Carolin AdisErgebnisse
Abbildung 4: Verteilung bakterieller Taxa auf Stamm-Ebene
Im Vergleich die relative Vielfalt der einzelnen Mikroorganismen in Bezug auf ihren Stamm zwischen ALS-
Patienten und gesunden Probanden. Die Verteilung der bakteriellen Taxa blieb ohne statistisch signifikante
Unterschiede zwischen den beiden Gruppen. Die Proben wurden am Universitätsklinikum Ulm im Zeitraum
von Oktober 2015 bis September 2016 gesammelt.
ALS = amyotrophe Lateralsklerose, HC = healthy controls [9] (Abdruck mit freundlicher Genehmigung von
Elsevier)
23
Carolin AdisErgebnisse
Abbildung 5: Verteilung bakterieller Taxa auf Klassen-Ebene
Im Vergleich die relative Vielfalt der einzelnen Mikroorganismen in Bezug auf ihre Klasse zwischen ALS-
Patienten und gesunden Probanden. Die Verteilung der bakteriellen Taxa blieb ohne statistisch signifikante
Unterschiede zwischen den beiden Gruppen. Die Proben wurden am Universitätsklinikum Ulm im Zeitraum
von Oktober 2015 bis September 2016 gesammelt.
ALS = amyotrophe Lateralsklerose, HC = healthy controls [9] (Abdruck mit freundlicher Genehmigung von
Elsevier)
24
Carolin AdisErgebnisse
Abbildung 6: Verteilung bakterieller Taxa auf Ordnungs-Ebene
Im Vergleich die relative Vielfalt der einzelnen Mikroorganismen in Bezug auf ihre Ordnung zwischen ALS-
Patienten und gesunden Probanden. Die Verteilung der bakteriellen Taxa blieb ohne statistisch signifikante
Unterschiede zwischen den beiden Gruppen. Die Proben wurden am Universitätsklinikum Ulm im Zeitraum
von Oktober 2015 bis September 2016 gesammelt.
ALS = amyotrophe Lateralsklerose, HC = healthy controls [9] (Abdruck mit freundlicher Genehmigung von
Elsevier)
25
Carolin AdisErgebnisse
Abbildung 7: Verteilung bakterieller Taxa auf Familien-Ebene
Im Vergleich die relative Vielfalt der einzelnen Mikroorganismen in Bezug auf ihre Familie zwischen ALS-
Patienten und gesunden Probanden. Die Verteilung der bakteriellen Taxa blieb ohne statistisch signifikante
Unterschiede zwischen den beiden Gruppen. Die Proben wurden am Universitätsklinikum Ulm im Zeitraum
von Oktober 2015 bis September 2016 gesammelt.
ALS = amyotrophe Lateralsklerose, HC = healthy controls [9] (Abdruck mit freundlicher Genehmigung von
Elsevier)
26
Carolin AdisErgebnisse
Abbildung 8: Verteilung der bakteriellen Taxa auf Genus-Ebene
Im Vergleich die relative Vielfalt der einzelnen Mikroorganismen in Bezug auf ihr Genus zwischen ALS-
Patienten und gesunden Probanden. Die Verteilung der bakteriellen Taxa blieb außer dem signifikant
unterschiedlichen Anteil an nicht kultivierbaren Ruminococcaceae (Stamm: Firmicutes, Klasse: Clostridia,
Ordnung: Clostridiales; p = 0,027) auf Genus-Ebene ohne signifikante Unterschiede zwischen den beiden
Gruppen. Die Proben wurden am Universitätsklinikum Ulm im Zeitraum von Oktober 2015 bis September
2016 gesammelt.
ALS = amyotrophe Lateralsklerose, HC = healthy controls [9] (Abdruck mit freundlicher Genehmigung von
Elsevier)
27
Carolin AdisErgebnisse
3.5 Vorhersage des Metagenoms
Als Metagenom wird die Gesamtheit-DNA der Mikroorganismen einer Lebensgemeinschaft
bezeichnet. Die Vorhersage des Metagenoms („predicted metagenome“) liefert
Informationen über Quantität und Funktion des bakteriellen Metabolismus eines
Mikrobioms. Zur Analyse des Metagenoms wurde die PiCrust Software [36] zusammen mit
unserem 16S-Datensatz und einer Referenzdatenbank (greengenes 16S rDNA database
version 13.5) verwendet. Anhand dieser lassen sich Gesamt-Metagenom-Sequenzen und
die darin kodierten Gene vorhersagen. Die Ergebnisse wurden mittels Bonferroni und FDR
auf multiple Testung korrigiert. In Abbildung 9 und Abbildung 10 werden in heatmaps die
vorhergesagten KEGG Orthologe in zwei verschiedenen Ebenen (Level 2 und 3)
zusammengefasst [32]. Die Analyse des predicted metagenome ergab keine signifikanten
Unterschiede zwischen ALS-Patienten und gesunden Kontrollen. Siehe Anhang 6: PICRUSt
predicted metagenomes of ALS patients and HC für statistische Analyse.
28
Carolin AdisErgebnisse
Abbildung 9: Vorhersage des Metagenoms auf Level 2
Die Darstellung der vorhergesagten KEGG Orthologen (Level 2, functional categories) mittels heat map zeigt
keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Gruppen. Bakterieller Schwerpunkt liegt vor allem im
Bereich des Membrantransports sowie dem Stoffwechsel von Kohlenhydraten und Aminosäuren. Die zur
Auswertung benötigten Proben wurden am Universitätsklinikum Ulm im Zeitraum von Oktober 2015 bis
September 2016 gesammelt.
ALS = amyotrophe Lateralsklerose, HC = healthy controls [9] (Abdruck mit freundlicher Genehmigung von
Elsevier)
29
Carolin AdisErgebnisse
Abbildung 10: Vorhersage des Metagenoms auf Level 3
Die mittels heat map dargestellten vorhergesagten KEGG Orthologen (Level 3, biochemical pathways) zeigten
keine signifikanten Unterschiede zwischen den ALS-Patienten und den gesunden Probanden. Das
vorhergesagte Metagenom ist demnach bei ALS-Patienten nicht verändert. Die zur Auswertung benötigten
Proben wurden am Universitätsklinikum Ulm im Zeitraum von Oktober 2015 bis September 2016. gesammelt.
ALS = amyotrophe Lateralsklerose, HC = healthy controls [9] (Abdruck mit freundlicher Genehmigung von
Elsevier)
30
Carolin AdisDiskussion
4 Diskussion
4.1 Zusammenstellung und Bedeutung der Ergebnisse
Bei diversen neurologischen Erkrankungen konnten bereits Veränderungen des
Mikrobioms nachgewiesen werden [5, 27, 31, 51, 59, 62], während noch keine ausreichend
große Kohorte an ALS-Patienten diesbezüglich untersucht wurde. In Tiermodellen wurde
zudem gezeigt, dass die Zusammensetzung der Darmflora Proteinopathien (beta-Amyloid,
alpha-Synuclein) beeinflussen kann. Die ALS kennzeichnet sich in der Mehrzahl der Fälle
durch eine TDP-43-Proteinopathie, die vermutlich pathophysiologisch relevant ist.
Angesichts dieser Zusammenhänge erschien uns eine Analyse des intestinalen Mikrobioms
bei ALS-Patienten gerechtfertigt. Ziel unserer Studie war es festzustellen, ob sich das
intestinale Mikrobiom zwischen ALS-Patienten und gesunden Personen unterscheidet.
Mittels Messung der Biodiversität, Quantifizierung der Taxa auf verschiedenen
taxonomischen Ebenen und Analyse des vorhergesagten Metagenoms konnten wir zeigen,
dass ALS-Patienten keine wesentlichen Veränderungen im intestinalen Mikrobiom
aufweisen.
Mittels Echtzeit-PCR (qPCR) konnte eine ähnliche Anzahl an 16S-rRNA-Kopien (etwa 211
Kopien) in beiden Gruppen (Gesunde und Kranke) identifiziert werden. Abgesehen von den
Unterschieden in der Häufigkeit und Vielfalt der OTUs einer einzigen Spezies (von 336
nachgewiesenen Arten), konnten in unserer Studie keine signifikanten quantitativen oder
qualitativen Unterschiede des fäkalen Mikrobioms zwischen den beiden Gruppen
festgestellt werden. Auch im predicted metagenome ergaben sich keine signifikanten
Unterschieden zwischen ALS-Patienten und Kontrollen. Unseren Daten zufolge ist ALS
somit nicht mit einer wesentlich veränderten Zusammensetzung des intestinalen
Mikrobioms assoziiert.
Der ermittelte Simpson-Index lässt auf eine sehr ähnliche Bakterienvielfalt innerhalb einer
Stuhlprobe schließen. Entsprechende Ergebnisse zeigten sich auch aus dem Vergleich der
beiden Gruppen und der Berechnung der b-Diversität. Die mikrobielle Zusammensetzung
der erkranken Probanden weicht schließlich nicht wesentlich von denen der Gesunden ab.
31
Carolin AdisDiskussion
Allgemein können ca. 80% der identifizierten Mikroorganismen in drei Phyla unterteilt
werden: Bacteroidetes, Firmicutes und Actinobacteria. Der Firmicutes-Teil nimmt dabei
den größten Anteil an. Speziell das Verhältnis von Firmicutes zu Bacteroidetes spielt bei der
Gesundheit des Menschen eine wesentliche Rolle [43]. Probanden mit erhöhtem
Firmicutes-Anteil tendieren zu einer erhöhten Kalorienaufnahme, welche meist mit einem
erhöhtem BMI und Adipositas einhergeht. Ein zu erwartendes vermindertes Verhältnis von
Firmicutes zu Bacteroidetes konnte nicht signifikant nachgewiesen werden.
Ähnliche Metagenomprofile in beiden Gruppen zeigten auch auf funktioneller Ebene
keinen Einfluss von ALS auf das Mikrobiom und umgekehrt. Wie in vielen Mikrobiom-
Studien [1] bereits erforscht, bestätigte sich auch hier eine hohe inter-individuelle
Variabilität. Das intestinale Mikrobiom variiert sehr stark zwischen den einzelnen
Individuen und besitzt viele teilweise noch unbekannte Einflussfaktoren [24]. Eine der
Stärken unserer Studie ist deshalb die strikte Auswahl von ALS-Patienten mit noch hohem
ALSFRS-R-Score ohne offensichtliche bulbäre oder respiratorische Symptome, um den
Einfluss von Störfaktoren zu minimieren.
Als mögliche Fehlerquellen unserer Studie lassen sich vor allem eine nicht sachgemäße
Entnahme der Stuhlproben mit der daraus resultierenden Kontamination der Proben durch
Kontakt mit Urin oder dem nicht sterilen Auffanggehäuse, sowie eine nicht
unterbrechungsfreie Aufbewahrung der Proben bei -80°C hervorheben.
Ebenso schwer prüfbar ist die Richtigkeit der Probandenangaben. So können fehlerhafte
oder mangelnde Angaben der Probanden zur gesundheitlichen Vorgeschichte zum
vermeintlichen Einschluss in die Studie geführt haben, obwohl klare Ausschlusskriterien
vorgelegen hätten. Darüber hinaus spielen vermutlich auch Kriterien eine Rolle, die bislang
noch unbekannt und unerforscht sind. Trotz diverser Studien, die sowohl die
Einflussfaktoren auf die Zusammensetzung des intestinalen Mikrobioms als auch dessen
Einfluss auf die Pathogenese von neurodegenerativen Erkrankungen beschreiben, bleibt
das exakte Ausmaß bei ALS weiterhin schwer zu quantifizieren.
Es ist außerdem nicht auszuschließen, dass das von uns gewählte Studienkollektiv zu klein
für das Auftreten von signifikanten Unterschieden gewesen ist.
32
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