Förderung der Regeneration von Defekten der porzinen Schädeldecke durch die lokale Anwendung von exogenen Wachstumsfaktoren
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Förderung der Regeneration von Defekten der porzinen
Schädeldecke durch die lokale Anwendung von exogenen
Wachstumsfaktoren
Mund-, Kiefer-, Gesichtschirurgische Klinik
der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades
Dr. med. dent.
vorgelegt von
Franz Köhler
Als Dissertation genehmigt
von der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Vorsitzender des
Promotionsorgans: Prof. Dr. Markus F. Neurath
Gutachter*in: Prof. Dr. Stephan Eitner
Prof. Dr. Karl Andreas Schlegel
Tag der mündlichen Prüfung: 13. April 2021
Meinen Eltern und Großeltern in Liebe und Dankbarkeit gewidmet
Inhaltsverzeichnis
I. Zusammenfassung ______________________________________________ 6
1. Hintergrund und Ziele ________________________________________________ 6
2. Material und Methoden _______________________________________________ 6
3. Ergebnisse __________________________________________________________ 7
4. Praktische Schlussfolgerungen _______________________________________ 7
II. Summary________________________________________________________ 8
1. Background and Aims ________________________________________________ 8
2. Material and Methods ________________________________________________ 8
3. Results ______________________________________________________________ 9
4. Practical Conclusions ________________________________________________ 9
III. Einleitung ____________________________________________________ 10
IV. Ziele und Fragestellung der Arbeit _____________________________ 13
V. Material und Methode ___________________________________________ 14
1. Herstellung der Mikropartikel ________________________________________14
2. Versuchstier ________________________________________________________15
3. Operation __________________________________________________________17
4. Untersuchungszeitpunkte ___________________________________________20
5. Aufbereitung der Prüfkörper _________________________________________20
6. Trenndünnschliffverfahren nach Donath und Breuner __________________23
7. Mikroradiographie __________________________________________________24
8. Mikroradiographische Analyse _______________________________________25
9. Histologie: Toluidinblau-O-Färbung __________________________________27
10. Immunhistochemie________________________________________________30
10.1 Erstellen der Feinschnitte _________________________________________30
10.2 Färbevorgang ____________________________________________________31
10.3 Immunhistochemische Analyse ____________________________________32
11. Statistische Analyse_______________________________________________33
VI. Ergebnisse ___________________________________________________ 34
1. Ossäre Regeneration ________________________________________________34
1.1 Ossäre Regeneration des Defektbereiches am 14. postoperativen Tag34
1.2 Messwerte _______________________________________________________35
1.3 Ossäre Regeneration des Defektbereiches am 28. postoperativen Tag35
1.4 Messwerte und Signifikanzanalyse _________________________________36
2. Dichte des De-novo-Knochens _______________________________________36
2.1 Dichte des De-novo-Knochens am 14. postoperativen Tag ___________36
2.2 Messwerte _______________________________________________________37
2.3 Dichte des De-novo-Knochens am 28. postoperativen Tag ___________37
2.4 Messwerte und Signifikanzanalyse _________________________________38
3. Knochen-Implantat-Kontakt _________________________________________39
3.1 Knochen-Implantat-Kontakt am 14. postoperativen Tag (Defektbereich)
39
3.2 Knochen-Implantat-Kontakt am 14. postoperativen Tag (ortsständiger
Knochen) _______________________________________________________________40
3.3 Messwerte _______________________________________________________41
3.4 Knochen-Implantat-Kontakt am 28. postoperativen Tag (Defektbereich)
42
3.4 Knochen-Implantat-Kontakt am 28. postoperativen Tag (ortständiger
Knochen) _______________________________________________________________43
3.5 Messwerte und Signifikanzanalyse _________________________________44
4. Immunhistochemie __________________________________________________45
4.1 Blutgefäße pro mm² im Defektbereich am 14. postoperativen Tag ____45
4.2 Messwerte _______________________________________________________46
4.2 Blutgefäße pro mm² im Defektbereich am 28. postoperativen Tag ____49
4.3 Messwerte _______________________________________________________50
VII. Diskussion ___________________________________________________ 53
VIII. Fazit _________________________________________________________ 59
IX. Literaturverzeichnis ___________________________________________ 60
X. Abkürzungsverzeichnis _________________________________________ 72
XI. Anhang ______________________________________________________ 74
1. Verfahren zur Herstellung und Verwendung der Gebrauchslösungen ___74
1.1 Fixation durch 1,4%-iges PFA ______________________________________74
1.2 Dehydration, Intermedium, Präinfiltration, Infiltration ________________74
1.3 Herstellung der Gebrauchslösung aus Technovit 9100 NEU __________75
1.4 Rezept Toluidinblau-O-Lösung _____________________________________75
1.5 Färbeprotokoll Toluidinblau-O-Lösung _____________________________76
1.5 Färbeprotokoll von-Willebrand-Faktor ______________________________76
XII. Danksagung ____________________________________________________ 78
6 I. Zusammenfassung 1. Hintergrund und Ziele Zahnimplantate werden routinemäßig zur Rekonstruktion von zahnlosen oder teilweise zahnlosen Kiefern mit vorhersehbarem Erfolg eingesetzt und bieten langfristige Stabilität. Dennoch können lokale Knochendefizite, aufgrund von dentoalveolarer Atrophie, Tumoren oder Traumata, den klinischen Nutzen und Erfolg von Zahnimplantaten beeinträchtigen. Ziel dieser Studie war es die Heilung von, mit thrombozytären Mikropartikeln angereicherten, periimplantären Defekten in Bezug auf die Fragestellung zu bewerten, ob Mikropartikel die Knochenneubildung im periimplantären Defekt steigern, es zu einer Reosseointegration von Implantaten beim Vorliegen von Knochendefekten um das Implantat kommt und ob thrombozytäre Mikropartikel die Gefäßneubildung im Defektbereich fördern. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden bereits im Journal of Clinical Periodontology unter dem Titel „Bone Formation in Peri-Implant Defects Grafted with Microparticles: A Pilot Animal Experimental Study.“ (Moest, T., Koehler, F., Prechtl, C., Schmitt, C., Watzek, G., & Schlegel, K. A. (2014)) veröffentlicht [1]. 2. Material und Methoden Sechs Hausschweine erhielten neun standardisierte Defekte im Bereich des Os frontale. In die Mitte eines jeden Defekts wurde jeweils ein Implantat inseriert. Der Raum zwischen dem Implantat und der lateralen Knochenanteile wurde mit Mikropartikel-Pellets (n = 18) oder Mikropartikel-Überstand (n = 18) gefüllt oder für die Vergleichsprobe ungefüllt gelassen (n = 18). So ergeben sich insgesamt 54 Defekte, die es zu bewerten galt. Nach 14 und 28 Tagen wurden jeweils drei der sechs Tiere geopfert und Proben zur weiteren Verarbeitung für das Dünnschliffverfahren nach Donath und Breuner entnommen. Die Proben wurden mikroradiographisch und histologisch, im
7 Hinblick auf Knochenneubildung sowie Knochen-Implantat-Kontakt im Defekt kritischer Größe, analysiert. Zusätzlich wurden die Objektträger immunhistochemisch auf den Anti-von-Willebrand-Faktor, als Marker für die Angiogenese, gefärbt. 3. Ergebnisse Bei Knochenregeneration und Gefäßbildung kann die Nullhypothese teilweise verworfen werden. Nach 14 und 28 Tagen wurde innerhalb der Gruppen kein signifikanter Unterschied hinsichtlich der De-novo-Knochenbildung, der Knochendichte und der Osseointegration beobachtet. Zu beiden Opferungszeitpunkten wurde jedoch eine signifikante Gefäßneubildung festgestellt. Mikropartikel stellen somit eine vielversprechende Behandlungsoption dar, um die Bildung von Gefäßen im periimplantären Bereich zu beschleunigen. 4. Praktische Schlussfolgerungen Aufgrund des knappen Versuchszeitraums von 28 Tagen werden jedoch weitere Studien erforderlich sein, um die regenerativen Eigenschaften thrombozytärer Mikropartikel - vor allem im Hinblick auf die Knochenneubildung - genauer zu untersuchen, damit dieses Vorgehen für den klinischen Einsatz etabliert werden kann.
8 II. Summary 1. Background and Aims Dental implants are routinely used for the reconstruction of edentulous or partially edentulous jaws with predictable success and long-term stability. Nevertheless, local bone deficiencies due to dentoalveolar atrophy, tumour or trauma can compromise the clinical use and success of dental implants. This study aimed to evaluate the healing of peri-implant defects grafted with thrombocytic microparticles with regard to the question whether microparticles increase new bone formation in the peri-implant defect, re-osseointegration of the implant surface in the presence of peri-implant bone defects and whether microparticles stimulate vascularization in the defect area. The results of this study have already been published in the Journal of Clinical Periodontology under the title „Bone Formation in Peri-Implant Defects Grafted with Microparticles: A Pilot Animal Experimental Study.“ (Moest, T., Koehler, F., Prechtl, C., Schmitt, C., Watzek, G., & Schlegel, K. A. (2014)) [1]. 2. Material and Methods Six domestic pigs received nine standardized defects at the calvaria, in which an implant was inserted in the middle of each defect. The space between the implant and lateral bone portion was filled with microparticle pellets (n = 18) or microparticle supernatant (n = 18) or were left unfilled (n = 18). This resulted in a total of 54 defects that had to be evaluated. After 14 and 28 days, three animals were sacrificed, and specimens removed for further processing after the thin section method according to Donath and Breuner. Samples were microradiographically and histologically analysed regarding new bone formation and bone-implant contact in a critical size defect. In addition, the samples were immunohistochemically stained for anti-von-Willebrand-Faktor as a marker of angiogenesis.
9 3. Results In the case of bone regeneration and vessel formation, the null hypothesis can be partially rejected. After 14 and 28 days, no significant difference was observed within groups regarding de novo bone formation, bone density and osseointegration. However, superior vessel formation was found at both time points. Microparticles represent a promising treatment option to accelerate peri-implant vessel formation. However, due to the short test period of 28 days, further studies are needed to investigate the regenerative properties of thrombocytic microparticles, especially regarding to new bone formation, more precisely in order to establish this procedure for clinical use. 4. Practical Conclusions Microparticles represent a promising treatment option to accelerate peri-implant vessel formation. However, due to the short test period of 28 days, further studies are needed to investigate the regenerative properties of thrombocytic microparticles, especially regarding to new bone formation, more precisely in order to establish this procedure for clinical use.
10 III. Einleitung Stetig zunehmende Zahlen von Implantationen in der Zahnmedizin gehen mit steigenden Fällen infizierter Implantate einher [2]. Die Periimplantitis ist eine Erkrankung, die bei Implantatträgern auftreten kann. Sie zeichnet sich als einer der Hauptgründe für den Ausfall von dentalen Implantaten aus [3]. Ähnlich wie am gesunden Zahn können sich an Implantaten, sowie implantatgetragenem Zahnersatz, Beläge aus Bakterien, Essensresten oder Speichelbestandteilen ablagern. Werden diese Ablagerungen nicht gründlich, im Zuge der habituellen Mundhygiene, entfernt, kann zunächst eine reversible Mukositis entstehen [4, 5]. Mukositis ist ein entzündlicher Prozess, der sich auf das Weichgewebe im periimplantären Bereich begrenzt. Persistieren diese Beläge, kann es zum entzündlich bedingten Knochensubstanzverlust um das Implantat, der Periimplantitis (PI), kommen und im Anschluss der Verlust des Implantates erfolgen [6-8]. Klassische klinische Parameter wie BOP (= engl. Bleeding on Probing), Pusaustritt und typische kelchförmige Defekte im Knochen müssen für die PI- Diagnose geprüft werden [8-10]. Mukositis und PI stehen in enger Beziehung zu bakteriellen Biofilmen, die, neben den natürlichen Zahnoberflächen, die Oberflächen von Implantaten oder Abutments besiedeln können [11]. Abhängig vom Knochenabbau und der mechanischen Stabilität des Implantates, kann die Therapie von einer reinen Entzündungskontrolle bis zu regenerativen und augmentativen Therapieansätzen reichen, mit dem Ziel das Implantat erhalten zu können [4, 5, 10, 12]. Allerdings werden regenerative Therapieansätze, durch den Verlust von angrenzenden Knochenwänden, erheblich erschwert, was eine Erfolgsvorhersage problematisch macht [8]. Um den Verlust des Implantates zu verhindern wird die Entwicklung alternativer Therapiemöglichkeiten notwendig. Ein Weg könnte der lokale Einsatz von Mikropartikeln sein, die wiederum vesikuläre Membranbestandteile darstellen
11 [13]. Mikropartikel aus Thrombozyten sind gut erforscht und in der Literatur als vielseitig einsetzbar beschrieben [14-16]. Sie sind sowohl an der Fibrinolyse als auch an der Blutgerinnungskaskade beteiligt und haben Endothelzellen als potentielle Zielzellen, welche essentiell an der Angiogenese beteiligt sind [17-19]. Die Angiogenese ist ein zentraler Mechanismus der Knochenregeneration [20- 22]. Es wäre daher denkbar, dass, durch die lokale Anwendung von Mikropartikeln aus Thrombozyten, die Gefäßneubildung und damit auch die Knochenregeneration gefördert wird. Aktuelle Veröffentlichungen zeigen die Möglichkeiten der Mikropartikel in der regenerativen Medizin deutlich auf [23]. Ob jedoch die lokale Anwendung von Mikropartikeln die Regeneration von Knochendefekten begünstig, ist derzeit unklar. In einer früheren Studie zeigte sich ein positiver Effekt von thrombozytären Mikropartikeln auf Osteozyten [24]. Für knöcherne Rekonstruktionszwecke können Knochendefekte mit bestimmten Knochenersatzmaterialien gefüllt werden [25-28]. Allgemein sind Knochenersatzmaterialien hauptsächlich osteokonduktiv und weisen meist keine osteoinduktiven Eigenschaften auf. Die Verwendung von autologem Knochen als osteoinduktives Transplantatmaterial ist mit chirurgischen Risiken und Morbiditäten an der Spenderstelle verbunden und in ihrer Größe begrenzt [29]. Daher konzentrieren sich aktuelle Studien auf neue Anwendungen und Techniken zur Unterstützung der lokalen Gewebereparatur, insbesondere der De-novo-Knochenbildung bei implantatbezogenen Eingriffen [12, 30-32]. Die De-novo-Knochenbildung ist ein komplexer Mechanismus, der während simultan ablaufender Prozesse stattfindet. Thrombozyten stellen eine physiologische Barriere dar, die den Blutverlust einschränken und den Thrombinbildungsvorgang zur Intensivierung des Gerinnungsprozesses beschleunigen. Aufgrund der Freisetzung lokaler Mediatoren interagieren Thrombozyten mit dem Entzündungsprozess, der Wundheilung sowie der Gewebereparatur [33, 34]. Die Aktivierung der Thrombozyten durch physiologische Agonisten wie etwa Thrombin, Apoptose und mechanischem Stress führt auch zur Freisetzung
12 kleiner (1 mM) Membranvesikel von der Thrombozytenoberfläche durch Exozytose, sogenannter Mikropartikel (=engl. microparticle, MP). Endothelzellen, Leukozyten, Megakaryozyten und Erythrozyten können ebenfalls Mikropartikel aus ihren Plasmamembranen in den Kreislauf abgeben [35]. Thrombozytäre MP stellen jedoch die häufigsten MP im Blutstrom dar und machen etwa 70–90% der im Blutkreislauf vorhandenen MP aus [35, 36]. Studien zeigen, dass solche Mikropartikel auf unterschiedlichste Art und Weise mit ihrer Umgebung interagieren. Experimentelle Daten legen nahe, dass Thrombozyten eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der angeborenen und adaptierten Immunität, der Hämostase, der Thrombose sowie der Angiogenese einnehmen [17, 18, 37-39]. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Mikropartikel die mitogene Aktivität und die Proliferation von knochenbildenden Zellen stimulieren [24]. Die Angiogenese und die damit verbundene Aktivierung knochenbildender Zellen sind für die Regeneration des Hartgewebes unverzichtbare Prozesse. Es wurde mit diesem Projekt die Hypothese erhoben, dass die Anwendung von Mikropartikeln eine vielversprechende Methode zur Verbesserung der Regeneration von periimplantären Defekten darstellt. Ein positiver Befund könnte einen Beitrag zur zukünftigen Regeneration von periimplantären Defekten leisten. Des Weiteren wäre ein Einsatz in der Behandlung von parodontalen Knochendefekten und in der Versorgung von Frakturen denkbar.
13 IV. Ziele und Fragestellung der Arbeit Ziel der vorliegenden präklinischen Tierstudie war es, den Einfluss von Mikropartikeln auf Knochenneubildung, Knochendichte, die Osseointegration von Implantaten und Gefäßneubildung bei standardisierten, peripheren Periimplantatdefekten nach je 14 und 28 Tagen zu evaluieren. Durch das vorliegende Versuchsvorhaben soll somit geprüft werden, ob sich der Einsatz von Mikropartikeln bei periimplantären Defekten günstig auf die Regeneration auswirkt und damit in Zukunft - bei positivem Befund - entscheidenden Anteil an Therapievorhaben haben kann.
14 V. Material und Methode Um die gewünschten Daten im Vergleich der verschiedenen Versuchsgruppen zu erhalten, mussten die gewonnenen Proben histologisch mithilfe eines etablierten Großtiermodells aufbereitet werden. Das gewählte Modell gilt als sehr verlässlich in Bezug auf Aussagekraft, Reproduzierbarkeit und Übertragbarkeit auf den Menschen. 1. Herstellung der Mikropartikel Die Bereitstellung der MP-Präparate erfolgte durch die Bio-Products & Bio- Engineering AG (Wien, Österreich). Als Ausgangsmaterial werden humane Thrombozytenkonzentrate verwendet. Die Thrombozyten wurden durch Ultraschall aufgeschlossen, wobei sich spontan Mikropartikel ausbildeten. Nach der Zentrifugation bei 2000 g verblieben Mikropartikel im Überstand, gelangten aber auch in das Pellet. Beide Präparate enthalten demnach Mikropartikel und wurden getrennt voneinander in den Versuchsgruppen 1 und 2 einer Funktionskontrolle unterzogen (vgl. Abbildung 1 & 2). Als Träger für die Mikropartikel diente eine Fibrinmatrix (0,4%), die durch die Zugabe von Thrombin im Defekt entstand. Um die Fibrinmatrix zu stabilisieren wurd Aprotinin, einem Polypeptid zur Reduktion von Blutungen, zugesetzt [40].
15
Leerdefekt
(Kontrollgruppe)
Mikropartikel-
Überstand
(Versuchsgruppe 1)
Mikropartikel-Pellet
(Veruchsgruppe 2)
Abbildung 1: Defektplanung und Verteilung
Abbildung 2: Schematische Darstellung der
Defektkonfiguration im periimplantären Bereich am Beispiel
des MP-Überstands (Gruppe 1)
2. Versuchstier
Das Forschungsprojekt wurde vom landwirtschaftlichen Fachverwaltungsbüro
der Hauptstadt und Komitat Pest, Bereich Lebensmittelkettensicherheit und
Tiergesundheitsdirektion, Abteilung für Seuchen und Tierschutz genehmigt
(Reg.-Nr. 22.I/3879/003/2008, Budapest, Ungarn), genehmigt.16 Das Hausschwein (Sus scrofa domesticus) als Tiermodell ist, ebenso wie Schaf und Hund, für die experimentelle Knochenchirurgie und die Evaluation von Knochenheilungsprozessen geeignet [41-45]. Eine wichtige Voraussetzung ist, dass die morphologischen, anatomischen und physiologischen Gegebenheiten eines Versuchstieres möglichst eng mit den Bedingungen beim Menschen übereinstimmen, um tierexperimentell gewonnene Ergebnisse verlässlich auf den Menschen übertragen zu können. Ein essentieller Punkt hierbei sind die Knochenneubildungsraten bei Schweinen, die mit 1,2 – 1,5 µm/Tag ähnlich zu denen des Menschen (1 – 1,5 µm/Tag) sind [46, 47]. Damit ist die Geschwindigkeit der Knochenregeneration besser mit der des Menschen vergleichbar, als sie es beim Hund (1,5 – 2,0 µm/Tag) oder beim Schaf wäre, bei welchem die Knochenneubildungsrate das 2 bis 2,5-fache des Menschen beträgt. Auch mikroskopisch lassen sich hinsichtlich der Knochenstruktur zwischen der Dicke der Spongiosabälkchen (267 zu 276 µm) und dem Durchmesser der intertrabekulären Markräume (1418 zu 322 µm) in den Femur- bzw. Tibiametaphysen zwischen Mensch und Schwein geringere Unterschiede nachweisen als beispielsweise zwischen Mensch und Hund (267 zu 282 µm, bzw. 1418 zu 258 µm) [48]. Aus tierexperimentellen Untersuchungen zur Frakturheilung ist ferner bekannt, dass die Stabilisationsphase zur Frakturheilung beim Schwein mit fünf bis sechs Wochen der des Menschen am nächsten kommt, während die Stabilisationsphase beim Schaf nur zwei, beim Hund etwa drei bis vier Wochen beträgt [45, 49, 50]. Als Großtier bietet das Hausschwein damit eine gute Möglichkeit zur experimentellen Knochenchirurgie. Die Lokalisation des Os frontale bietet hierbei eine optimale Zugänglichkeit, mit der Folge einer möglichst kurzen Operationsdauer, sowie idealer mechanische Ruhe, sodass es in der Phase der Einheilung zu keiner mechanischen Alteration kommt. Es wurden 6 Tiere in den Versuch einbezogen. Diese wogen bei Anlieferung zwischen 30 kg und 40 kg. Nach Eintreffen der Tiere wurden diese für mindestens eine Woche an die neuen Tierstallbedingungen akklimatisiert. Im Tages- und
17 Nachtrhythmus wurden die Tiere in einem offenen, 6 m2 großen Raum bei einer Raumtemperatur von 18 ± 1° C gehalten. Die Schweine erhielten standardisiertes Schweinemastfutter (Garant - Tiernahrung GmbH, Pöchlarn, Österreich) und Wasser ad libitum. Während des gesamten Versuchszeitraums standen die Tiere unter fortwährender veterinärmedizinischer Kontrolle. Die Tiere wurden zweimal pro Woche gewogen und die Nahrung stetig an das Gewicht dieser angepasst. 3. Operation Jedes der 6 ausgewachsenen Hausschweine im vorliegenden Projekt erhielt eine präoperative Sedierung (Midazolam 1 mg/kg/KG) unter Einhaltung der Antisepsis. Der chirurgische Eingriff erfolgte nach intravenöser Injektion von Ketamin (Ketavet®, Pharmacia & Upjohn, Erlangen, Deutschland). Nach Applikation eines Lokalanästhetikums (Ultracain DS forte®, Hoechst GmbH, Frankfurt a. M., Deutschland) im Bereich des Os frontale erfolgte eine ca. 15 cm vertikale Schnittführung, um durch subperiostale Präparation das Stirnbein darzustellen. Mit Hilfe eines Trepanbohrers (1 x 1 cm, Tikom GmbH, Fürth, Deutschland) wurden 9 gleich große Knochendefekte (10 mm Durchmesser, 8 mm Tiefe) in 3 Reihen (á 3 Defekte) angelegt. Um eine standardisierte Defektvorbereitung zu gewährleisten, wurde die Defekttiefe stets mit einem Lineal kontrolliert. Die gewählten Defektgrößen stellen sich als kritisch dar [42, 51, 52] und wurden mit einem Abstand von mindestens 10 mm voneinander entfernt positioniert, um Wechselwirkungen untereinander zu vermeiden. Zentral in jedem Defektbereich erfolgte die Aufbereitung des Implantatbettes (Tiefe: 7 mm; Durchmesser: 3,4 mm). In jedem Defekt wurde zentral ein Implantat bis zu einer Tiefe von 7 mm eingebracht (Nobel Biocare Select Straight TiU NP 3,5 x 15 mm, Nobel Biocare AG, Kloten, Schweiz). Der Defektbereich um die Implantate wurde mit den jeweiligen MP-Präparaten randomisiert aufgefüllt bzw. leer belassen. Pro Versuchstier blieben dabei drei Defekte leer (Kontrollgruppe), drei Defekte wurden mit thrombozytären Mikropartikeln aus dem Zentrifugationsüberstand (Versuchsgruppe 1) und drei Defekte mit dem
18 Ultraschallhomogenisat, welches thrombozytäre Mikropartikel und andere lösliche und unlösliche Thrombozytenbestandteile beinhaltet (Versuchsgruppe 2), aufgefüllt (n = 18 pro Gruppe, vgl. Abbildung 1 – 6). Die Fibrinmatrix wurde unmittelbar vor der Anwendung, durch Zugabe von Thrombin zu einer Fibrinogenlösung, die die thrombozytären Mikropartikel enthält, erzeugt. Abschließend wurden das Periost sowie die Haut mehrschichtig durch resorbierbares Nahtmaterial verschlossen (Vicryl 3-0®, Vicryl 1-0®; Ethicon Inc., Sommerville, New Jersey, USA). Während der ersten drei postoperativen Tage erhielten die Tiere eine antibiotische Abschirmung (Streptomycin 0,5 g/Tag, Grühnental GmbH, Aachen, Deutschland). Während der Standzeit der Tiere wurden keine Wundheilungsstörungen bzw. Wunddehiszenzen beobachtet.
19 Abbildung 3: OP Schritt 1: Einheitliche Abbildung 4: OP Schritt 2: Darstellung Defektschaffung der Defekte Abbildung 6: OP Schritt 3: Präparation Abbildung 7: OP Schritt 4: Insertion der des Implantatbetts Implantate Abbildung 5: OP Schritt 5: Random- isiertes Auffüllen der Defekte
20 4. Untersuchungszeitpunkte Die Opferung der Tiere erfolgte an den Tagen 14 und 28 nach dem operativen Eingriff. Es wurden hierbei jeweils 3 der insgesamt 6 Tiere getötet. Zunächst erfolgte dabei die Injektion von Ketamin (10 mg/kg/KG) und Midazolam (1 mg/kg/KG) zur Sedierung der Tiere. Danach erfolgte die intravasale Injektion (Ohrvene) von 20%-iger Pentobarbitallösung (Dermocal AG, Buenos Aires, Argentinien) bis der Tod durch Herzstillstand eintrat. Die Kalotten der Tiere wurden danach sofort in toto entnommen, bei -80° C zur Zwischenlagerung eingefroren und dann im Folgenden entsprechend histologisch aufbereitet. Die gewählten Techniken und Methoden sind für das Tiermodell in der Arbeitsgruppe etabliert und mehrfach publiziert, was eine hervorragende Vergleichbarkeit mit vorausgegangenen Versuchen und somit anderen Methoden des Knochenersatzes ermöglicht [42, 53]. Defektschaffung Erstellen und und Insertion der 14 Tage: 28 Tage: Auswertung der Implantate/MP Opferung 1 Opferung 2 Proben Abbildung 8: Zeitlicher Ablauf der Pilotstudie/Dissertation 5. Aufbereitung der Prüfkörper Die sechs, bisher bei -80° C tiefgefrorenen, Kalotten, wurden zu Beginn aufgetaut und im Anschluss im Computertomographen der chirurgischen Abteilung des Universitätsklinikums Erlangen aus forensischen Gründen und zur Überprüfung
21 der Defektlage geröntgt. Zusätzlich wurden die Resektate zur erleichterten Defektauffindung mit einem Tischröntgengerät, (Faxitron R®, Faxitron X-Ray LLC., Lincolnshire, Illinois, USA) eine Präparatröntgenaufnahme angefertigt (40- 45 kV, 0,25 mA und 5 Minuten). Die Präparate wurden anschließend mithilfe eines Bandsägeapparats der Fa. Exakt (Exakt Apparatebau GmbH, Norderstedt, Deutschland) in für die Einbettung praktikable Proben separiert und zur Dehydrierung einer aufsteigenden Alkoholreihe ausgesetzt. Fixierung/Dehydrierung Dauer 1,4% PFA 4 Tage 1,4% PFA 3 Tage Aqua dest. 1 Tag 70% Alkohol 4 Tage 70% Alkohol 1 Tag 80% Alkohol 3 Tage 80% Alkohol 3 Tage 90% Alkohol 3 Tage 90% Alkohol 3 Tage 96% Alkohol 3 Tage 96% Alkohol 4 Tage 100% Alkohol 4 Tage 100% Alkohol 4 Tage 100% Alkohol 4 Tage 100% Alkohol 3 Tage Tabelle 1: Verfahren der aufsteigenden Alkoholreihe zur Entwässerung der Proben Hierfür wurden die Proben zunächst zur Fixierung über einen Zeitraum von 7 Tagen in 1,4%-igem Paraformaldehyd (PFA), bei 20° C (Raumtemperatur) gelagert und anschließend für einen Tag gewässert. Das PFA wurde einmal erneuert, da es durch die Bindung an die Proteine in den Knochenblöcken verbraucht wird.
22 Die Dehydrierung (vgl. Tabelle 1) erfolgte im Entwässerungsautomaten (Shandon Citadel 1000®, Shandon GmbH, Frankfurt, Deutschland). Zur Zwischenfixierung kam als Intermedium Xylol für 2 mal 2 Tage zum Einsatz. Die Immersion ist in drei Stufen erfolgt. Die Präinfiltration 1 fand im Entwässerungsautomaten, die Präinfiltrationen 2 und 3 sowie die Infiltration selbst, unter kontinuierlichem Rühren, bei 4° C statt. Ein Zeitintervall von 6 Tagen pro Medium, bei einer Probengröße von 1-2 cm3, hat sich hierbei bewährt. Die Proben wurden in Technovit® 9100 NEU (Heraeus-Kulzer, Abteilung Kulzer, Wehrheim, Deutschland), das sowohl einen quantitativen Nachweis von Knochenmatrixproteinen erlaubt, als auch für die von Donath und Breuner beschriebene Schneid- und Schleiftechnik geeignet ist, in speziellen Einbettformen letztlich eingebettet [54]. Technovit als Einbettmedium auf Methylmethacrylatbasis, mit seinem Katalysatorensystem aus Peroxid und Amin, zeichnet sich besonders dadurch aus, dass es, im Vergleich zu früheren Verfahren, kaltpolymerisiert und es damit zu keiner Denaturierung der nachzuweisenden Proteine für die Immunhistochemie, aufgrund hoher Temperaturentwicklungen bei der Polymerisation, kommt. Es erlaubt somit einen quantitativen Nachweis von Knochenmatrixproteinen. Die Auspolymerisation erfolgte durch Mischen der Stammlösungen A und B unter Ausschluss von Sauerstoff bei -8° C innerhalb von 2 Tagen. Nach der Fixierung wurden die Proben in der Mitte des Implantats mit einer Präzisionssäge in Längsachse geschnitten (Exakt 310®, Exakt Apparatebau GmbH, Norderstedt, Deutschland), so dass je eine Probe mit der Hälfte des Implantats inklusive randständigem Knochen und Gewerbe erhalten werden konnte. Eine Hälfte der Proben wurde für die mikroradiographische/ lichtmikroskopische Auswertung genutzt und die andere Hälfte später für die Immunhistochemie ausgewertet und vorerst zurückgelegt.
23 6. Trenndünnschliffverfahren nach Donath und Breuner Die Knochenimplantatblöcke wurden zuerst unter Verwendung einer speziellen Bandsäge (Exakt Apparatebau GmbH, Norderstedt, Deutschland) auf circa 2 mm Überstand, um die zur Auswertung relevanten Region, reduziert und danach durch Längsschnitt durch die Mitte des Defektbereichs in zwei Hälften geteilt (vgl. Abbildung 9). Der für die Mikroradiographie vorgesehene Teil wurde mit der Schnittfläche auf einem Objektträger mit Technovit® 4000 (Heraeus-Kulzer, Abteilung Kulzer, Wehrheim, Deutschland) und der Klebepresse (Exakt Apparatebau GmbH, Norderstedt, Deutschland) fixiert. Die so vorbereiteten Objektträger wurden in eine Präzisionsschleifmaschine (Exakt Deutschland, Norderstedt, Deutschland) gespannt und unter oszillierenden Bewegungen sowie Wasserkühlung, mit Schleifpapieren unterschiedlicher Körnung (800 - 4000) nach dem Trenndünnschliffverfahren nach Donath und Breuner, plan geschliffen und hochglanzpoliert [54]. Die Abweichungstoleranz der Objektstärke wurde hierbei mit einem Maximum von ± 5 μm - ermittelt mit einer Messlehre an 9 verschiedenen Stellen der Probe (Mitutoyo Europe GmbH, Neuss, Deutschland) - taxiert. Zur weiteren Verarbeitung wurden diese Objektträger mit der hochglanzpolierten Seite planparallel, mithilfe des lichthärtenden Kunststoffs Zyanoacrylats Technovit® 7210 (Heraeus-Kulzer, Abteilung Kulzer, Wehrheim, Deutschland) und der Präzisionsklebepresse, auf einen weiteren Plexiglasobjektträger aufgeklebt. Im folgenden Arbeitsschritt wurden von den Knochenproben mit dem Exakt-Trennsystem ca. 300 μm dünne Scheiben abgesägt. Abbildung 9: Eingebettete Probenhälfte zur Weiter- verarbeitung
24 7. Mikroradiographie Die Mikroradiographie diente der quantitativen Auswertung der Proben bezüglich der De-novo-Knochenbildung im Defekt kritischer Größe. Zunächst wurden hierfür die Objektträger mit der Präzisionsschleifmaschine auf 150-180 μm reduziert. Die Proben wurden anschließend im Faxitron-Tischröntgengerät für 6 min bei 13 kV und 2,5 mA geröntgt. Der Abstand zwischen Objektträger und Röntgenfilm (Eastman Kodak Company, Rochester, New York, USA) lag hierbei nahe Null, um ein bestmögliches Ergebnis für die Auflösung zu erzielen und mögliche Vergrößerungen zu vermeiden. Die Röntgenaufnahmen wurden mit einem Scanner (Epson Perfection 4900 Photo, Seiko Epson Corporation, Nagano, Japan) bei 2400 dpi und 8-Bit- Graustufen digitalisiert, mit Photoshop CS 2 (Adobe Corp., San Jose, California, USA) kontrastiert und nachbearbeitet und zur späteren Analyse im TIFF-Format gespeichert (vgl. Abbildung 10, 11). Abbildung 10: Abbildung 11: Mikroradiographie Mikroradiographie (Opferung 1, MP (Opferung 2, MP- Überstand) Überstand)
25 8. Mikroradiographische Analyse Die Periimplantäre Knochenbildung und Knochendichteraten wurden unter Verwendung von Mikroradiographien bewertet [55-59]. Für mikroradiographische Analysen wurde die Bioquant Osteo® Software 2013 v13.2.6 (BIOQUANT Image Analysis Corporation, Nashville, Tennessee, USA) verwendet. Mit Bioquant Osteo® kann histomorphometrisch der prozentuale Anteil spezifischer Farbspektren bzw. einzelner Graustufen eines TIFF-Images oder Ausschnitt dessen bestimmt werden. Vorher klar definierte Bereiche (= engl. ROI = Region Of Interest, vgl. Abbildung 12) können prozentual ausgewertet werden und geben somit Aufschluss über das Verhältnis Knochen zu Weichgewebe (Knochenappositionsrate, vgl. Abbildung 13) oder aber auch die Mineralisationsrate des neu gebildeten Knochens (vgl. Abbildung 14). Abbildung 12: Region Of Interest (ROI) Abbildung 13: Fläche neugebildeter Abbildung 14: Mineralisierter Anteil des Knochen neugebildeten Knochens
26 Die Mikroradiographien zeigten deutliche erkennbare Ränder der Defektpräparation zum Festlegen der ROI (Abb. 10-12), wobei der Anteil des neu gebildeten Knochens innerhalb des Defekts genau unterschieden und bewertet wurde. Der Anteil des neu gebildeten Knochens wurde in Prozent des gesamten Defektvolumens definiert. Die Knochendichte wurde anhand der neu gebildeten Knochenmasse und der mineralisierten Knochenfraktionen innerhalb des De- novo-Knochens untersucht und ebenso in Prozent angegeben. Abbildung 15: Neugebildeter Knochen in der ROI wurde markiert (grün) und sein Anteil mit Bioquant Osteo® berechnet. In diesem Beispiel beträgt er 84,70%
27 Abbildung 16: Mineralisation am neugebildeten Knochen in der ROI wurde markiert (grün) und sein Anteil mit Bioquant Osteo® berechnet. Im Beispiel beträgt dieser 48,49% 9. Histologie: Toluidinblau-O-Färbung Die Lichtmikroskopie ermöglicht eine qualitative Analyse der knöchernen Integration von Implantaten im lokalen und neugebildeten Knochen [60-64]. Die vorher geröntgten und eingescannten Schliffe wurden zur Weiterverarbeitung auf eine Dicke von 30 μm reduziert, hochglanzpoliert und unter konstanter Bewegung durch Nutzung eines Magnetrührers für 5 Minuten in eine 10%-ige H2O2-Lösung überführt. Um einheitliche Probengrößen für eine standardisierte Bewertung zu erhalten, wurde die Toleranz auf eine Dicke von ± 3 μm festgelegt (Mitutoyo Europe GmbH, Neuss, Deutschland). Nach dem Spülen unter kaltem, fließendem Wasser wurden die Proben 15 Minuten mit Toluidinblau-O gefärbt (Sigma- Aldrich, St. Louis, Missouri, USA). Überschüssiges Färbematerial wurde durch erneutes Spülen der Proben unter fließendem Wasser entfernt. Nach Trocknung der Proben wurden diese, um die Toluidin-O-Färbung zu fixieren, mit Technovit 7200® (Heraeus-Kulzer, Abteilung Kulzer, Werheim, Deutschland) beschickt und für 8 min unter Blaulicht auspolymerisiert.
28
Die lichtmikroskopische Untersuchung erfolgte unter einem Lichtmikroskop
®
(Axioskop , Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Deutschland), indem die Proben
mithilfe einer angeschlossenen Videokamera (QICAM FAST 1394, Teledyne
Qimaging, Surrey, British Columbia, Kanada), unter Verwendung des
Programms KS 300® (Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Deutschland), digitalisiert
und im TIFF-Format gespeichert wurden (vgl. Abbildung 15, 16).
Mineralisiertes Hartgewebe stellt sich ungefärbt bis blassblau dar. Zellen,
Zellkerne, Osteoidsäume, Kollagenfasern, Kittlinien und Weichgewebe färbten
sich in unterschiedlichen Blautönen. Mastzellgranula, Knorpelmatrix und frühe
Wundheilungsareale werden metachromatisch rotviolett gefärbt, verkalkte
Knorpelmatrix zeigte sich dunkelblau.
Die Auswertung erfolgte wiederum mit dem Programm Bioquant Osteo®. Ziel war
es den Knochen-Implantat-Kontakt (KIK = engl. BIC = Bone-Implant-Contact) zu
ermitteln. Hierfür wurde zunächst die im Defekt liegende Implantatoberfläche mit
100% taxiert. Im nachfolgenden Arbeitsschritt wurde die festgelegte
Implantatoberfläche als entweder mit Knochen bedeckt oder frei von Knochen
markiert. Dem Programm ist es damit möglich den Kontakt von Knochen und
Implantat in Relation zu setzen (Abbildung 20).
Im Versuchsvorhaben wurden 4 ROI definiert, jeweils 2 lateral links und rechts
im coronalen und apikalen Anteil des Implantats (vgl. Abbildung 19) [60-64].
Ein detailliertes Färbeprotokoll findet sich im Anhang.
Abbildung 17: Toluidinblau-O Abbildung 18: Toluidinblau-
Scan (Opferung 1, MP- O Scan (Opferung 2, MP-
Überstand) Überstand)29
ROI 1 ROI 2
ROI 3
ROI 4
Abbildung 19: Lokalisation der 4 ROI bei Toluidinblau-O Färbung
Abbildung 20: Auswertung einer ROI mit Bioquant OSTEO®. Die Implantatoberfläche
wurde bestimmt und mit Kontakt zu Knochen (grüne Linie am Implantat) oder frei von
Knochen (rote Linie am Implantat) markiert. Die Software ermittelt in diesem Beispiel
einen KIK von 3,12%30 10. Immunhistochemie Die Immunhistochemie ist das Sichtbarmachen und die Lokalisierung von Gewebsantigenen unter Nutzung der Komplexbildung durch Antikörperzugabe. Der im Versuchsvorhaben verwendete von-Willebrand-Faktor nimmt essentiell an der Blutgerinnungskaskade teil [65-67]. Durch Bindung an einen spezifischen Rezeptor auf der Thrombozytenoberfläche beteiligt er sich an der Thrombozytenadhäsion. Er findet sich als Protein im Blut, den Endothelzellen sowie in der subendothelialen Matrix der Blutgefäße [66]. Eine Anfärbung gegen diesen Faktor ermöglichte es die Bildung neuer Gefäße durch Angiogenese nachzuweisen. 10.1 Erstellen der Feinschnitte Bei der anfangs zurückgelegten, für die Immunhistochemie vorgesehenen, Hälfte jeder Probe wurden die Implantate unter Verwendung einer sich verjüngenden Flachzange nach der Präparation des coronalen Periimplantatanteils entfernt. Bei allen Eingriffen wurde mit höchster Sorgfalt darauf geachtet, dass der periimplantäre Knochen nicht beschädigt wurde. Die Proben wurden nach dem bereits beschriebenen Verfahren erneut in Technovit® 9100 NEU eingebettet und auf einen speziellen, auf die Halterung des Mikrotoms angepassten Kunststoffobjektträger, unter Verwendung von Technovit 3040 (Heraeus-Kulzer, Abteilung Kulzer, Werheim, Deutschland), geklebt. Schließlich wurden durch Verwendung eines Leica® Rotationsmikrotoms RM2265 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland) 3 μm dicke Schnitte angefertigt. Das genutzte Mikrotom ist vollautomatisch arbeitend, bei dem das schneidende Messer horizontal fest eingespannt ist und die gewünschten Feinschnitte durch fortwährende Vorschubbewegungen der Objektträger zum Messer, unter permanenter Benetzung mit 30%-igem Alkohol, gewonnen werden. Die Schnitte wurden vorsichtig, mithilfe eines Pinsels, auf den Objektträgern (Super Frost, Gerhard Menzel Glasbearbeitungswerk GmbH & Co.
31 KG, Braunschweig, Deutschland) zentral und geglättet platziert und mit 96%- igem Alkohol bedeckt. Im Anschluss wurden die Proben mit 0,025 mm dicker Polyethylenfolie (Kulzer GmbH, Hanau, Deutschland) fixiert und die übrige Flüssigkeit abschließend ausgepresst. Zur finalen Verwendung wurden die Objektträger für 24 Stunden bei circa 60° C in einer Spindelpresse gelagert, damit sich das restliche Ethanol verflüchtigen kann und im Anschluss die Polyethylenfolie entfernt werden konnte. 10.2 Färbevorgang Die Probenvorbereitung zur Färbung umfasste die Rehydratisierung mit absteigender Alkoholreihe in Ethanol (100%, 96%, 90% und 70% bis zu Aqua dest.), die Entacrylierung unter ständiger Bewegung in 2-Methoxyethylacetat (MEA, Merck Schuchardt oHG, Hohenbrunn, Deutschland) sowie die Entkalkung der knöchernen Strukturen in 10%-iger Ethylendiamintetraacetat (EDTA; DakoTM, Glostrup, Dänemark) bei einem pH-Wert von 7,4. Die Proben wurden im Anschluss in zwei Bäder aus destilliertem Wasser und Waschpuffer (Dako Wash Buffer х10, Code S3006, DakoTM, Glostrup, Dänemark) gegeben. Die Demaskierung der Zielantigene erfolgte in Citrat bei 99° C und einem pH-Wert von 6,0. Proteinvernetzungen, die durch die Formalinbindung entstanden sind, können somit aufgehoben werden. Zur Bestimmung der Gefäßneubildung wurden Gewebeschnitte mit gegen von- Willebrand-Faktor (vWF) gerichteten Primärantikörpern (Dako Deutschland GmbH , Hamburg, Deutschland; Konzentration 1:3000) immunologisch eingefärbt. Die Färbeverfahren wurden unter Verwendung der etablierten Streptavidin-Biotin-Methode, (LSAB = Labelled Strept Avidin Biotin), der Firma Dako (DakoTM, Glostrup, Dänemark) und eines Autostainers (Cytomation Autostainers plus, DakoTM, Glostrup, Dänemark) durchgeführt [68, 69]. Ein sekundärer Antikörper (Dako Deutschland GmbH, Deutschland) wurde zugegeben, um den Primärantikörper zu komplexieren. Schließlich ermöglichte die Zugabe des Strept-AB-Komplex/HRP (DAKO Deutschland GmbH, Deutschland) die Bindung des eigentlichen Farbstoffs. Die Entwicklung erfolgte
32
in 3-Amino-9-Ethylcarbazol (AEC+, DAKO Deutschland GmbH, Deutschland).
Das Verfahren wurde unter Verwendung einer Gegenfärbung mit nuklearem
Hämatoxylin (DakoTM S3301, Glostrup, Dänemark) abgeschlossen. Jede Probe
wurde von einer Negativkontrolle begleitet.
Detailierte Färbeprotokolle sind im Anhang zu finden.
10.3 Immunhistochemische Analyse
Die immunhistochemischen Färbungen wurden mithilfe des Lichtmikroskops
®
(Axioskop ) ausgewertet, indem die Proben mithilfe der am Mikroskop
angeschlossenen Videokamera (QICAM FAST 1394) und unter Verwendung des
Programms KS 300®, im TIFF-Format gespeichert wurden.
Als ROI wurden standardisierte Bildausschnitte innerhalb des neu gebildeten
Knochens im periimplantären Bereich der Knochendefekte ausgewählt (vgl.
Abbildung 21) [60-64]. Die durch vWF rosa bis blassrot und sich deutlich von
restlichen Geweben abgrenzenden, gefärbten Gefäße wurden in den jeweiligen
ROI gezählt und als Anzahl der Gefäße pro Quadratmillimeter ermittelt. Die
Auswertung erfolgte somit deskriptiv.
ROI 1
ROI 2
ROI 3
ROI 4
Abbildung 21: Scan vWF- Abbildung 22: Beispiel einer lichtmikroskopischen
Färbung mit exemplarischer Aufnahme zur deskriptiven Auswertung der
Lokalisation der ROI Blutgefäße (rot markiert)
(Opferung 2, MP-
Überstand)33 11. Statistische Analyse Die Ergebnisse wurden an das Tabellenkalkulationsprogramm Excel 2010® (Microsoft Corp., Redmond, Washington, USA) übermittelt. Zur graphischen Darstellung wurden arithmetische Mittelwerte und Standardabweichungen für jede Variable und Gruppe unter Verwendung des Tieres als statistische Einheit ermittelt (n = 3). Aufgrund der begrenzten Anzahl von Tieren wurden deskriptive statistische Analysen der bewerteten Parameter angewendet. Innerhalb der Versuchsgruppen erfolgten statistische Analysen mit Hilfe der univariaten Varianzanalyse (ANOVA) und einem Post-Hoc-Test (Bonferroni). Die statistischen Analysen wurden mit dem Statistikpaket IBM SPSS Statistics for Windows, Version 21.0 (IBM Corp., Armonk, New York, USA) durchgeführt. Ab einem Signifikanzniveau von p ≤ 0,05, gelten die Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen als statistisch signifikant.
34
VI. Ergebnisse
1. Ossäre Regeneration
1.1 Ossäre Regeneration des Defektbereiches am 14.
postoperativen Tag
Zum ersten Untersuchungszeitpunkt betrug die ossäre Regeneration in der
Kontrollgruppe (Leerdefekt) 34,08 (± 5,66) %. Bei der Verwendung des
Mikropartikel-Überstands betrug dieser Wert 29,91 (± 9,75) %. In der Gruppe, in
der Mikropartikel-Pellets eingebracht wurden, waren 28,88 (± 13,68) % des
Defektes mit De-novo-Knochen aufgefüllt.
Der Unterschied zwischen den Versuchsgruppen zeigte sich nicht signifikant.
100
Mittelwert neugebildeter Knochen in %
90
80
70
60
50
40 34,08
29,91 28,88
30
20
10
0
Leerdefekt Ueberstand Pellet
Versuchsgruppe
Graph 1: Ossäre Regeneration im Defektbereich am 14. postoperativen Tag35
1.2 Messwerte
Mittelwert in % Standardabweichung in %
Leerdefekt (Kontrollgruppe) 34,08 5,66
Mikropartikel-Überstand 29,91 9,75
Mikropartikel-Pellet 28,88 13,68
Tabelle 2: Ossäre Regeneration des Defektbereichs am 14. postoperativen Tag
1.3 Ossäre Regeneration des Defektbereiches am 28.
postoperativen Tag
In der Kontrollgruppe zeigte sich eine ossäre Regeneration von 61,53 (± 14,1) %
der Defektflächen. In den experimentellen Gruppen, in welchen Mikropartikel
eingebracht wurden, zeigten sich Werte von 68,49 (± 12,6) % (Mikropartikel-
Überstand) beziehungsweise 64,51 (± 15,11) % (Mikropartikel-Pellet)
Die Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen waren statistisch nicht
signifikant.
100
Mittelwert neugebildeter Knochen in %
90
80
68,49
70 64,51
61,53
60
50
40
30
20
10
0
Leerdefekt Ueberstand Pellet
Versuchsgruppen
Graph 2: Ossäre Regeneration im Defektbereich am 28. postoperativen Tag36
1.4 Messwerte und Signifikanzanalyse
Mittelwert in % Standardabweichung in %
Leerdefekt (Kontrollgruppe) 61,53 14,1
Mikropartikel-Überstand 68,49 12,6
Mikropartikel-Pellet 64,51 15,11
Tabelle 3: Ossäre Regeneration des Defektbereich am 28. postoperativen Tag
Versuchgruppe Versuchsgruppe p-Wert: p-Wert:
(14. Tage post OP) (28. Tage post OP)
Leerdefekt Mikropartikel Überstand 1,000 0,904
Mikropartikel Pellet 0,875 1,000
Mikropartikel Leerdefekt 1,000 0,904
Überstand Mikropartikel Pellet 1,000 1,000
Mikropartikel Leerdefekt 0,875 1,000
Pellet Mikropartikel Überstand 1,000 1,000
Tabelle 4: Signifikanzen (ossäre Regeneration)
2. Dichte des De-novo-Knochens
2.1 Dichte des De-novo-Knochens am 14. postoperativen Tag
Die Knochendichte des De-novo-Knochens im Defektbereich betrug in der
Kontrollgruppe 52,17 (± 10,89) %. In den experimentellen Gruppen zeigten sich
Werte von 52,77 (± 7,12) % (Mikropartikel-Überstand), beziehungsweise 42,84
(± 18,64) % (Mikropartikel-Pellet).
Ein signifikanter Unterschied zwischen den Versuchsgruppen konnte nicht
festgestellt werden.37
100
90
80
Mittelwert Knochendichte des
neugebildeten Knochen in %
70
60
52,17 52,77
50
42,84
40
30
20
10
0
Leerdefekt Ueberstand Pellet
Versuchsgruppe
Graph 3: Knochendichte im Defektbereich am 14. postoperativen Tag
2.2 Messwerte
Mittelwert in % Standardabweichung in %
Leerdefekt (Kontrollgruppe) 52,17 10,89
Mikropartikel-Überstand 52,77 7,12
Mikropartikel-Pellet 42,84 18,64
Tabelle 5: Knochendichte im Defektbereich am 14. postoeprativen Tag
2.3 Dichte des De-novo-Knochens am 28. postoperativen Tag
In der Kontrollgruppe zeigte sich eine Knochendichte von 59,48 (± 11,17) %. Bei
der Gruppe, in welcher der Mikropartikel-Überstand eingebracht wurde, betrug
dieser Wert 50,93 (± 13,69) %. Bei der Verwendung des Mikropartikel-Pellets
ergab sich der Wert für die Knochendichte mit 50,83 (± 7,41) %.
Signifikante Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen konnten nicht ermittelt
werden.38
100
90
Mittelwert Knochendichte des
neugebildeten Knochen in %
80
70
59,48
60
50,93 50,83
50
40
30
20
10
0
Leerdefekt Ueberstand Pellet
Versuchsgruppen
Graph 4: Knochendichte im Defektbereich am 28. postoperativen Tag
2.4 Messwerte und Signifikanzanalyse
Mittelwert in % Standardabweichung in %
Leerdefekt (Kontrollgruppe) 59,48 11,17
Mikropartikel-Überstand 50,93 13,69
Mikropartikel-Pellet 50,83 7,41
Tabelle 6: Knochendichte im Defektbereich am 28. postoperativen Tag39
Versuchgruppe Versuchsgruppe p-Wert: p-Wert:
(14. Tage post OP) (28. Tage post OP)
Leerdefekt Mikropartikel Überstand 1,000 0,904
Mikropartikel Pellet 0,411 1,000
Mikropartikel Leerdefekt 1,000 0,904
Überstand Mikropartikel Pellet 0,343 1,000
Mikropartikel Leerdefekt 0,411 1,000
Pellet Mikropartikel Überstand 0,343 1,000
Tabelle 7: Signifikanzen (Knochendichte)
3. Knochen-Implantat-Kontakt
3.1 Knochen-Implantat-Kontakt am 14. postoperativen Tag
(Defektbereich)
14 Tage nach dem Eingriff zeigte sich im Defektbereich der Kontrollgruppe
(Leerdefekt) ein Knochen-Implantat-Kontakt von 8,62 (± 7,24) %. In der Gruppe
in der der Mikropartikel-Überstand eingebracht wurde, betrug dieser Wert 6,34 (±
4,92) %, analog dazu im entsprechenden Bereich bei der Verwendung des
Mikropartikel-Pellets 7,15 (± 6,37) %.40
20
Mittelwert Knochen-Implantat-Kontakt
18
16
14
12
im Defekt
10
8,62
8 7,15
6,34
6
4
2
0
Leerdefekt Ueberstand Pellet
Versuchsgruppe
Graph 5: Knochen-Implantat-Kontakt im Defektbereich am 14. postoperativen Tag
3.2 Knochen-Implantat-Kontakt am 14. postoperativen Tag
(ortsständiger Knochen)
Im ortsständigen Knochen wurde bei der Kontrollgruppe ein Knochen-Implantat-
Kontakt von 65,72 (± 26,04) % gemessen. Bei den Gruppen, bei denen
Mikropartikel im Defektbereich inseriert wurden, betrug dieser Wert 65,47 (±
19,99) % (Mikropartikel-Überstand) beziehungsweise 58,50 (± 28,28) %
(Mikropartikel-Pellet).
Der ermittelte Unterschied zwischen den Versuchsgruppen ist nicht signifikant.41
100
Mittelwert Knochen-Implantat-Kontakt
im ortsstaendigen Knochen 90
80
70 65,72 65,47
58,5
60
50
40
30
20
10
0
Leerdefekt Ueberstand Pellet
Versuchsgruppe
Graph 6: Knochen-Implantat-Kontakt im ortsständigen Knochen am 14. postoperativen
Tag
3.3 Messwerte
Mittelwert in % Standardabweichung in %
Defekt- ortsständiger Defekt- ortsständiger
bereich Knochen bereich Knochen
Leerdefekt (Kontrollgruppe) 8,62 65,27 7,24 26,04
Mikropartikel-Überstand 6,34 65,47 4,92 19,99
Mikropartikel-Pellet 7,15 58,50 6,37 28,28
Tabelle 8: Knochen-Implantat-Kontakt am 14. postoperativen Tag42
Versuchgruppe Versuchsgruppe p-Wert: p-Wert:
(Defektbereich) (ortsständiger
Knochen)
Leerdefekt Mikropartikel Überstand 0,836 1,000
Mikropartikel Pellet 1,000 1,000
Mikropartikel Leerdefekt 0,836 1,000
Überstand Mikropartikel Pellet 1,000 1,000
Mikropartikel Pellet Leerdefekt 1,000 1,000
Mikropartikel Überstand 1,000 1,000
Tabelle 9: Signifikanzen (Knochen-Implantat-Kontakt 14 Tage post OP)
3.4 Knochen-Implantat-Kontakt am 28. postoperativen Tag
(Defektbereich)
Zum zweiten Opferungszeitpunkt waren im Defektbereich der Kontrollgruppe
9,36 (± 11,09) % der Implantatoberfläche in direktem Kontakt mit dem neu
gebildeten Knochen. In der Gruppe, in welcher der Mikropartikel-Überstand zum
Einsatz kam, wurde ein Knochen-Implantat-Kontakt von 9,78 (± 10,67) % im
Defektbereich gemessen. Bei der Verwendung des Mikropartikel-Pellets betrug
der entsprechende Wert 4,21 (± 5,28) %.43
30
Mittelwert Knochen-Implantat-Kontakt
25
20
im Defekt
15
9,36 9,78
10
5 4,22
0
Leerdefekt Ueberstand Pellet
-5
Versuchsgruppe
Graph 7: Knochen-Implantat-Kontakt im Defektbereich am 28. postoperativen Tag
3.4 Knochen-Implantat-Kontakt am 28. postoperativen Tag
(ortständiger Knochen)
Die Kontaktwerte im ortsständigen Knochen betrugen bei der Kontrollgruppe
60,17 (± 34,77) %, in der Gruppe, in welcher das Mikropartikel-Überstand
eingebracht wurde 73,23 (± 28,64) % und in der Gruppe, in der der Mikropartikel-
Pellet zum Einsatz kam 65,05 (± 27,37) %.
Es konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen
errechnet werden.44
Mittelwert Knochen-Implantat-Kontakt
im ortsstaendigen Knochen 100
80
73,23
65,05
60,17
60
40
20
0
Leerdefekt Ueberstand Pellet
Versuchsgruppe
Graph 8: Knochen-Implantat-Kontakt im ortsständigen Knochen am 28. postoperativen
Tag
3.5 Messwerte und Signifikanzanalyse
Mittelwert in % Standardabweichung in %
Defekt- ortsständiger Defekt- ortsständiger
bereich Knochen bereich Knochen
Leerdefekt (Kontrollgruppe) 9,36 60,17 11,09 34,77
Mikropartikel-Überstand 9,78 73,23 10,67 28,64
Mikropartikel-Pellet 4,22 65,05 5,28 27,37
Tabelle 10: Knochen-Implantat-Kontakt am 28. postoperativen Tag45
Versuchgruppe Versuchsgruppe p-Wert p-Wert
(Defektbereich) (ortsständiger
Knochen)
Leerdefekt Mikropartikel Überstand 1,000 0,611
Mikropartikel Pellet 0,320 1,000
Mikropartikel Leerdefekt 1,000 0,611
Überstand Mikropartikel Pellet 0,244 1,000
Mikropartikel Pellet Leerdefekt 0,320 1,000
Mikropartikel Überstand 0,244 1,000
Tabelle 11: Signifikanzen (Knochen-Implantat-Kontakt 28 Tage post OP)
4. Immunhistochemie
4.1 Blutgefäße pro mm² im Defektbereich am 14. postoperativen
Tag
Im Defektbereich betrug zum ersten Opferungszeitpunkt die Anzahl der
Blutgefäße pro mm² in der Kontrollgruppe 22 (± 4/mm²). Dem gegenüber stehen
die Gruppen mit Mikropartikel-Überstand bei der 20 Blutgefäße pro mm² (±
7/mm²) gezählt wurden, sowie die der Mikropartikel-Pellets mit 59 Blutgefäße pro
mm² (± 43/mm²).
Im Vergleich dazu finden sich im ortständigen Knochen 20 Blutgefäße pro mm²
(± 7/mm²).Sie können auch lesen
