Organspezifische molekulare Karzinogenese Kolonkarzinom - Prof. Dr. Gisela Keller Institut für Pathologie TU München
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Organspezifische molekulare Karzinogenese
Kolonkarzinom
Prof. Dr. Gisela Keller
Institut für Pathologie
TU München
gisela.keller@tum.de
Molekulare Karzinogenese - Kolonkarzinom
• Epidemiologie
• Modelle der Kolonkarzinogenese
• Tumorsuppressorgene und Onkogene
• Molekulare Klassifikation
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 1
Häufigkeit kolorektaler Karzinome Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 1
Kolorektale Karzinome in der BRD
57528 Neuerkrankungen im Jahr 2020
Frauen Männer
https://gco.iarc.fr/today/data/factsheets/populations/276-germany-fact-sheets.pdf
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 1
Estimated age-standardized incidence rates (World) in 2020, colorectum, both sexes, all ages
Welche Risikofaktoren gibt es?
• Ballaststoffarme Ernährung
• Bewegungsmangel
• Übergewicht
• Rauchen
• Alkohol
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 1
Adenome
• benigne Neoplasien des Drüsenepithels
• Jeder dritte bis fünfte Mensch > 60 Jahre hat ein
Adenom
• 5% der Adenome entwickeln sich im Verlauf von
10 Jahren zum Karzinom
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 1
Adenome - Kennzeichen
• exophytisches Wachstum
• Atypien der Kernmorphologie, Kernlagerung und
Epithelschichtung
Normales Tubuläres
Epithel Adenom
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 1
Adenom Karzinom Modified from www.sgpgi.ac.in/path/seminars/Image6.gi Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 1
Genetisches Modell der kolorektalen
Karzinogenese (Fearon-Vogelstein Modell)
• Veränderungen in 4 bis 6 Genen
• Veränderungen in einer präferentiellen Sequenz
• Akkumulation ist entscheidend
• Aktivierung von Onkogenen und Inaktivierung von
Tumorsuppressorgenen
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 2Akkumulation genetischer Veränderungen
in der Adenom-Karzinom-Sequenz
Fearon ER and Vogelstein B: A Genetic Model for Colorectal Tumorigenesis.
Cell 61:759-767, 1990Genetische Veränderungen in der
Adenom-Karzinom-Sequenz
APC
LOH 5q
Modifiziert nach: Vogelstein B. et al. 2013, Science 339:1546-1558
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 2Eigenschaften und Funktion des APC Gens
(adenomatöse Polyposis coli)
• Chromosom 5q21
• codiert für Protein aus 2843 As (ca. 8.5kb)
• multiple Funktionen
- Zelladhäsion, Migration
- Segregation der Chromosomen, genetische Stabilität
- Wnt-Signalweg
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 2Dickdarmepithel APC im Wnt-Signalweg Reya and Clevers (2005), Nature 434:843-850 Elisabeth Pennisi (1998), Science 281: 1438-1441
Eigenschaften und Funktion des APC Gens
(adenomatöse Polyposis coli)
• Chromosom 5q21
• codiert für Protein aus 2843 As (ca. 8.5kb)
• multiple Funktionen
- Zelladhäsion, Migration
- Segregation der Chromosomen, genetische Stabilität
- Wnt-Signalweg
• Tumorsuppressorgen
- Somatische Mutationen: 40-70% der Adenome und Karzinome
- Keimbahnmutationen: FAP-Syndrom (familiäre adenomatöse
Polyposis coli)
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 2Zwei-Hit-Inaktivierungstheorie von Tumor-
suppressorgenen (Knudson-Theorie, 1971)
1. Mutation
Keimbahn
1. Mutation 2. Mutation
somatisch somatisch
vererbbare Tumoren
2. Mutation
somatisch
sporadische Tumoren
aus: Alberts, Molekularbiologie der ZelleDarmpräparat
eines 30jährigen
FAP Patienten
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 2Familiäre Adenomatöse Polyposis Coli (FAP) • Keimbahnmutationen im APC-Gen • autosomal dominant vererbte Tumorerkrankung • > 100 Adenome im Kolon • hohes Karzinomrisiko • junges Erkrankungsalter • Häufigkeit: 1% der Kolonkarzinome Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 2
Genetische Veränderungen in der
Adenom-Karzinom-Sequenz
APC K-ras
LOH 5q
Modifiziert nach: Vogelstein B. et al. 2013, Science 339:1546-1558
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 3Onkogene • aktivierte Proto- onkogene • fördern Zell- proliferation Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 3
K-ras (Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) • somatische Mutationen - in 40-50% der Karzinome und Adenome (> 1cm) • G-Protein • Signaltransduktion (Rezeptor Tyrosinkinasen, z.B. EGFR = epidermal growth factor receptor) Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 3
Funktion und Aktivierung von K-ras Signaltransduktion Onkoprotein Gschwind et al. 5 :361-369, 2004.
Onkogene in kolorektalen Tumoren
• K-ras
– Mutationen in 40-50% der Karzinome und Adenome ( >1cm)
– G-Protein
– Signaltransduktion
• c-Myc
– Überexpression in bis 70% der Karzinome
– Transkriptionsfaktor
• EGFR
– Überexpression in 30-80% der Karzinome
– Rezeptor für Wachstumsfaktor EGF
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 3Rezeptor-Tyrosinkinasen als therapeutische Zielstruktur Gschwind et al. 5 :361-369, 2004.
Rezeptor-Tyrosinkinasen als therapeutische
Zielstruktur
Antikörper gegen EGFR:
Cetuximab
Behandlung metastasierender
Kolonkarzinome
Gschwind et al. 5 :361-369, 2004.K-ras Mutation und Therapieansprechen
Welche Patienten würden Sie mit Cetuximab
behandeln?
• Mit
oder
• ohne
aktivierende Mutation im K-ras
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 3K-ras Mutation und Therapieansprechen
89 Patienten mit metast. CRC
Therapie mit Cetuximab
K-ras Rezidiv-
nonmutated
freies -
muta-
ted Überleben
K-ras Gesamt-
mutated
nonmutated Überleben
Lievre, A. et al. JCO, 26:374-379 2008
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 3Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 3
Randomisierte Studie (n=394) • Cetuximab + „best supportive care“ versus • „best supportive care“ allein Ergebnis K-ras Mutationen: 42.3% Karapetis et al. 2008, New Engl J Med 359 Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 3
Mutationen in KRAS und NRAS modified: Douillard et al. 2013, N Engl J Med 369:1023-34 Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 3
KRAS G12C Inhibitor – Sotorasib
Sotorasib - KRK (n=62) mit KRAS G12C Mutation und
Sotorasib Monotherapie
bindet an Region der GTP–Bindungs-
stelle, die nur bei G12C Mutation in
der inaktiven Form vorhanden ist und
blockiert Übergang in aktive Form.
Yang et al. Pathol Oncol Research 27:63 1095, 2021 Fakih et al. Lancet Oncol 23, 115-124, 2022
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 3Genetische Veränderungen in der
Adenom-Karzinom-Sequenz
APC K-ras DCC
LOH 5q SMAD 2/4
LOH 18q
Modifiziert nach: Vogelstein B. et al. 2013, Science 339:1546-1558
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 4DCC (deleted in colorectal cancer) SMAD2/4 (mother against decapentaplegic homolog) • Tumorsuppressorgene Chromosom 18q21 – LOH 18q: 70% der Karzinome • DCC – Mutationen: 6% – Reduzierte Expression: 30% – Zelladhäsion, Migration • SMAD2/4 – Mutationen: 7% - 12% – TGF-b Signalweg Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 4
Genetische Veränderungen in der
Adenom-Karzinom-Sequenz
APC K-ras DCC TP53
LOH 5q SMAD 2/4 LOH 17p
LOH 18q
Modifiziert nach: Vogelstein B. et al. 2013, Science 339:1546-1558
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 4TP53: Eigenschaften und Funktionen
• Tumorsuppressorgen Chromosom 17p13
– Somatische Mutationen: 50% der Karzinome
– LOH: ca. 75% der Karzinome
• Protein aus 393 As., MG 53kdal
• Multiple Funktionen
– Kontrollfunktion im Zellzyklus (G1-S „checkpoint“)
– DNA-Reparatur
– Apoptose
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 4Genetisches Modell der kolorektalen
Karzinogenese (Fearon-Vogelstein Modell, 1990)
• Veränderungen in 4 bis 6 Genen
• Veränderungen in einer präferentiellen Sequenz
• Akkumulation ist entscheidend
• Aktivierung von Onkogenen und Inaktivierung von
Tumorsuppressorgenen
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 4The genomic landscapes of human breast and colorectal cancers. Wood LD, Parsons DW, Jones S, ………….. Kinzler KW, Velculescu VE, Vogelstein B. Science 2007, Nov 16; 318:1108-13 Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 4
„The genomic landscapes“ von Kolon- und
Mammakarzinomen: Mutationen
• Sequenzierung von 18191 Genen in je 11 Tumoren
• Identifizierung von 280 CAN (cancer)- Genen
• Anzahl mutierter CAN-Gene / Tumor
- Kolon: 15
- Mamma: 14
• Wenige CAN-Gene, die häufig mutiert sind
• Mehrheit der CAN-Gene zeigt niedrige Mutationsfrequenz
große genetische Heterogenität
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 4TP53
K-ras
APC
Fig. 3 Cancer genome landscapes
Few gene mountains, many gene hills
Wood LD et al., Science 2007, Oct 11Mutationshäufigkeit - kolorektale Karzinome Genomweite Analysen von 276 Karzinomen Exom-Sequenzierung DNA-Kopien-Anzahl Promoter-Methylierung mRNA-Expression microRNA-Expression The Cancer Genome Atlas Network Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature 487, 330-337 (2012) doi:10.1038/nature11252
Genetische Veränderungen in der
Adenom-Karzinom-Sequenz
APC K-ras DCC TP53
LOH 5q SMAD 2/4 LOH 17p
LOH 18q
Chromosomale Instabilität
Modifiziert nach: Vogelstein B. et al. 2013, Science 339:1546-1558
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 4Molekulare Klassifikation kolorektaler Karzinome • Chromosomale Instabilität (CIN) • Mikrosatelliteninstabilität (MSI) Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 5
Mikrosatelliten
• kurze repetitive DNA-Sequenzen
CACACACACACACA………... (CA)15-30
CAGTAACAGTAACAGTAACAGTAA… (CAGTAA)15-30
• anfällig für Fehler während der DNA-Replikation
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 5Mikrosatelliteninstabilität (MSI)
BAT 25
Normal
Tumor
BAT 26
Normal
Tumor
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 5Replikation Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 5
Replikation
Mismatch-
repair Proteine
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 5Replikation
Mismatch-
repair Proteine
Replikation Replikation
Insertion Deletion
Mikrosatelliteninstabilität
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 5PMS2 MLH1
DNA Mismatch-
Reparatur Proteine
MSH6 MSH2
Fehler in Mikrosatellitensequenz
Längenalterationen
Mikrosatelliteninstabilität
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 5MSI – Definition und Nachweis
• Fragmentanalyse mit fluoreszens-markierten Primern
- MSI-H: > 2/5 Markern instabil
- MSI-L: 1/5 Marker instabil
- MSS: stabil
• Next generation sequencing (NGS) - Analyse von
wenigen bis mehreren Tausend Mikrosatelliten-Loci
Verschiedene Auswertealgorithmen und Schwellenwerte in
Abhängigkeit der verwendeten Plattform
z.B. Genpanel TS500 von Illumina: MSI >10% der
analysierbaren MS Sequenzen
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 5Nachweis auf Proteinebene - Immunhistochemie
MSH2 MSH6
Mismatch-Repair-Deficiency
(MMRD)
MLH1 PMS2 Expressionsverlust
MLH1/PMS2 – Komplex
Nachweis auf DNA Ebene - Fragmentanalyse
BAT 25
Normal
MSI im TumorMikrosatelliteninstabilität (MSI) und DNA -
“Mismatch“-Reparaturgene
• MSI
- Auftreten zusätzlicher Allele im Tumor
• Defekte in DNA- „Mismatch“-Reparaturgenen
– MLH1, MSH2, MSH6, PMS2
• Mutationen in Genen mit repetitiven Sequenzen
– TGF-b-Rezeptor Typ II, IGFII-Rezeptor, Axin2, BAX
• MSI-H in Kolonkarzinomen
- sporadische: 15 - 20%
- hereditäre(HNPCC): 80 - 90%
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 5Lynch-Syndrom
(HNPCC - hereditary nonpolyposis colorectal cancer)
• Keimbahnmutationen in DNA-Reparaturgenen
(MLH1, MSH2, MSH6, PMS2)
• Tumorspektrum
– Kolon
– extrakolonisch (Endometrium, Magen, ableitende Harnwege,
Dünndarm)
• syn-, metachrone Karzinome
• junges Erkrankungsalter
• Häufigkeit: 2-3% der kolorektalen Karzinome
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 5Stammbaum einer HNPCC-Familie
Colon-Ca
ED: 32J
Colon-Ca,
Endometrium-Ca
ED: 35J
Colon-Ca,
DD-Ca
ED: 30J
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 5Diagnose Prognose
Lynch-Syndrom KRK-Patienten
Mikrosatelliten-
instabilität
(MSI)
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 6MSI und Prognose beim KRK
• bessere Prognose frühe Stadien (I,II)
Metaanalyse: 39 Studien mit 12,110 Patienten
MSI-H Status signifikant reduziert HR
(HR=0.64, pDiagnose Prognose
Lynch-Syndrom KRK-Patienten
Mikrosatelliten-
instabilität
(MSI)
Therapie
Immuncheckpoint-Inhibitoren
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 6MSI und Immun-Checkpoint- Inhibitoren
Ansprechen auf Pembrolizumab Behandlung
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 6Checkpoint Inhibitor-Therapie M. Guha. The Pharmaceutical Journal Nov 2014 Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 6
Checkpoint Inhibitor-Therapie M. Guha. The Pharmaceutical Journal Nov 2014 Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 6
Landscape of Microsatellite Instability Across 39 Cancer Types Bonneville R et al. JCO Precision Oncol 2017 • NGS-basierte Bestimmung von Mikrosatelliteninstabilität • 11139 Exome von 39 Tumorentitäten Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 6
Fig. 1. Patient survival and clinical response to pembrolizumab across 12 different tumor types with mismatch
repair deficiency. (A) Tumor types across 86 patients. (B) Waterfall plot of all radiographic responses across 12
different tumor types at 20 weeks. Tumor responses were measured at regular intervals; values show the best
fractional change of the sum of longest diameters (SLD) from the baseline measurements of each measurable
tumor
Le et al. Mismatch repair predicts response of solid tumors to PD1 blockade. Science 357, 409–413 (2017) 28 July 2017
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 6December 28, 2017 Cancer Drugs Approved Based on Biomarkers and Not Tumor Type—FDA Approval of Pembrolizumab for Mismatch Repair- Deficient Solid Cancers Vinay Prasad, MD, MPH1,2; Victoria Kaestner, BS1; Sham Mailankody, MB, BS3 JAMA Oncol. Published online December 28, 2017. On May 23, 2017, the US Food and Drug Administration (FDA) granted accelerated approval to pembrolizumab (Keytruda, Merck & Co) for patients with unresectable or metastatic, microsatellite instable-high (MSI-H) or mismatch repair-deficient (dMMR) solid tumors that have progressed on prior therapy and have no satisfactory treatment options. This approval is, to date, the first drug authorized for use based on a molecular biomarker rather than a traditional histopathologic diagnosis. The approval bridges several themes in modern oncologic drug development: the rapid translation of high- quality basic science, tailoring therapy based on genetic subgroups, and a flexibility on the part of the FDA to authorize drugs based on early, favorable data. Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 6
Molekulare Klassifikation kolorektaler Karzinome
• Chromosomale Instabilität (CIN)
• Mikrosatelliteninstabilität (MSI)
• Epigenetische Instabilität-
CpG island methylator phenotype (CIMP)
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 7Epigenetische Veränderung: DNA-Methylierung
• kovalente Modifikation von Cytosin
in CpG Sequenzen
• 70% von CpGs sind methyliert
• CpG reiche Stellen im Promoterbereich
von Genen sind nicht methyliert,
Transkription möglich
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 7Epigenetische Veränderung: DNA-Methylierung
• kovalente Modifikation von Cytosin
in CpG Sequenzen
• 70% von CpGs sind methyliert
• CpG reiche Stellen im Promoterbereich
von Genen sind nicht methyliert,
Transkription möglich
Promoterhypermethylierung
Abschalten der Transkription
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 7Karzinogenese im Kolorektum
• klassische Adenom-Karzinom-Sequenz
• serratierte Karzinogenesewege
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 7Sägezahnartige (serratierte)
Morphologie des Kryptenepithels
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 7Sessil serratierte Karzinogenese
Karzinom
Methyl. MLH1 MSI-H
sessil
Normales
serratiertes
Epithel
BRAF Adenom Karzinom
partielle Methyl.
MSI-L, MSS
MLH1, Methyl. MGMT
CIMP-H Mut. p53
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 7Sessil serratierte Karzinogenese
Karzinom
Methyl. MLH1 MSI-H
sessil
Normales
serratiertes
Epithel
BRAF Adenom Karzinom
partielle Methyl.
MSI-L, MSS
MLH1, Methyl. MGMT
CIMP-H Mut. p53
Traditionell serratierte Karzinogenese - Mischtyp
traditionell
serratiertes Karzinom
Normales Adenom MSI-L, MSS
Epithel (TSA) /
KRAS Methyl. CIN
villöses MGMT
Adenom
Mut. p53, APC
LOH 18q
CIMP-L
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 7Molekulare Klassifikation kolorektaler Karzinome
„classical adenoma
CIN
carcinoma pathway“
CIMP-L
„serrated K-ras, p53-
pathway“ Mutation
20%
APC, K-ras,
p53 Mutation
CIMP- H 8%
57%
BRAF-Mutation CIMP-negativ
MLH1-Methyl.
12%
3%
„MSI pathway“ MSI-H
nach: Jass JR, Histopathol 2007, 50:113-130
Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 7The consensus molecular subtypes of colorectal cancer Guinney et al. 2015, Nat Medicine 21:1350-1356 Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 7
The three major molecular pathways of colorectal cancer Schmitt M, Greten FR: The inflammatory pathogenesis of colorectal cancer Nature Reviews Immunology volume 21, pages 653–667 (2021) Organspezifische Karzinogenese - Kolonkarzinom Teil 7
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!
Fragen an
gisela.keller@tum.de
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