QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage - 2 x 96 (Katalog-Nr. 0594-0201) 20 x 96 (Katalog-Nr. 0594-0501)
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QuantiFERON®-TB Gold (QFT®) ELISA
Packungsbeilage 2 x 96 (Katalog-Nr. 0594-0201)
20 x 96 (Katalog-Nr. 0594-0501)
IFN-γ-Test für Vollblut zur Messung der Reaktion auf
die Peptidantigene ESAT-6, CFP-10 und TB7.7(p4)
In-vitro-Diagnostikum
0594-0201, 0594-0501
Cellestis, a QIAGEN Company
Level 2, Office Tower 2, Chadstone Centre
1341 Dandenong Road, Chadstone, Victoria, 3148, Australien
Telefon: (Australien) +613-9840-9800
QIAGEN GmbH, QIAGEN-Straße 1
40724 Hilden, DEUTSCHLAND
1075115 Rev. 01
www.QuantiFERON.com
www.QuantiFERON.comInhalt
1. Verwendungszweck 4
2. Zusammenfassung und Erklärung des Tests 4
Testprinzip 5
Zeitbedarf für den Test 6
3. Komponenten und Aufbewahrung 6
Vom Anwender bereitzustellende Ausrüstung und Reagenzien 7
Lagerung und Handhabung 8
4. Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen 9
In-vitro-Diagnostikum 9
Warnhinweise 9
Vorsichtsmaßnahmen 10
5. Probennahme und -handhabung 12
6. Gebrauchsanweisung 14
Teil 1 — Inkubation der Blutproben und Entnahme des Plasmas 14
Teil 2 — ELISA für humanes IFN-γ 15
7. Berechnungen und Auswertung des Tests 20
Erstellung der Standardkurve 20
Qualitätskontrolle des Tests 20
8. Grenzen des Verfahrens 23
9. Leistungsmerkmale 23
Klinische Studien 23
10. Technische Informationen 27
Uneindeutige Ergebnisse 27
Geronnene Plasmaproben 27
Hilfe zur Fehlerbehebung 28
11. Literatur 31
12. Technischer Service 33
13. Kurzanleitung 34
Teil 1 – Inkubation der Blutproben 34
Teil 2 – IFN-γ-ELISA 34
Wesentliche Veränderungen 36
QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013 31. Verwendungszweck QuantiFERON-TB Gold (QFT®) ist ein In-vitro-Diagnostikum zur Stimulation von Zellen in heparinisiertem Vollblut. Hierzu wird ein Peptid-Cocktail verwendet, der die Proteine ESAT-6, CFP-10 und TB7.7(p4) simuliert. Die In-vitro-Reaktion auf diese Peptid-Antigene, die in Zusammenhang mit einer Infektion durch Mycobacterium tuberculosis steht, wird durch Nachweis von Interferon γ (IFN-γ) mittels ELISA-Test (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) festgestellt. QFT ist ein indirekter Test auf Infektionen mit M. tuberculosis (einschließlich der aktiven Erkrankung) und ist zur Verwendung in Kombination mit der Risikoabschätzung, Röntgenuntersuchungen und anderen medizinischen und diagnostischen Verfahren vorgesehen. 2. Zusammenfassung und Erklärung des Tests Tuberkulose ist eine übertragbare Krankheit, die durch eine Infektion mit Organismen des M.- tuberculosis-Komplexes (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum) verursacht wird. Die Ansteckung durch Personen, die an Tuberkulose der Atemwege leiden, erfolgt in der Regel über eine Tröpfcheninfektion. Bei neu infizierten Personen kann Wochen oder Monate später eine Tuberkulose-Erkrankung auftreten, bei den meisten Infizierten treten jedoch keine Beschwerden auf. Bei einigen persistiert eine latente Tuberkulose-Infektion (LTBI), eine nicht übertragbare, asymptomatische Erkrankung, die erst Monate oder Jahre später zum Ausbruch kommen kann. Der Hauptzweck der Erkennung der LTBI besteht darin, eine Behandlung zur Prävention des Ausbruchs der Tuberkulose-Erkrankung in Betracht zu ziehen. Bis vor kurzem war der Tuberkulin-Hauttest (THT) die einzige verfügbare Methode zur Diagnose der LTBI. Die kutane Sensitivität für Tuberkulin entsteht 2 bis 10 Wochen nach der Infektion. Jedoch reagieren einige Infizierte nicht auf Tuberkulin, darunter z. B. Patienten mit einer gestörten Immunreaktion infolge anderer Erkrankungen, aber auch Patienten ohne solche Erkrankungen. Umgekehrt weisen jedoch einige Personen, bei denen eine Infektion mit M. tuberculosis unwahrscheinlich ist, eine Tuberkulin-Sensitivität auf und erzielen ein positives Testergebnis im Tuberkulin-Hauttest, beispielsweise nach der BCG-Impfung, nach Infektion mit anderen, nicht dem M.-tuberculosis-Komplex zugehörigen, Mykobakterien oder aufgrund unbekannter anderer Faktoren. Die LTBI muss von der meldepflichtigen Tuberkulose-Erkrankung abgegrenzt werden, bei der in der Regel die Lunge und die unteren Atemwege betroffen sind, jedoch auch andere Organsysteme betroffen sein können. Die Diagnose der Tuberkulose-Erkrankung erfolgt aufgrund der Ergebnisse von Anamnese und ärztlicher Untersuchung sowie aufgrund radiologischer, histologischer und mykobakteriologischer Untersuchungsergebnisse. Mit dem QFT-Test wird die zellvermittelte Immunreaktion auf Peptidantigene, welche Mykobakterienproteine simulieren, gemessen. Diese Proteine (ESAT-6, CFP-10 und TB7.7(p4)) fehlen in allen BCG-Stämmen und den meisten nicht-tuberkulösen Mykobakterien mit Ausnahme von M. kansasii, M. szulgai und M. marinum.(1) Bei Personen, die mit Organismen des M.-tuberculosis-Komplexes infiziert sind, liegen im Allgemeinen Lymphozyten im Blut vor, die diese und andere mykobakterielle Antigene erkennen. Bei diesem Erkennungsprozess wird das Zytokin IFN-γ von den Zellen produziert und sezerniert. Der Nachweis und die anschließende Quantifizierung von IFN-γ bilden die Grundlage dieses Tests. 4 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013
Die im QFT-Test verwendeten Antigene sind ein Peptidcocktail, der die Proteine ESAT-6, CFP- 10 und TB7.7(p4) simuliert. Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass diese Peptidantigene die IFN-γ-Reaktion in den T-Zellen von mit M. tuberculosis infizierten Personen stimulieren, jedoch in der Regel nicht die T-Zellen von nicht infizierten oder BCG-geimpften Personen ohne Tuberkulose-Erkrankung oder LTBI-Risiko.(1-32) Es besteht jedoch die Möglichkeit, dass die IFN-γ-Reaktion durch medizinische Behandlungen oder Erkrankungen, die die Immunfunktion beeinträchtigen, verringert wird. Patienten mit bestimmten anderen Mykobakterieninfektionen können ebenfalls auf ESAT-6, CFP-10 und TB7.7(p4) reagieren, da die Gene, die diese Proteine kodieren, auch bei M. kansasii, M. szulgai und M. marinum vorhanden sind.(1, 23) Der QFT-Test ist zum einen zum Nachweis einer LTBI geeignet und zum anderen eine wertvolle Hilfe bei der Diagnose einer Infektion mit dem M.-tuberculosis-Komplex bei erkrankten Patienten. Ein positives Testergebnis unterstützt die Diagnose einer Tuberkulose- Erkrankung; jedoch kann es auch durch Infektionen mit anderen Mykobakterien (z. B. M. kansasii) hervorgerufen werden. Für die Bestätigung bzw. den Ausschluss einer Tuberkulose- Erkrankung sind weitere medizinische und diagnostische Untersuchungen erforderlich. Testprinzip Das QFT-System beinhaltet spezielle Blutentnahmeröhrchen, in die die Vollblutproben entnommen werden. Die anschließende Inkubation der Blutproben im Röhrchen dauert 16 bis 24 Stunden. Danach wird das Plasma entnommen und auf das Vorliegen von IFN-γ untersucht, das gegebenenfalls in Reaktion auf die Peptidantigene gebildet wurde. Der QFT-Test wird in zwei Teilen durchgeführt. Zunächst wird Vollblut in jedes der drei QFT- Blutentnahmeröhrchen abgenommen. Dabei handelt es sich um ein Negativkontrolle- Röhrchen (Nil Control), ein TB-Antigen-Röhrchen und ein Mitogen-Röhrchen. Das Mitogen-Röhrchen kann im QFT-Test als Positivkontrolle verwendet werden. Dies kann insbesondere in Fällen wichtig sein, in denen der Immunstatus des Patienten fraglich ist. Das Mitogen-Röhrchen kann auch als Kontrolle für den korrekten Umgang mit der Blutprobe und für die korrekte Inkubation eingesetzt werden. Die Röhrchen sollten so schnell wie möglich, jedoch spätestens 16 Stunden nach der Blutentnahme, bei 37 °C inkubiert werden. Nach einer Inkubationszeit von 16 bis 24 Stunden werden die Röhrchen dann zentrifugiert, das Plasma wird abgenommen und die Menge an IFN-γ (IU/ml) wird mittels ELISA gemessen. Der Test gilt als positiv für die IFN-γ-Reaktion, wenn der Messwert des TB-Antigen-Röhrchens (IFN-γ in IU/ml) signifikant über dem Wert der Negativkontrolle (Nil) liegt. Bei Verwendung des Mitogen-Röhrchens dient die mitogenstimulierte Plasmaprobe als IFN-γ-Positivkontrolle für die jeweils getestete Probe. Wenn eine Blutprobe eine negative Reaktion auf die TB- Antigene zeigt, weist eine ebenfalls nur geringe Reaktion auf das Mitogen (< 0,5 IU/ml) auf ein uneindeutiges Ergebnis hin. Ein solches Muster kann auftreten bei ungenügender Lymphozytenzahl, verringerter Lymphozytenaktivität infolge unsachgemäßer Probenbehandlung, unsachgemäßem Befüllen oder Mischen des Mitogen-Röhrchens oder dann, wenn die Lymphozyten des Patienten nicht in der Lage sind, IFN-γ zu produzieren. Die Negativkontrolle dient der Hintergrundkorrektur, der Korrektur für Effekte etwaiger heterophiler Antikörper sowie der Korrektur für unspezifisches IFN-γ in der Blutprobe. Der QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013 5
IFN-γ-Wert des Negativkontrolle-Röhrchens wird vom IFN-γ-Wert des TB-Antigen-Röhrchens
und vom IFN-γ-Wert des Mitogen-Röhrchens (sofern verwendet) abgezogen.
Zeitbedarf für den Test
Nachstehend finden Sie Angaben zur geschätzten Dauer des QFT-Tests sowie zur
erforderlichen Zeit bei der gleichzeitigen Untersuchung mehrerer Proben.
Inkubation der Blutröhrchen bei 37 °C: 16 bis 24 Stunden
ELISA: Etwa 3 Stunden für eine ELISA-Platte
(28 bis 44 Patienten)
< 1 Stunde Arbeitszeit
Plus 10 bis 15 Minuten pro zusätzliche Platte
3. Komponenten und Aufbewahrung
Blood Collection Tubes (Blutentnahmeröhrchen)* 300 Röhrchen 200 Röhrchen 100 Röhrchen
Katalog-Nr. T0590-0301 0590-0201 T0593-0201
Anzahl Präparationen 100 100 100
QuantiFERON Nil Tube (Negativkontrolle-Röhrchen, 100 Röhrchen 100 Röhrchen
grauer Deckel, weißer Ring)
QuantiFERON TB Antigen Tube (TB-Antigen-Röhrchen, 100 Röhrchen 100 Röhrchen
roter Deckel, weißer Ring)
QuantiFERON Mitogen Tube (Mitogen-Röhrchen, lila 100 Röhrchen 100 Röhrchen
Deckel, weißer Ring)
Packungsbeilage für QFT-Blutentnahmeröhrchen 1 1 1
High Altitude (HA) Blood Collection Tubes 300 Röhrchen 100 Röhrchen 100 Röhrchen
(Blutentnahmeröhrchen für Höhen zwischen 1020 und
1875 m)*
Katalog-Nr. T0590-0505 0590-0501 T0593-0501
QuantiFERON HA Nil Tube (Negativkontrolle-Röhrchen 100 Röhrchen 100 Röhrchen
für große Höhen, grauer Deckel, gelber Ring)
QuantiFERON HA TB Antigen Tube (TB-Antigen- 100 Röhrchen 100 Röhrchen
Röhrchen für große Höhen, roter Deckel, gelber Ring)
QuantiFERON HA Mitogen Tube (Mitogen-Röhrchen für 100 Röhrchen 100 Röhrchen
große Höhen, lila Deckel, gelber Ring)
Packungsbeilage für QFT-Blutentnahmeröhrchen 1 1 1
* Nicht alle Produktkonfigurationen sind in allen Ländern erhältlich. Wenden Sie sich bitte an den
Kundenservice von QIAGEN (Details im Internet unter www.qiagen.com), um zu erfahren, welche
Konfigurationen für Sie bestellbar sind.
6 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013Komponenten des ELISA 2 Plate Kit ELISA (Kit Reference Lab Pack
mit 2 ELISA-Platten) (Packung für
Referenzlabore)
Katalog-Nr. 0594-0201 0594-0501
Microplate Strips (Mikrotiterstreifen [12 x 8 Wells], 2 Sätze von je 12 20 Sätze von je 12
beschichtet mit murinen monoklonalen Antikörpern 8-Well- 8-Well-
gegen humanes IFN-γ) Mikrotiterstreifen Mikrotiterstreifen
Human IFN-γ Standard, lyophilized (Humaner IFN-γ 1 Fläschchen 10 Fläschchen
Standard, lyophilisiert, enthält rekombinant (8 IU/ml nach (8 IU/ml nach
hergestelltes humanes IFN-γ, Rindercasein, 0,01 % w/v Rekonstitution) Rekonstitution)
Thimerosal)
Green Diluent (grüne Verdünnungslösung, enthält 1 x 30 ml 10 x 30 ml
Rindercasein, normales Mausserum, 0,01 % w/v
Thimerosal)
Conjugate 100X Concentrate, lyophilized 1 x 0,3 ml (nach 10 x 0,3 ml (nach
(Konjugatkonzentrat, 100-fach konzentriert, Rekonstitution) Rekonstitution)
lyophilisiert, murines Antikörper-HRP-Konjugat gegen
humanes IFN-γ, enthält 0,01 % w/v Thimerosal)
Wash Buffer 20X Concentrate (Waschpufferkonzentrat, 1 x 100 ml 10 x 100 ml
20-fach konzentriert, pH 7,2, enthält 0,05 % v/v
ProClin® 300)
Enzyme Substrate Solution (Enzymsubstratlösung, 1 x 30 ml 10 x 30 ml
enthält H2O2, 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidin)
Enzyme Stopping Solution (Enzymstopplösung, enthält 1 x 15 ml 10 x 15 ml
0,5 M H2SO4)†
Packungsbeilage für QFT-ELISA 1 1
†
Enthält Schwefelsäure. Siehe die Sicherheitshinweise auf Seite 10.
Vom Anwender bereitzustellende Ausrüstung und Reagenzien
37 °C-Inkubator. CO2 nicht erforderlich
Kalibrierte Pipetten mit variablem Volumen für Volumina von 10 µl bis 1000 µl, mit
Einwegspitzen
Kalibrierte Mehrkanalpipette zur Abgabe von 50 µl und 100 µl, mit Einwegspitzen
Schüttler für Mikrotiterplatten
Entionisiertes oder destilliertes Wasser (2 Liter)
Waschgerät für Mikrotiterplatten (vorzugsweise automatisiert)
Mikrotiterplatten-Photometer mit 450-nm-Filter und Referenzfilter bei 620 bis 650 nm
QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013 7Lagerung und Handhabung
Blutentnahmeröhrchen
Blutentnahmeröhrchen bei 4 °C bis 25 °C lagern.
Reagenzien des Kits
Reagenzien des Kits im Kühlschrank bei 2 °C bis 8 °C lagern.
Die Enzymsubstratlösung stets vor direkter Sonneneinstrahlung schützen.
Rekonstituierte und nicht verbrauchte Reagenzien
Anweisungen zur Rekonstitution der Reagenzien finden Sie in Kapitel 6 (Seite 14).
Der rekonstituierte Kitstandard ist bei Lagerung bei 2 °C bis 8 °C 3 Monate lang
haltbar.
Notieren Sie das Datum der Rekonstitution des Kitstandards.
Das 100x Konjugatkonzentrat muss nach Rekonstitution bei 2 °C bis 8 °C gelagert und
innerhalb von drei Monaten aufgebraucht werden.
Notieren Sie das Datum der Rekonstitution des Konjugats.
Gebrauchsfertig verdünntes Konjugat muss innerhalb von 6 Stunden nach Zubereitung
verwendet werden.
Gebrauchsfertig verdünnter Waschpuffer ist bei Raumtemperatur bis zu 2 Wochen lang
haltbar.
8 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/20134. Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen
In-vitro-Diagnostikum
Warnhinweise
Ein negatives Ergebnis im QFT-Test schließt die Möglichkeit einer
Infektion mit M. tuberculosis und einer Tuberkulose-Erkrankung nicht aus;
falsch-negative Ergebnisse können bedingt sein durch die
Infektionsphase (z. B. wenn die Blutprobe vor der Entwicklung der
zellulären Immunreaktion entnommen wurde), Störungen der
Immunfunktion durch andere Erkrankungen, unsachgemäße
Handhabung der Röhrchen nach der Blutentnahme, unrichtige
Testdurchführung oder andere immunologische Variablen.
Ein positives Ergebnis im QFT-Test sollte nicht als alleinige Grundlage für
die Diagnose einer Infektion mit M. tuberculosis dienen; durch unrichtige
Testdurchführung kann es zu falsch-positiven Ergebnissen kommen.
Ein positives Ergebnis im QFT-Test sollte durch weitere medizinische und
diagnostische Untersuchungen abgeklärt werden, um zu bestimmen, ob
eine aktive Tuberkulose-Erkrankung vorliegt (z. B. durch Abstrich und
Kultur, Röntgen-Thorax).
Zwar kommen ESAT-6, CFP-10 und TB7.7(p4) in den BCG-Stämmen und
in den meisten bekannten nicht-tuberkulösen Mykobakterien nicht vor,
ein positives Ergebnis im QFT-Test kann aber auch auf eine Infektion mit
M. kansasii, M. szulgai oder M. marinum zurückzuführen sein. Werden
solche Infektionen vermutet, sind alternative Testmethoden einzusetzen.
QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013 9Vorsichtsmaßnahmen
Nur zum diagnostischen Gebrauch in vitro.
Tragen Sie beim Umgang mit Chemikalien immer einen Laborkittel, Einmal-
Laborhandschuhe und eine Schutzbrille. Weitere Informationen können Sie den
entsprechenden Sicherheitsdatenblättern entnehmen (safety data sheets, SDS). In
unserer Online-Sammlung der Sicherheitsdatenblätter unter www.qiagen.com/safety
finden Sie zu jedem QIAGEN-Kit und zu jeder Kit-Komponente das jeweilige SDS als
PDF-Datei, die Sie einsehen und ausdrucken können.
VORSICHT: Behandeln Sie Humanblutproben stets als
potenziell infektiös. Beachten Sie die einschlägigen
Richtlinien zum Umgang mit Blut.
Die folgenden Gefahrenhinweise und Sicherheitsratschläge (R- und S-Sätze) gelten
für einzelne Komponenten des QuantiFERON-TB Gold ELISA:
QuantiFERON Enzyme Stopping Solution (Enzymstopplösung)
Xi
Enthält Schwefelsäure: Reizend. R- und S-Sätze:* R36/38, S26, S36/37/39
Green Diluent (grüne Verdünnungslösung) enthält normales Mausserum und
Casein; diese Substanzen können unter Umständen allergische Reaktionen
auslösen; Berührung mit der Haut vermeiden.
Bei chemischen Notfällen
Verschütten, Leckagen, Exposition und Unfällen
rufen Sie rund um die Uhr CHEMTREC an
In den USA und Kanada: 1-800-424-9300
Außerhalb von USA und Kanada: +1-703-527-3887 (R-Gespräche werden
angenommen)
Weitere Informationen
Sicherheitsdatenblätter: www.qiagen.com/safety
Abweichungen von den Instruktionen der Packungsbeilage des QuantiFERON-
TB Gold (QFT) ELISA können zu fehlerhaften Ergebnissen führen. Bitte lesen Sie
die Anweisungen vor Gebrauch sorgfältig durch.
Verwenden Sie den Kit nicht, wenn Reagenzienflaschen vor Gebrauch
beschädigt oder undicht erscheinen.
* R36/38: Reizt die Augen und die Haut; S26: Bei Berührung mit den Augen sofort gründlich mit
Wasser abspülen und Arzt konsultieren; S36/37/39: Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung,
Schutzhandschuhe und Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen.
10 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013 Die folgenden Reagenzien und Komponenten dürfen nicht aus unterschiedlichen
Chargen des QFT-Kits verwendet oder gemischt werden: Mikrotiterstreifen,
humaner IFN-γ-Standard, grüne Verdünnungslösung und 100x
Konjugatkonzentrat. Die anderen Reagenzien (20x Waschpufferkonzentrat,
Enzymsubstratlösung und Enzymstopplösung) können zwischen verschiedenen
Kits ausgetauscht werden, solange das Verfallsdatum der einzelnen Reagenzien
nicht abgelaufen ist und die Angaben zu den jeweiligen Chargen dokumentiert
werden. Nicht benötigte Reagenzien und biologische Proben sind gemäß den
örtlichen und nationalen Vorschriften zu entsorgen.
Nach Ablauf des Verfallsdatums dürfen die Blutentnahmeröhrchen und der
ELISA-Kit nicht mehr verwendet werden.
Stellen Sie vor Gebrauch sicher, dass alle Laborgeräte wie Plattenwaschgerät
und Mikrotiterplatten-Photometer kalibriert/validiert wurden.
QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013 115. Probennahme und -handhabung
Im QFT-Test werden die folgenden Blutentnahmeröhrchen verwendet:
1. QuantiFERON Nil (Negativkontrolle-Röhrchen, grauer Deckel mit weißem Ring, für
Höhenlagen von 0 bis 810 m)
2. TB Antigen (TB-Antigen-Röhrchen, roter Deckel mit weißem Ring, für Höhenlagen von 0
bis 810 m)
3. QuantiFERON Mitogen (Mitogen-Röhrchen, lila Deckel mit weißem Ring, für
Höhenlagen von 0 bis 810 m)
Röhrchen für große Höhen (HA Tubes)
4. QuantiFERON HA Nil (Negativkontrolle-Röhrchen für große Höhen, grauer Deckel mit
gelbem Ring, für Höhenlagen von 1020 bis 1875 m)
5. HA TB Antigen (TB-Antigen-Röhrchen für große Höhen, roter Deckel mit gelbem Ring,
für Höhenlagen von 1020 bis 1875 m)
6. QuantiFERON HA Mitogen (Mitogen-Röhrchen für große Höhen, lila Deckel mit gelbem
Ring, für Höhenlagen von 1020 bis 1875 m)
Die Antigene befinden sich in getrockneter Form in der Beschichtung der Innenwand der
Blutentnahmeröhrchen. Daher müssen die Blutproben sorgfältig mit dem Inhalt des
Röhrchens vermischt werden. Die Röhrchen müssen so schnell wie möglich, jedoch
spätestens 16 Stunden nach der Blutentnahme, in einen 37 °C-Inkubator überführt werden.
Für optimale Ergebnisse sollte das folgende Verfahren befolgt werden:
1. Nehmen Sie von jedem Patienten per Venenpunktion je 1 ml Blut direkt in jedes der
QFT-Blutentnahmeröhrchen ab. Diese Prozedur darf nur von einer entsprechend
ausgebildeten Fachkraft durchgeführt werden.
• Bis zu einer Höhe von 810 m sollten die Standard-QFT-Blutentnahmeröhrchen
benutzt werden. In Höhenlagen zwischen 1020 m und 1875 m sollten die speziellen
HA-QFT-Blutentnahmeröhrchen für große Höhen verwendet werden.
• Bei Verwendung der QFT-Blutentnahmeröhrchen außerhalb dieser Höhenbereiche
oder falls zu wenig Blut in ein Röhrchen aufgenommen wird, kann das Blut beim
Patienten mit einer Spritze abgenommen und dann sofort je 1 ml in jedes der
3 Röhrchen überführt werden. Aus Sicherheitsgründen nimmt man hierzu am besten
unter Beachtung der einschlägigen Vorsichtsmaßnahmen die Nadel von der Spritze,
nimmt dann die Deckel von den 3 QFT-Röhrchen ab und gibt in jedes Röhrchen 1 ml
Blut (bis zur seitlichen schwarzen Markierung auf dem Röhrchenetikett).
Anschließend werden die Röhrchen wieder sorgfältig mit den Deckeln verschlossen
und wie nachstehend beschrieben gemischt.
• Da die 1-ml-Röhrchen das Blut relativ langsam aufnehmen, belassen Sie das
Röhrchen nach dem scheinbaren Erreichen des Füllstands bitte noch 2-3 Sekunden
auf der Nadel, um zu gewährleisten, dass die erforderliche Blutmenge entnommen
wurde.
Die schwarze Markierung seitlich am Röhrchen ist die 1-ml-Fülllinie. Die QFT-
Blutentnahmeröhrchen wurden für Volumina von 0,8 bis 1,2 ml validiert. Falls sich
12 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013der Füllspiegel des Bluts nicht nahe an dieser Indikatorlinie befindet, empfiehlt es
sich, eine neue Blutprobe zu entnehmen.
• Bei Verwendung einer Butterfly-Nadel zur Blutentnahme ist mit Hilfe eines
Leerröhrchens sicherzustellen, dass die Schlauchverbindung mit Blut gefüllt ist, bevor
die QFT-Röhrchen verwendet werden.
• Alternativ kann das Blut mit einem einzigen normalen Blutentnahmeröhrchen, das
Lithium-Heparin als Antikoagulans enthält, entnommen und anschließend in die QFT-
Röhrchen überführt werden. Verwenden Sie ausschließlich Lithium-Heparin als Blut-
Antikoagulans, da andere Antikoagulantien den Test beeinträchtigen. Füllen Sie ein
Blutentnahmeröhrchen (Mindestvolumen 5 ml) und durchmischen Sie den Inhalt
behutsam, indem Sie das Röhrchen mehrere Male über Kopf schwenken, um das
Heparin zu lösen. Das Blut sollte bei Raumtemperatur gelagert werden
(22 °C ± 5 °C), bis es zur Inkubation in die QFT-Röhrchen überführt wird. Das
Überführen in die QFT-Röhrchen zur Inkubation muss innerhalb von 16 Stunden nach
der Blutentnahme erfolgen.
2. Schütteln Sie die Röhrchen unmittelbar nach der Befüllung zehnmal (10x) gerade so
stark, dass die gesamte Innenwand des Röhrchens mit Blut bedeckt ist, um die Antigene
an der Röhrchenwand zu lösen.
• Die Röhrchen sollten bei der Befüllung mit Blut eine Temperatur zwischen 17 °C und
25 °C aufweisen.
• Zu heftiges Schütteln kann das Gel zerstören und so zu falschen Ergebnissen führen.
• Wurde das Blut mit Heparin-Röhrchen entnommen, müssen die Proben vor dem
Überführen in die QFT-Röhrchen gleichmäßig gemischt sein. Um dies sicherzustellen,
müssen die Röhrchen direkt vor dem Transfer behutsam über Kopf geschwenkt
werden. Geben Sie 1,0-ml-Aliquots (eines pro QFT-Röhrchen) in geeignete
Negativkontrolle-, TB-Antigen- und Mitogen-Röhrchen. Aus Sicherheitsgründen nimmt
man hierzu am besten unter Beachtung der einschlägigen Vorsichtsmaßnahmen und
aseptischer Techniken die Nadel von der Spritze, nimmt dann die Deckel von den
drei QFT-Röhrchen ab und gibt in jedes Röhrchen 1 ml Blut (bis zur seitlichen
schwarzen Markierung auf dem Röhrchenetikett). Anschließend werden die Röhrchen
wieder sorgfältig mit den Deckeln verschlossen und wie oben beschrieben gemischt.
3. Beschriften Sie die Röhrchen in geeigneter Weise.
• Stellen Sie sicher, dass jedes Röhrchen (Negativkontrolle, TB-Antigen, Mitogen) nach
dem Entfernen des Deckels anhand des Etiketts oder auf andere Weise identifiziert
werden kann.
4. Nach dem Befüllen, Schütteln und Beschriften müssen die Röhrchen so schnell wie
möglich, und spätestens 16 Stunden nach der Blutentnahme, in einen Inkubator mit
einer Temperatur von 37 °C ± 1 °C überführt werden. Lagern Sie die Röhrchen bis zur
Inkubation bei Raumtemperatur (22 °C ± 5 °C). Bewahren Sie die Blutproben nicht im
Kühlschrank oder Gefrierschrank auf.
QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013 136. Gebrauchsanweisung
Teil 1 — Inkubation der Blutproben und Entnahme des Plasmas
Im Lieferumfang enthaltene Materialien
QFT-Blutentnahmeröhrchen (siehe Kapitel 3)
Vom Anwender bereitzustellende Materialien
Siehe Kapitel 3.
Durchführung
1. Wenn die Inkubation der Blutproben nicht sofort anschließend an die Blutentnahme
durchgeführt wird, müssen die Röhrchen unmittelbar vor der Inkubation erneut durch
10-maliges Über-Kopf-Schwenken gemischt werden.
2. Röhrchen STEHEND 16 bis 24 Stunden bei 37 °C ± 1 °C inkubieren. CO2 und
Befeuchtung sind im Inkubator nicht erforderlich.
3. Nach der Inkubation bei 37 °C können die Blutentnahmeröhrchen bis zur Zentrifugation
bei 4 °C bis 27 °C bis zu 3 Tage lang aufbewahrt werden.
4. Nach der Inkubation der Röhrchen bei 37 °C werden diese zur leichteren Entnahme des
Plasmas für 15 Minuten bei 2000 bis 3000 xg (RCF) zentrifugiert. Die Gelbarriere trennt
dabei die Zellen vom Plasma. Geschieht dies nicht, sollten die Röhrchen bei einer
höheren Geschwindigkeit erneut zentrifugiert werden.
• Das Plasma kann auch ohne Zentrifugieren entnommen werden, jedoch muss hierbei
sehr vorsichtig vorgegangen werden, um keine Zellen aufzuwirbeln.
5. Die Plasmaproben sollten nur mit einer Pipette entnommen werden.
• Vermeiden Sie nach der Zentrifugation jegliches Auf- und Abpipettieren oder Mischen vor
Abnahme des Plasmas. Achten Sie stets darauf, dass das Material an der Oberfläche des Gels
nicht aufgewirbelt wird.
• Die Plasmaproben können direkt aus den zentrifugierten Blutentnahmeröhrchen in
die QFT-ELISA-Platte pipettiert werden, auch bei Verwendung eines ELISA-Automaten.
• Die Plasmaproben können bei 2 °C bis 8 °C bis zu 28 Tage lang gelagert werden.
Nach Entnahme des Plasmas kann dieses auch für längere Zeit bei unter
–20 °C gelagert werden.
• Für eine einwandfreie Testdurchführung sollten mindestens 150 µl Plasma
entnommen werden.
14 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013Teil 2 — ELISA für humanes IFN-γ
Im Lieferumfang enthaltene Materialien
QFT-ELISA-Kit (siehe Kapitel 3)
Vom Anwender bereitzustellende Materialien
Siehe Kapitel 3.
Durchführung
1. Alle Plasmaproben und Reagenzien, mit Ausnahme des 100x Konjugatkonzentrats,
müssen vor Gebrauch auf Raumtemperatur (22 °C ± 5 °C) gebracht werden. Planen Sie
für die Temperaturäquilibrierung mindestens 60 Minuten ein.
2. Nehmen Sie nicht benötigte Streifen aus dem Rahmen, geben Sie sie in die
Folienverpackung zurück und lagern Sie sie bis zum Gebrauch im Kühlschrank.
Sehen Sie mindestens einen Streifen für die QFT-Standards und eine ausreichende
Anzahl von Streifen für die zu testenden Patienten vor (siehe Abbildungen 2A und 2B
für die Verwendung von 3 bzw. 2 Röhrchen). Bewahren Sie nach Gebrauch den
Rahmen und den Deckel für die verbleibenden Streifen auf.
3. Rekonstituieren Sie den gefriergetrockneten Kitstandard mit der auf dem Etikett des
Standardfläschchens angegebenen Menge an entionisiertem oder destilliertem Wasser.
Mischen Sie vorsichtig, um die Schaumbildung zu minimieren, und vergewissern Sie
sich, dass der Inhalt vollständig aufgelöst wurde. Durch Rekonstitution des Standards
auf das angegebene Volumen erhält man eine Lösung mit einer Konzentration von
8,0 IU/ml.
Hinweis: Das Rekonstitutionsvolumen des Kitstandards ist je nach Charge
unterschiedlich.
Verwenden Sie den rekonstituierten Kitstandard zur Herstellung einer 1:4-
Verdünnungsreihe von IFN-γ in grüner Verdünnungslösung (Green Diluent, GD) (siehe
Abbildung 1). S1 (Standard 1) enthält 4 IU/ml, S2 (Standard 2) enthält 1 IU/ml, S3
(Standard 3) enthält 0,25 IU/ml und S4 (Standard 4) enthält 0 IU/ml (nur GD). Die
Standards sollten mindestens als Doppelbestimmung getestet werden.
QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013 15Empfohlenes Verfahren für Empfohlenes Verfahren für
Doppelbestimmung der Standards Dreifachbestimmung der Standards
a. 4 Röhrchen mit „S1“, „S2“, „S3“ bzw. a. 4 Röhrchen mit „S1“, „S2“, „S3“ bzw. „S4“
„S4“ beschriften. beschriften.
b. Je 150 µl GD in S1, S2, S3 und S4 b. 150 µl GD in S1 geben.
geben.
c. 150 µl des Kitstandards in S1 geben c. Je 210 µl GD in S2, S3 und S4 geben.
und gründlich mischen.
d. 50 µl von S1 in S2 überführen und d. 150 µl des Kitstandards in S1 geben und gründlich
gründlich mischen. mischen.
e. 50 µl von S2 in S3 überführen und e. 70 µl von S1 in S2 überführen und gründlich
gründlich mischen. mischen.
f. GD allein dient als Nullstandard (S4). f. 70 µl von S2 in S3 überführen und gründlich
mischen.
g. GD allein dient als Nullstandard (S4).
Standard 1 Standard 2 Standard 3 Standard 4
Rekonstituierter 4,0 1,0 0,25 0
Kitstandard IU/ml IU/ml IU/ml IU/ml (Grüne
Verdünnungs-
lösung)
Abbildung 1. Herstellung der Standardkurve. Stellen Sie die Verdünnungen des Kitstandards
für jeden ELISA-Durchgang frisch her.
4. Rekonstituieren Sie das gefriergetrocknete 100x Konjugatkonzentrat mit 0,3 ml
entionisiertem oder destilliertem Wasser. Mischen Sie das Fläschchen vorsichtig, um die
Schaumbildung zu minimieren, und vergewissern Sie sich, dass das Konjugat
vollständig gelöst wurde.
Das gebrauchsfertig verdünnte Konjugat wird hergestellt, indem Sie die erforderliche
Menge des rekonstituierten 100x Konjugatkonzentrats wie in Tabelle 1 (Vorbereitung
des Konjugats) angegeben in grüner Verdünnungslösung verdünnen.
16 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013Tabelle 1. Vorbereitung des Konjugats
Anzahl der Menge an Menge an
Streifen 100x grüner
Konjugatkonzentrat Verdünnungslösung
2 10 µl 1,0 ml
3 15 µl 1,5 ml
4 20 µl 2,0 ml
5 25 µl 2,5 ml
6 30 µl 3,0 ml
7 35 µl 3,5 ml
8 40 µl 4,0 ml
9 45 µl 4,5 ml
10 50 µl 5,0 ml
11 55 µl 5,5 ml
12 60 µl 6,0 ml
• Mischen Sie gründlich, aber vorsichtig, um Schaumbildung zu vermeiden.
• Nicht verbrauchtes 100x Konjugatkonzentrat sofort nach Gebrauch wieder bei 2 °C
bis 8 °C lagern.
• Nur die grüne Verdünnungslösung verwenden.
5. Plasmaproben, die den Blutentnahmeröhrchen entnommen wurden und vor dem Test
tiefgekühlt oder länger als 24 Stunden gelagert wurden, müssen vor dem Einbringen in
die ELISA-Wells sorgfältig gemischt werden.
• Wenn die Plasmaproben direkt aus den zentrifugierten QFT-Röhrchen zugegeben
werden, ist jedes Mischen des Plasmas zu vermeiden.
6. Geben Sie mit Hilfe einer Mehrkanalpipette je 50 µl des frisch zubereiteten
gebrauchsfertig verdünnten Konjugats in alle benötigten Wells der ELISA-Platte.
7. Geben Sie je 50 µl der Plasmaproben mit einer Mehrkanalpipette in die entsprechenden
Wells (siehe empfohlener Plattenbelegungsplan auf Seite 18, Abbildungen 2A und 2B).
Geben Sie schließlich je 50 µl der Standards 1 bis 4 in die entsprechenden Wells.
QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013 171 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 1N 1A 1M S1 S1 S1 13N 13A 13M 21N 21A 21M
B 2N 2A 2M S2 S2 S2 14N 14A 14M 22N 22A 22M
C 3N 3A 3M S3 S3 S3 15N 15A 15M 23N 23A 23M
D 4N 4A 4M S4 S4 S4 16N 16A 16M 24N 24A 24M
E 5N 5A 5M 9N 9A 9M 17N 17A 17M 25N 25A 25M
F 6N 6A 6M 10N 10A 10M 18N 18A 18M 26N 26A 26M
G 7N 7A 7M 11N 11A 11M 19N 19A 19M 27N 27A 27M
H 8N 8A 8M 12N 12A 12M 20N 20A 20M 28N 28A 28M
Abbildung 2A. Empfohlene Plattenbelegung bei Verwendung von Negativkontrolle-, TB-Antigen- und
Mitogen-Röhrchen (28 Tests pro Platte).
• S1 (Standard 1), S2 (Standard 2), S3 (Standard 3), S4 (Standard 4)
• 1N (Probe 1. Negativkontrolle-Plasma), 1A (Probe 1. TB-Antigen-Plasma), 1M (Probe
1. Mitogen-Plasma)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 1N 5N 9N 13N 17N S1 S1 25N 29N 33N 37N 41N
B 1A 5A 9A 13A 17A S2 S2 25A 29A 33A 37A 41A
C 2N 6N 10N 14N 18N S3 S3 26N 30N 34N 38N 42N
D 2A 6A 10A 14A 18A S4 S4 26A 30A 34A 38A 42A
E 3N 7N 11N 15N 19N 21N 23N 27N 31N 35N 39N 43N
F 3A 7A 11A 15A 19A 21A 23A 27A 31A 35A 39A 43A
G 4N 8N 12N 16N 20N 22N 24N 28N 32N 36N 40N 44N
H 4A 8A 12A 16A 20A 22A 24A 28A 32A 36A 40A 44A
Abbildung 2B. Empfohlene Plattenbelegung bei Verwendung von Negativkontrolle- und TB-
Antigen-Röhrchen (44 Tests pro Platte).
• S1 (Standard 1), S2 (Standard 2), S3 (Standard 3), S4 (Standard 4)
• 1N (Probe 1. Negativkontrolle-Plasma), 1A (Probe 1. TB-Antigen-Plasma)
8. Mischen Sie Konjugat und Plasmaproben/Standards 1 Minute lang gründlich auf einem
Schüttler für Mikrotiterplatten.
9. Decken Sie jede Platte mit einem Deckel ab und inkubieren Sie die Platten
120 ± 5 Minuten lang bei Raumtemperatur (22 °C ± 5 °C).
• Die Platten sollten während der Inkubation keinem direkten Sonnenlicht ausgesetzt
sein.
10. Verdünnen Sie während der Inkubationszeit 1 Teil 20x Waschpufferkonzentrat mit 19
Teilen entionisiertem oder destilliertem Wasser und mischen Sie sorgfältig. Im
18 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013Lieferumfang ist ausreichend 20x Waschpufferkonzentrat zur Herstellung von 2 Litern
gebrauchsfertig verdünntem Waschpuffer vorhanden.
Waschen Sie die Wells mindestens 6-mal mit je 400 µl gebrauchsfertig verdünntem
Waschpuffer. Wir empfehlen die Verwendung eines Waschautomaten für
Mikrotiterplatten.
• Sorgfältiges Waschen ist für die Leistung des Tests sehr wichtig. Achten Sie bei
jedem Waschzyklus darauf, dass alle Wells vollständig bis oben mit Waschpuffer
gefüllt sind. Es empfiehlt sich, den Waschpuffer bei jedem Zyklus mindestens
5 Sekunden einwirken zu lassen.
• In den Auffangbehälter für Abfallflüssigkeit sollte ein laborübliches Desinfektionsmittel
gegeben werden. Befolgen Sie zudem die in Ihrem Labor geltenden Anweisungen
zur Dekontamination potenziell infektiösen Materials.
11. Klopfen Sie die Platten umgekehrt auf einem fusselfreien Papierhandtuch aus, um noch
vorhandenen Waschpuffer zu entfernen. Geben Sie 100 µl der Enzymsubstratlösung in
jedes Well und mischen Sie gründlich auf einem Schüttler für Mikrotiterplatten.
12. Decken Sie jede Platte mit einem Deckel ab und inkubieren Sie die Platten 30 Minuten
lang bei Raumtemperatur (22 °C ± 5 °C).
• Die Platten sollten während der Inkubation keinem direkten Sonnenlicht ausgesetzt
sein.
13. Geben Sie nach der 30-minütigen Inkubation 50 µl Enzymstopplösung in jedes Well
und mischen Sie anschließend.
• Die Enzymstopplösung sollte in der gleichen Reihenfolge und etwa im gleichen
Tempo in die Wells gegeben werden wie das Substrat in Schritt 11.
14. Messen Sie innerhalb von 5 Minuten nach Stoppen der Reaktion die optische Dichte
(OD) jedes Wells mit einem Mikrotiterplatten-Photometer unter Verwendung eines
450-nm-Filters und eines Referenzfilters zwischen 620 und 650 nm. Die OD-Werte
werden für die Berechnung der Ergebnisse benötigt.
QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013 197. Berechnungen und Auswertung des Tests
Für die Analyse der Rohdaten und die Berechnung der Ergebnisse wird die QFT-
Analysesoftware verwendet. Sie kann im Internet unter www.QuantiFERON.com
heruntergeladen werden. Bitte achten Sie darauf, immer mit der neuesten Version der
Software zu arbeiten.
Die Software führt eine Qualitätskontrolle des Tests durch, erstellt eine Standardkurve und
liefert für jeden Patienten ein Testergebnis nach der im Abschnitt „Interpretation der
Ergebnisse“ beschriebenen Methode.
Alternativ zur Verwendung der QFT-Analysesoftware können die Ergebnisse auch wie im
Folgenden beschrieben ermittelt werden.
Erstellung der Standardkurve
(bei Nichtverwendung der QFT-Analysesoftware)
Ermitteln Sie für jede Platte die mittleren OD-Werte der Kitstandard-Mehrfachbestimmungen.
Erstellen Sie eine log(e)-log(e)-Standardkurve durch Auftragen des log(e) des OD-Mittelwerts
(y-Achse) gegen den log(e) der IFN-γ-Konzentration der Standards in IU/ml (x-Achse), unter
Nichtberücksichtigung des Nullstandards. Berechnen Sie dann die Regressionsgerade für
diese Punkte.
Ermitteln Sie anhand der Standardkurve die IFN-γ-Konzentration (IU/ml) der einzelnen
Plasmaproben anhand ihrer OD-Werte.
Für diese Berechnungen können Software-Pakete für Mikrotiterplatten-Photometer verwendet
werden oder gängige Tabellenkalkulations- und Statistik-Programme (wie beispielsweise
Microsoft® Excel®). Wir empfehlen die Verwendung solcher Software-Pakete zur
Durchführung der Regressionsanalyse und zur Berechnung des Variationskoeffizienten
(%CV) der Standards sowie des Korrelationskoeffizienten (r) der Standardkurve.
Qualitätskontrolle des Tests
Die Genauigkeit der Testergebnisse hängt von der Erstellung einer korrekten Standardkurve
ab. Daher müssen die Ergebnisse der Standards vor Auswertung der Testergebnisse geprüft
werden.
Der ELISA liefert gültige Ergebnisse, wenn alle nachstehenden Kriterien erfüllt sind:
Der Mittelwert der OD von Standard 1 muss ≥ 0,600 sein.
Der prozentuale Variationskoeffizient (%CV) der OD-Werte der
Mehrfachbestimmungen von Standard 1 und Standard 2 muss ≤ 15 % sein.
Die OD-Werte der Mehrfachbestimmungen von Standard 3 und Standard 4 dürfen
höchstens um 0,040 OD-Einheiten vom jeweiligen Mittelwert abweichen.
Der aus den mittleren Absorptionswerten der Standards berechnete
Korrelationskoeffizient (r) muss ≥ 0,98 sein.
20 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013Diese Qualitätskontrollparameter werden von der QFT-Analysesoftware berechnet und
ausgegeben.
Werden die obigen Kriterien nicht erfüllt, ist der Test ungültig und muss wiederholt werden.
Der Mittelwert der OD des Nullstandards (grüne Verdünnungslösung) sollte ≤ 0,150 sein.
Wenn der mittlere OD-Wert > 0,150 ist, sollte das Verfahren zum Waschen der Platten
überprüft werden.
Interpretation der Ergebnisse
Die Ergebnisse des QFT-Tests werden gemäß den folgenden Kriterien interpretiert:
Hinweis: Die Diagnose bzw. der Ausschluss einer Tuberkulose-Erkrankung sowie die
Beurteilung der Wahrscheinlichkeit einer LTBI erfordern eine Kombination von
epidemiologischen, anamnestischen, medizinischen und diagnostischen Ergebnissen; diese
müssen bei der Interpretation der QFT-Testergebnisse (Tabellen 2 und 3) in Betracht
gezogen werden.
Tabelle 2. Bei Verwendung von Negativkontrolle-, TB-Antigen- und Mitogen-Röhrchen
Negativ- TB Antigen minus Mitogen minus Ergebnis QFT- Bericht/Interpretation
kontrolle Negativkontrolle Negativkontrolle Test
(IU/ml) (IU/ml) (IU/ml)*
< 0,35 Negativ Infektion mit M. tuberculosis
≥ 0,5
NICHT wahrscheinlich
≥ 0,35 und < 25 % Infektion mit M. tuberculosis
des Negativkontrolle- ≥ 0,5 Negativ
NICHT wahrscheinlich
Werts
≥ 0,35 und ≥ 25 %
Infektion mit M. tuberculosis
≤ 8,0 des Negativkontrolle- beliebig Positiv†
wahrscheinlich
Werts
< 0,35 < 0,5 Ergebnis uneindeutig hinsichtlich
Uneindeutig‡
TB-Antigenreaktivität
≥ 0,35 und < 25 %
Ergebnis uneindeutig hinsichtlich
des Negativkontrolle- < 0,5 Uneindeutig‡
TB-Antigenreaktivität
Werts
Ergebnis uneindeutig hinsichtlich
> 8,0§ beliebig beliebig Uneindeutig‡
TB-Antigenreaktivität
∗ Die Werte der Mitogen-Positivkontrolle (und gelegentlich auch die TB-Antigen-Werte) liegen häufig
außerhalb des Messbereichs des Mikrotiterplatten-Photometers. Dies hat für die Testergebnisse keine
Konsequenzen.
†
In Fällen, in denen eine Infektion mit M. tuberculosis nicht vermutet wird, können anfänglich positive
Ergebnisse durch erneutes Testen der Original-Plasmaproben in Doppelbestimmung im QFT-ELISA bestätigt
werden. Ergibt die Testwiederholung bei mindestens einer der zwei Probenmessungen ein positives
Ergebnis, so ist das Testergebnis als positiv zu bewerten.
‡
Mögliche Ursachen siehe Abschnitt „Hilfe zur Fehlerbehebung“.
§
In klinischen Studien wiesen weniger als 0,25 % der Teilnehmer eine IFN-γ Konzentration von > 8,0 IU/ml
bei der Negativkontrolle auf.
QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013 21Aus der Höhe der gemessenen IFN-γ-Konzentration lassen sich keine Rückschlüsse auf das
Stadium oder den Grad der Infektion, das Ausmaß der Immunreaktivität oder die
Wahrscheinlichkeit einer Progression zu einer aktiven Erkrankung ziehen.
Nein
Nej TB-Antigen – Negativkontrolle
TB-antigen – Nil
Interpretation
Fortolkning ≥0,35 IU/ml
≥ 0,35 IE/ml
Ja
Nein
Nej TB-Antigen – Negativkontrolle
TB-antigen
≥25 % – Nil ≥ 25 % in
der Negativkontrolle
af Nil IE/ml-værdien
IU/ml
Ja
Ja Nein
Nej
Mitogen-Negativk.
Mitogen – Nil 8,0IE/ml
IU/ml
Ubestemmeligt Nil ≤ 8,0 IE/ml
≤ 8,0 IU/ml
Nej Ja
Nein
Negativ Positiv
Abbildung 3. Flussdiagramm zur Interpretation bei Verwendung von Negativkontrolle-, TB-Antigen-
und Mitogen-Röhrchen
Tabelle 3. Bei Verwendung von nur Negativkontrolle- und TB-Antigen-Röhrchen
Negativko TB Antigen minus Ergebnis QFT-Test Bericht/Interpretation
ntrolle Negativkontrolle
(IU/ml) (IU/ml)
< 0,35 Infektion mit M. tuberculosis NICHT
Negativ
wahrscheinlich
≥ 0,35 und < 25 % des Infektion mit M. tuberculosis NICHT
≤ 8,0 Negativ
Negativkontrolle-Werts wahrscheinlich
≥ 0,35 und ≥ 25 % des Infektion mit M. tuberculosis
Positiv*
Negativkontrolle-Werts wahrscheinlich
Ergebnis uneindeutig hinsichtlich TB-
> 8,0† beliebig Uneindeutig‡
Antigenreaktivität
* In Fällen, in denen eine Infektion mit M. tuberculosis nicht vermutet wird, können anfänglich positive
Ergebnisse durch erneutes Testen der Original-Plasmaproben in Doppelbestimmung im QFT-ELISA bestätigt
werden. Ergibt die Testwiederholung bei mindestens einer der zwei Probenmessungen ein positives
Ergebnis, so ist das Testergebnis als positiv zu bewerten.
†
In klinischen Studien wiesen weniger als 0,25 % der Teilnehmer eine IFN-γ Konzentration von > 8,0 IU/ml
bei der Negativkontrolle auf.
‡
Mögliche Ursachen siehe Abschnitt „Hilfe zur Fehlerbehebung“.
Aus der Höhe der gemessenen IFN-γ-Konzentration lassen sich keine Rückschlüsse auf das
Stadium oder den Grad der Infektion, das Ausmaß der Immunreaktivität oder die
Wahrscheinlichkeit einer Progression zu einer aktiven Erkrankung ziehen.
22 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013Nein
Nej TB-Antigen – Negativkontrolle
TB-antigen – Nil
Interpretation
Fortolkning ≥0,35 IU/ml
≥ 0,35 IE/ml
Ja
Nein
Nej TB-Antigen – Negativkontrolle
TB-antigen – Nil ≥ 25 %
≥25 % der Negativkontrolle in
af Nil IE/ml-værdien
IU/ml
Ja
Nein
Nej
Negativkontrolle
Validierung
Validering Uneindeutig
Ubestemmeligt Nil ≤ 8,0 IE/ml
≤ 8,0 IU/ml
Ja
Negativ Positiv
Abbildung 4. Flussdiagramm zur Interpretation bei Verwendung von nur Negativkontrolle- und TB-
Antigen-Röhrchen
8. Grenzen des Verfahrens
Die Ergebnisse des QFT-Tests müssen im Zusammenhang mit der epidemiologischen
Anamnese jedes einzelnen Patienten, seinem derzeitigen Gesundheitszustand und sonstigen
diagnostischen Untersuchungen betrachtet werden.
Ergebnisse mit einem Negativkontrolle-Wert über 8 IU/ml werden als „uneindeutig“
bewertet, da eine um 25 % höhere Reaktion auf die TB-Antigene außerhalb des
Messbereichs des Tests liegen kann.
Unzuverlässige oder uneindeutige Ergebnisse können folgende Ursachen haben:
Abweichungen von dem in der Packungsbeilage zum QuantiFERON-TB Gold (QFT)
ELISA beschriebenen Verfahren
Übermäßig hohe IFN-γ-Konzentration in der Blutbahn oder Vorliegen von heterophilen
Antikörpern
Überschreitung der Frist von 16 Stunden zwischen Blutabnahme und Inkubation bei
37 °C
9. Leistungsmerkmale
Klinische Studien
Da kein definitiver Standard für die latente Tuberkuloseinfektion (LTBI) existiert, kann eine
Abschätzung der Werte für Empfindlichkeit und Spezifität des QFT-Tests nicht direkt
vorgenommen werden. Die Spezifität des QFT-Tests wurde annähernd abgeschätzt durch
Ermittlung der Falsch-positiv-Rate bei Personen mit geringem Risiko für eine
Tuberkuloseinfektion (keine Risikofaktoren bekannt). Die Empfindlichkeit wurde annähernd
abgeschätzt durch Auswertung von Patientengruppen mit durch Kultur bestätigter aktiver
Tuberkulose.
QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013 23Spezifität
In einer US-Studie mit 866 Probanden wurden bei der Durchführung des Tuberkulin-
Hauttests (THT) Blutproben für den QFT-Test genommen. Die demographischen Angaben
und Tuberkulose-Risikofaktoren wurden mit Hilfe eines Standardfragebogens zum Zeitpunkt
des Tests ermittelt. Von 391 der 432 Probanden ohne bekannte Risikofaktoren für eine
Infektion mit M. tuberculosis standen sowohl QFT- als auch THT-Ergebnisse zur Verfügung.
Keine dieser Personen war mit BCG geimpft. Eine zweite Studie zur Spezifität des QFT-Tests
wurde in Japan mit Teilnehmern mit geringem Risiko durchgeführt; etwa 90 % dieser
Personen waren mit BCG geimpft. Die Ergebnisse beider Spezifitätsstudien sind in Tabelle
4 dargestellt.
Tabelle 4. Spezifität des QFT-Tests: Ergebnisse bei Personen ohne bekannte
Risikofaktoren für eine Infektion mit M. tuberculosis
Studie BCG-Status Insgesamt Anzahl QFT Anzahl Spezifität Anzahl Spezifität
(% geimpft) getestet uneindeutig QFT QFT THT THT*
positiv / (95%-KI) positiv / (95%-KI)
Anzahl Anzahl
gültiger Tests
Tests
USA 0% 391 1 3/390 99,2 % 6/391 98,5 %
(unveröffentlicht) (98–100) (97–99)
Japan (15) ~ 90 % 168 6 2/162 98,8 % – –
(95–100)
Gesamt – 559 7/559 5/552 99,1 % – –
(1,3 %) (98–100)
* Bei Anwendung des THT-Grenzwerts von 10 mm für nicht BCG-geimpfte Personen. Bei Anwendung eines
Grenzwerts von 15 mm ergibt sich ein Schätzwert für die THT-Spezifität von 99,1 %.
Empfindlichkeit für aktive Tuberkulose
Zur Ermittlung der Empfindlichkeit des QFT-Tests wurden Personen mit Verdacht auf
Tuberkulose aus den USA, Australien und Japan getestet, deren M.-tuberculosis–Infektion
anschließend durch Kultur bestätigt wurde. Es gibt zwar für die latente Tuberkuloseinfektion
(LTBI) keinen definitiven Standardtest, jedoch ist eine mikrobiologische Kultur von M.
tuberculosis ein geeigneter Ersatz, da erkrankte Personen per Definition infiziert sind. Die
Patienten waren vor der Blutentnahme für den QFT-Test weniger als 8 Tage behandelt
worden.
Die Ergebnisse der 3 Gruppen von M.-tuberculosis–kulturpositiven Patienten sind in Tabelle 5
dargestellt. Insgesamt betrug die Empfindlichkeit des QFT-Tests für aktive Tuberkulose 89 %
(157/177).
24 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013Tabelle 5. QFT: Probanden mit durch Kultur bestätigter Infektion mit M. tuberculosis
Anzahl QFT positiv / Anzahl gültiger Empfindlichkeit QFT (95%-KI)
Studie
Tests
Japanische 86/92 93 % (86–97 %)
Tuberkulosepatienten (15)
Australien 24/27 89 % (70–97 %)
USA 47/58 81 % (68–90 %)
Gesamt 157/177 89 % (83–93 %)
Diagnosestellung einer LTBI
Es wurde eine Reihe von Studien veröffentlicht, die die Leistung des QFT-Tests bei
verschiedenen LTBI-Risikopopulationen belegen. Die wichtigsten Daten einiger ausgewählter
Studien sind in Tabelle 6 dargestellt.
QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013 25Tabelle 6. Ausgewählte veröffentlichte Studien zum Einsatz des QFT-Tests bei LTBI-
Risikopopulationen
Getestete Ergebnisse
Studie
Personen
Healthcare workers in 726 Umfeld mit sehr hohen Tuberkuloseraten. 40 % QFT-positiv
India (Pai, et al 2005) (26) und 41 % THT-positiv bei Grenzwert 10 mm. Hohe
Übereinstimmung mit THT, auf beiden Seiten kein Effekt von
BCG. Bei beiden Tests Zusammenhang mit den
Risikofaktoren Alter und Dauer der Beschäftigung im
Gesundheitswesen.
Danish HIV+ patients 590 Gesamtprävalenz der LTBI laut QFT betrug bei HIV-positiven
(Brock, et al 2006) (5) Patienten 4,6 % (27/590). Positive Ergebnisse waren mit
Tuberkulose-Risikofaktoren assoziiert. Zwei QFT-positive
Probanden entwickelten innerhalb von 1 Jahr eine aktive
Tuberkulose. Uneindeutige Ergebnisse (n = 20; 3,4 %) waren
signifikant assoziiert mit einer CD4-Zellzahl von < 100/µl.
Hospitalized children in 105 Kinder mit Tuberkuloseverdacht oder mit vorangegangenem
India Tuberkulosekontakt wurden mit QFT und THT getestet;
(Dogra, et al 2006) (10) 10,5 % QFT-positiv und 9,5 % THT-positiv bei Grenzwert
10 mm. Übereinstimmung der Tests betrug insgesamt 95,2 %
und bei nicht BCG-Geimpften 100 %.
Contact investigations in 309 Enge Kontaktpersonen von 15 Indexfällen wurden getestet.
Germany (Diel, et al 51 % dieser Personen waren BCG-geimpft, 27 % im Ausland
2006) (9) geboren. 70 % der BCG-Geimpften und 18 % der
Ungeimpften waren THT-positiv (5 mm), beim QFT-Test
betrugen die Werte 9 % bzw. 11 %. Das QFT-Ergebnis war
mit dem Tuberkulose-Risiko assoziiert. Das THT-Ergebnis war
nur mit dem BCG-Impfstatus assoziiert.
Die Leistung der weniger empfindlichen Flüssigantigen-Version von QuantiFERON-TB Gold
(Vorläufertest des QFT) und des QFT-Tests ist in vielen weiteren Veröffentlichungen
beschrieben. In diesen Studien wurden die Tests eingesetzt bei Kontaktpersonen von
Patienten mit aktiver Tuberkulose (9, 11, 19, 25), Kindern (6-10, 25, 28), HIV-positiven
Patienten (2, 5, 20), medizinischem Personal (13, 26, 32), immunsupprimierten Patienten
(3, 4, 22, 23, 27, 30, 31), Personen mit Tuberkuloseverdacht (7, 8, 10, 18) sowie solchen
mit geringem Risiko (15).
Wiederholbarkeit und Effekt eines THT auf spätere QFT-Test
Im Rahmen der US-Spezifitätsstudie wurde eine Untergruppe der Probanden 4 bis
5 Wochen nach dem ersten QFT- und THT-Test erneut getestet. Für 260 Probanden lagen
QFT-Ergebnisse von beiden Zeitpunkten vor; die Übereinstimmung betrug 99,6 %
(259/260). Ein vorangegangener THT führte nicht zu einer positiven QFT-Reaktion.
26 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/201310. Technische Informationen
Uneindeutige Ergebnisse
Uneindeutige Ergebnisse sollten nur selten auftreten. Sie können mit dem Immunstatus des
untersuchten Patienten zusammenhängen, sie können aber auch durch verschiedene
technische Faktoren bedingt sein:
Überschreitung der Frist von 16 Stunden zwischen Blutabnahme und Inkubation
bei 37 °C
Lagerung der Blutprobe außerhalb des empfohlenen Temperaturbereichs (17 °C bis
27 °C)
Unzureichendes Mischen der Blutentnahmeröhrchen
Unzureichendes Waschen der ELISA-Platte
Falls technische Probleme bei der Blutabnahme oder der Handhabung der Blutproben
vermutet werden, sollte der gesamte QFT-Test mit neuen Blutproben wiederholt werden.
Falls unzureichendes Waschen oder andere Verfahrensabweichungen bei der Durchführung
des ELISA-Tests vermutet werden, kann der ELISA-Test mit den stimulierten Plasmaproben
wiederholt werden. Bei uneindeutigen Ergebnissen aufgrund niedriger Mitogen-Werte oder
hoher Negativkontrolle-Werte wird auch bei einer Wiederholung kein anderes Ergebnis
erwartet, sofern beim ELISA-Test kein Fehler gemacht wurde. Uneindeutige Ergebnisse
sollten als solche weitergegeben werden. Der Arzt kann dann gegebenenfalls eine neue
Blutprobe entnehmen oder je nach Bedarf sonstige Untersuchungen in Betracht ziehen.
Geronnene Plasmaproben
Falls bei längerer Lagerung der Plasmaproben Fibringerinnsel auftreten, sind die Proben bis
zur Sedimentbildung zu zentrifugieren, um ein Pipettieren des Plasmas zu ermöglichen.
QuantiFERON-TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013 27Hilfe zur Fehlerbehebung
In diesem Abschnitt finden Sie nützliche Hinweise, die Ihnen bei der Lösung eventuell
auftretender Probleme helfen können. Weitere Informationen finden Sie auch im Internet
unter www.QuantiFERON.com. Kontaktmöglichkeiten finden Sie auf der hinteren
Umschlagseite.
Problembehebung beim ELISA
Unspezifische Farbentwicklung
Mögliche Ursache Lösung
a) Platte unzureichend Waschen Sie die Platte mindestens 6-mal mit 400 µl
gewaschen Waschpuffer pro Well. Je nach verwendetem
Waschgerät können mehr als 6 Waschzyklen
erforderlich sein. Der Waschpuffer sollte bei jedem
Zyklus mindestens 5 Sekunden einwirken können.
b) Kreuzkontamination der ELISA- Sorgfältiges Pipettieren und Mischen der Proben
Wells minimiert dieses Risiko.
c) Kit/Komponenten abgelaufen Vergewissern Sie sich, dass der Kit vor Ablauf des
Verfallsdatums eingesetzt wird. Achten Sie darauf, dass
Standard und 100x Konjugatkonzentrat nur innerhalb
von drei Monaten nach ihrer Rekonstitution verwendet
werden.
d) Enzymsubstratlösung ist Verwerfen Sie die Substratlösung, wenn sie blau
verunreinigt gefärbt ist. Stellen Sie sicher, dass die verwendeten
Reagenzienbehälter sauber sind.
e) Mischen des Plasmas in den Vermeiden Sie nach der Zentrifugation jegliches Auf-
Zentrifugenröhrchen vor und Abpipettieren oder Mischen vor Abnahme des
Abnahme des Plasmas Plasmas. Achten Sie stets darauf, dass das Material an
der Oberfläche des Gels nicht aufgewirbelt wird.
Niedrige OD-Werte bei der
Standardlösung
Mögliche Ursache Lösung
a) Fehler beim Verdünnen der Stellen Sie sicher, dass die Verdünnungen des
Standardlösung Kitstandards wie in der Packungsbeilage des QFT
ELISA angegeben hergestellt werden.
b) Pipettierfehler Stellen Sie sicher, dass die Pipetten gemäß den
Herstellerempfehlungen kalibriert und verwendet
werden.
c) Inkubationstemperatur zu Die Inkubation des ELISA sollte bei Raumtemperatur
niedrig (22 °C ± 5 °C) durchgeführt werden.
d) Inkubationszeit zu kurz Die Inkubation der Platte mit Konjugat, Standards und
Proben sollte für 120 ± 5 Minuten erfolgen. Die
Enzymsubstratlösung wird für 30 Minuten auf der Platte
inkubiert.
28 QuantiFERON TB Gold (QFT) ELISA Packungsbeilage 07/2013Sie können auch lesen
