STABILITY OF GLUTEN-CLEAVING ENZYMES IN THE GASTROINTESTINAL TRACT

DISS. ETH Nr. 20895

STABILITY OF GLUTEN-CLEAVING ENZYMES IN THE
          GASTROINTESTINAL TRACT

                A dissertation submitted to

                      ETH ZURICH

                     For the degree of

                DOCTOR OF SCIENCES

                       Presented by

                GREGOR FUHRMANN

            Pharmacist, Freie Universität Berlin

                  Born 3 February 1982

                    Citizen of Germany

            Accepted on the recommendation of

        Prof. Dr. Jean-Christophe Leroux (examiner)

            Prof. Dr. Peter Walde (co-examiner)

                           2013

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Summary and aims

I.1     Summary

        Celiac disease (CD) is a severe and highly prevalent (up to 1% worldwide) autoimmune
disease of the small intestine that is triggered by the ingestion of cereal proteins (i.e., gluten) from
wheat, barley, and rye. The disease can be associated with gastrointestinal (GI) (e.g., diarrhea,
malabsorption, lymphoma and adenocarcinoma) and non-GI symptoms (e.g., osteoporosis or
depression). To date, the only available treatment for CD is a gluten-free diet. However, this diet
is difficult to maintain due to the omnipresence of gluten in the western nutrition. Thus,
pharmacological treatments which would allow patients on a gluten-free diet to occasionally
consume small amounts of gluten are desirable. Among the investigated adjuvant therapeutic
strategies, the use of proline-specific endopeptidases (PEPs) is particularly promising. However,
due to their proteinaceous nature, PEPs are subject to digestion and inactivation in the harsh
conditions encountered in the GI tract (low pH and presence of digestive peptidases). In this
work, the stability and activity of PEPs derived from Flavobacterium meningosepticum (FM),
Myxococcus xanthus (MX) and Sphingomonas capsulate (SC) were examined in detail.
        A novel, non-invasive method for the measurement of exogenous enzyme activity in the
GI tract in real-time was developed. Under simulated in vitro conditions PEPs showed poor
stability profiles. In order to analyze their activity in vivo, the short peptide LPYPQP (derived
from a longer immunotoxic gluten peptide) was labeled with a fluorescent dye (λ em = 700 nm)
and corresponding quencher. Peptide and PEPs were orally administered to rats and digestion of
the peptide was monitored using an optical in vivo imaging system. The imaging experiments
revealed significant differences in the in vivo activity of PEPs that could not be predicted from
the previously obtained in vitro data. Although all PEPs were rapidly inactivated in simulated
gastric conditions, FM showed some activity in the rat's stomach. MX was not active at low pH,
but co-administration of magaldrate (an antacid drug) increased the activity of the enzyme in the
stomach by raising the local pH and consequently inactivating stomach peptidases. In the small
intestine, both FM and MX enzymes mediated comparable peptide cleavage as detected by the
fluorescent signals. Although MX was not active in the stomach (in absence of antacid drugs), it
partially recovered its function upon reaching the small intestine. This finding suggested potential
regeneration of enzyme conformation at intestinal pH.
        Covalent conjugation of polymers to PEPs was subsequently investigated as a means to
enhance their stability. Modification with polymers is indeed a well-known strategy to improve

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Summary and aims

the half-life of protein drugs. Polymers including a first generation dendronized polymer (PG1),
methoxy poly(ethylene glycol) (mPEG), and poly(acrylic acid) (PAA) were conjugated to PEPs
and the resulting modifications were tested in vitro and in vivo using the methods established
before. mPEG and PAA were conjugated to PEPs via secondary amine bond formation by
reductive alkylation, while PG1 was coupled via a bis-aryl hydrazone bond. mPEG and PAA
induced a small to moderate improvement of in vitro stability. The most pronounced effect was
found for PG1 which was also the only conjugate that drastically diminished the abundance of
CD-immunogenic peptides under simulated GI conditions. Based on the in vitro screening,
conjugates of MX were selected for in vivo analysis, because the native form of this enzyme was
not active in the stomach. Significant differences were observed upon the oral administration of
PEP and PEP–polymer conjugates (bearing PG1, mPEG, and PAA). The conjugation of mPEG
and PAA increased the activity of MX in the small intestine. Interestingly, MX–PG1 was active
in the stomach, suggesting a highly beneficial effect of this cationic dendronized polymer on the
enzyme stability in the gastric environment. MX–PG1 maintained its activity for up to 3 h in the
stomach after oral administration. Analysis of the transit of fluorescently labeled MX–PG1 in the
GI tract showed a long lasting bioadhesion to the stomach mucosa for at least 6 h.
        In summary, the activity of PEPs under in vivo conditions using a novel, non-invasive
fluorescence method was studied. With the help of this assay, important differences between the
in vitro and in vivo data were observed, which highlight the usefulness of this real-time assay.
Moreover, this method was successfully exploited for the improvement of PEP performance via
polymer modification. Enzyme conjugates with a new dendronized polymer were highly stable
under gastric conditions in rats. Besides, these PEP–polymer hybrids showed significant and
long-lasting mucoadhesion. Such results can be instrumental for modification of other orally
administered enzymes used in other pathologies such as phenylketonuria or pancreatic
insufficiency. To date, efficient stabilization of oral enzymes in the GI tract is only sparsely
investigated. Hence, this work could substantially help improving and exploiting the use of
exogenous enzymes in human medicine.

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Summary and aims

I.2     Zusammenfassung

        Zöliakie ist eine schwerwiegende und hochprävalente (bis zu 1% weltweit) Autoimmun-
erkrankung des Dünndarms, die durch die Aufnahme von Getreideproteinen (Gluten) aus
Weizen, Gerste und Roggen hervorgerufen wird. Die Erkrankung äussert sich in
gastrointestinalen (GI) (z.B. Diarrhöe, Malabsorption, Lymphoma und Adenokarzinoma) und
nicht-GI Symptomen (z.B. Osteoporose oder Depression). Als derzeit einzige verfügbare
Therapie für Zöliakie gilt die glutenfreie Ernährung. Allerdings ist eine solche Diät schwer
einzuhalten, da Gluten in der westlichen Ernährung allgegenwärtig ist. Daher sind
pharmakologische Behandlungsmöglichkeiten, die eine gelegentliche Aufnahme kleiner Mengen
Gluten erlauben, wünschenswert. Unter den erforschten Strategien gilt die Verwendung von
Prolin-spezifischen Endopeptidasen (PEPs) als besonders vielversprechend. Als Protein werden
PEPs unter den rauen Bedingungen des GI Traktes (niedriger pH und andere Peptidasen) jedoch
leicht inaktiviert und verdaut. In dieser Arbeit wurden die Stabilität und Aktivität von PEPs und
PEP-Polymer-Konjugaten in vitro und in vivo untersucht; die verwendeten PEPs stammten von
Flavobacterium meningosepticum (FM), Myxococcus xanthus (MX) and Sphingomonas
capsulate (SC).
        Unter simulierten in vitro Bedingungen zeigten die nativen PEPs eine geringe Stabilität.
Zur Messung exogener Enzymaktivität in Echtzeit im GI Trakt wurde eine neuartige, nicht-
invasive Methode entwickelt. Dazu wurde das von einem längeren immunogenen Glutenpeptid
abgeleitete kurze Peptid LPYPQP an einem Ende mit einem Fluoreszenzfarbstoff (λ em = 700
nm) und am anderen Ende mit einem fluoreszenzlöschenden Molekül (Quencher) markiert.
Peptid und PEPs wurden Ratten oral verabreicht und die Spaltung des Peptids wurde mittels
optischem in vivo Bildgebungsverfahren anhand der Fluoreszenzentwicklung untersucht. Diese in
vivo Messungen ergaben signifikante Unterschiede gegenüber den in vitro gemessenen
Aktivitäten der PEPs. Obwohl alle PEPs unter simulierten gastrischen Bedingungen in vitro rasch
inaktiviert wurden, zeigte FM im Rattenmagen eine geringe Aktivität. MX war bei niedrigem pH
inaktiv; durch gleichzeitige Verabreichung von Magaldrat (ein Antazidum) konnte die Aktivität
von MX jedoch erhöht werden, was durch ein Anheben des gastrischen pH-Wertes und der damit
verbundenen Inaktivierung von Magenpeptidasen erklärt werden kann. Im Dünndarm zeigten
beide Enzyme vergleichbare Fluoreszenzsignale. Obwohl MX im Magen (in Abwesenheit von
Antazida) inaktiv war, konnte es seine Funktion im Dünndarm teilweise wieder erlangen. Diese

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Summary and aims

Ergebnisse deuten auf eine mögliche Regeneration der Enzymkonformation im neutralen pH
Milieu des Dünndarms hin.
        In der Absicht, die Stabilität der Enzyme zu erhöhen, wurden diese kovalent an Polymere
gebunden. Protein-Polymer-Konjugation ist eine bekannte Strategie, um die Stabilität und
Halbwertszeit von protein-basierten Arzneistoffen zu erhöhen. Die Auswahl der Polymere zur
Konjugation        umfasste   ein   dendronisiertes   Polymer    erster   Generation    (PG1),
Methoxypolyethylenglykol (mPEG) und Polyacrylsäure (PAA). mPEG und PAA wurden mittels
sekundärer Aminbindung durch reduktive Alkylierung und PG1 durch bis-Arylhydrazonbindung
an die PEPs gekoppelt. mPEG- und PAA-Konjugate verbesserten die in vitro Stabilität nur gering
bis mittelmässig. Ein ausgeprägter Effekt wurde jedoch mit den PG1-Konjugaten festgestellt. Die
PG1-Konjugate vermochten sogar die Entstehung von Zöliakie-immunogenen Peptiden in vitro
drastisch zu reduzieren. Basierend auf den in vitro Ergebnissen wurden Konjugate von MX auch
in vivo untersucht, da dieses Enzym in nativer Form im Magen überhaupt keine Aktivität gezeigt
hatte. Nach oraler Verabreichung von PEP und PEP–Polymer Konjugaten (mit PG1, mPEG und
PAA) wurden signifikante Aktivitätsunterschiede festgestellt. Die Konjugation an mPEG und
PAA verbesserte die Aktivität von MX im Dünndarm. MX–PG1 war sogar im Magen aktiv, was
auf einen enzymstabilisierenden Effekt dieses kationischen Polymers im gastrischen Milieu
hindeutet. Zudem blieb MX–PG1 im Magen bis zu 3 h nach oraler Verabreichung aktiv. Eine
Analyse des Transitverhaltens von fluoreszenzmarkiertem MX–PG1 im GI Trakt zeigte eine
mindestens 6 h dauernde Bioadhäsion an die Magenmukosa.
        Zusammenfassend wurde die Aktivität von PEPs unter in vivo Bedingungen mittels einer
neuartigen, nicht-invasiven fluoreszenzbasierten Methode studiert. Diese Untersuchung
offenbarte wesentliche Unterschiede zwischen in vitro und in vivo Ergebnissen, welche die
Nützlichkeit dieser Echtzeitanalyse unterstreichen. Ferner wurde die Methode erfolgreich zur
Verbesserung der Aktivität von PEPs mittels Konjugation an Polymere genutzt. Das
Enzymkonjugat mit einem dendronisierten Polymer war im Magen von Ratten sehr stabil. Dieses
PEP–Polymer Konjugat zeigte zudem signifikante und langanhaltende in vivo Mukoadhäsion.
Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse sind möglicherweise auch für andere oral applizierte
Enzyme relevant, wie beispielsweise Enzyme zur Therapie von Phenylketonurie oder
Pankreasinsuffizienz. Derzeit wird die Stabilisierung von oral verabreichten Enzymen nur selten
untersucht. Somit könnte diese Arbeit wesentlich dazu beitragen, exogene Enzyme zu verbessern
und diese für die Verwendung in der Humanmedizin nutzbar zu machen.

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