THERAPEUTISCHE NANOBODIES GEGEN SARS-COV-2 - ALPAKA-ANTIKÖRPER
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Alpaka-Antikörper
Therapeutische Nanobodies gegen
SARS-CoV-2
Target-Oberfläche (Epitop). Die Fc-Einheit am
THOMAS GÜTTLER 1, MATTHIAS DOBBELSTEIN 2 , DIRK GÖRLICH 1 Fuß des „Y“ ist glykosyliert, wodurch IgGs
1 MAX-PLANCK-INSTITUT FÜR MULTIDISZIPLINÄRE NATURWISSENSCHAFTEN,
bestimmte Effektorfunktionen aktivieren
GÖTTINGEN können. Durch ihre Komplexität müssen
2 INSTITUT FÜR MOLEKULARE ONKOLOGIE, UNIVERSITÄTSMEDIZIN GÖTTINGEN
mAbs aufwändig aus Säugerzellen gewonnen
werden, lange Produktionszeiten und hohe
Monoclonal immunoglobulins are widely successful as therapeutics Therapiekosten sind die Folge.
and have also been effective in treating COVID-19. However, their pro-
Kompakte Einzeldomänen-Antikörper
duction in mammalian cells is expensive and cannot be scaled to meet
im Nanometer-Format
the demand in a global pandemic. Camelid VHH antibodies (also called
Die Limitierungen von IgGs waren bereits in
nanobodies), however, can be manufactured cost-efficiently in bacteria den 1980er-Jahren abzusehen. Gleich meh-
or yeast. Here we highlight our progress in developing nanobodies that rere Laboratorien versuchten daher, kom-
effectively neutralize SARS-CoV-2 and its variants. pakte Mini-Antikörper zu entwickeln, die
sich kostengünstiger aus Mikroorganismen
DOI: 10.1007/s12268-022-1684-y
© Die Autoren 2022 (wie z. B. Escherichia coli oder Pichia pastoris)
gewinnen lassen. Fab-Fragmente [3] und
ó Sie werden eingesetzt als Immunsuppres- Wunder, denn mAbs verfügen über eine Einzelketten-Fv-Antikörper [4, 5] sind deut-
siva nach Organtransplantationen, in der exzellente Zielspezifität und lassen sich lich kleiner als IgGs, umfassen aber noch
Krebstherapie, bei der Behandlung von genau auf ihre Anwendung zuschneiden. mehrere Domänen aus leichter und schwerer
Autoimmunkrankheiten, Asthma, Allergien, Auch in der COVID-19-Pandemie kommen sie Kette (Abb. 1A). Kurz nach ihrer Entwick-
Infektionen und Osteoporose. Auch in der seit November 2020 bei der Prophylaxe und lung wurde entdeckt, dass allein eine isolier-
Diagnostik sind sie längst Standard. Die Rede Therapie von Risikopatienten zum Einsatz. te variable Ig-Domäne der schweren Kette
ist von monoklonalen Antikörpern (mAbs). Mit zwei schweren und zwei leichten Poly- eine beträchtliche Antigenaffinität aufweisen
Seit der Entwicklung der Hybridoma-Techno- peptidketten, die über Disulfidbrücken ver- kann [6]. Dies ließ auf kostengünstige Einzel-
logie durch Georges Köhler und César Mil- knüpft sind, ist das typisch Y-förmige domänen-Antikörper hoffen. Fehlt jedoch die
stein um das Jahr 1975 [1] und der ersten Immunglobulin G (IgG) ein relativ großes leichte Kette, muss die neu exponierte Ober-
klinischen Zulassung 1986 haben mAbs die und flexibles Molekül (Abb. 1A). Die Anti- fläche der schweren Kette so verändert wer-
Biomedizin buchstäblich revolutioniert. Sie genbindestellen (Paratope) werden von den den, dass die Ig-Domänen nicht aggregieren
machen inzwischen knapp ein Fünftel aller variablen Ig-Domänen der leichten und – kein einfaches Unterfangen, möchte man
neuen Medikamente und etwa die Hälfte der schweren Kette am Ende der Y-Arme gestellt. die ohnehin schwächere Epitopbindung
20 meistverkauften Pharmaka aus [2]. Kein Diese passen genau auf die entsprechende erhalten.
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A B C
˚ Abb. 1: Vergleich von IgGs und Nanobodies. A, Struktur von konventionellen IgGs. B, Schwere-Ketten IgGs. C, Nanobodies. Die konstanten (C) und
variablen (V) Ig-Domänen von leichter (L) und schwerer (H) Kette sind markiert. Disulfid-verbrückte Cysteinreste zwischen den Ketten sind violett
hervorgehoben. Die Antigenbindestellen sind hellblau (schwere Kette) bzw. dunkelblau (leichte Kette) unterlegt.
Eine Zufallsentdeckung an der Freien Uni- transkribierten mRNA dieser Zellen ließen bodies aus der Immunbibliothek und produ-
versität in Brüssel brachte in den späten sich nun die Nanobody-codierenden Bereiche zierten eine Auswahl dieser in E. coli.
1980er-Jahren den Durchbruch: Während durch PCR amplifizieren und klonieren.
eines Studentenkurses fielen in Dromedar- Hier zeigt die Nanobody-Technologie eine Hochwirksam gegen SARS-CoV-2
Seren Immunglobuline auf, die deutlich klei- ihrer größten Stärken: VHHs sind viel ein- Nicht jeder RBD-spezifische Nanobody kann
ner waren als herkömmliche IgGs [7]. Sie facher zu klonieren als Multidomänen-Anti- das Virus stoppen. Ob die ausgewählten
bestehen lediglich aus zwei verkürzten körper aus mehreren Ketten. In vergleichbar Nanobodies SARS-CoV-2 ausschalten, ermit-
schweren Ketten, in denen jeweils eine ein- wenigen Schritten ließ sich so das gesamte telten wir mit einem eigens entwickelten
zige variable Ig-Domäne das Paratop stellt VHH-Repertoire der Alpakas (∼108 indivi- Test, der das Virus sogar im frühen Stadium
(Abb. 1B). Diese Domänen lassen sich ohne duelle Sequenzen pro Tier) in einer Nano- der Infektion und in einzelnen Zellen detek-
Aggregationsprobleme oder Affinitätsverlust body-DNA-Bibliothek (wie man den Satz an tieren kann [9]. Dafür infizierten wir Zellkul-
abgetrennt vom Rest der schweren Kette pro- Nanobody-kodierenden Plasmiden nennt) turen mit dem Virus, das zu Beginn des ers-
duzieren, als VHH-Antikörper (Abb. 1C), auf- spiegeln. ten Lockdowns in der Göttinger Universitäts-
grund ihrer kompakten Größe auch Nanobo- klinik isoliert wurde. Zellen, die infolge der
dies genannt. Nanobodies lassen sich auch Die Suche nach der Nadel im Infektion neue Viruspartikel produzieren,
aus anderen Alt- und Neuweltkamelen Heuhaufen ließen sich mit fluoreszenzmarkierten anti-
(wie Alpakas) gewinnen. Die Selektion der antigenspezifischen Nano- RBD-Nanobodies per Mikroskop detektieren.
bodies aus dem Pool aller rekombinanten Versetzt man das Virus mit einem Nanobody,
SARS-CoV-2-spezifische Nanobodies VHHs gleicht der Suche einer Nadel im Heu- der die Infektion verhindert, bleibt das Fluo-
Das Spike-Protein auf der Oberfläche von haufen. Hierbei kommen Bakteriophagen reszenzsignal aus – man spricht dann von
SARS-CoV-2 ist ein hervorragendes pharma- zum Einsatz – Viren, die Bakterien infizieren Virus-neutralisierenden Nanobodies. 43 von
zeutisches Target. Mit dessen Rezeptorbin- und deren Biosynthesemaschinerie für ihre 60 getesteten Nanobodies waren in der Lage,
dedomäne (RBD) dockt das Virus an den Vermehrung kapern. Bei der Konstruktion das Virus zu stoppen.
zellulären Rezeptor ACE2 (angiotensin-con- der Immunbibliothek wird der VHH-codieren- Ein wichtiges Kriterium in der pharmazeu-
verting enzyme 2). Daraufhin fusionieren die de Bereich mit dem eines Bakteriophagen- tischen Entwicklung ist die minimale Dosis,
Membranen von Virus und Zelle, wodurch Hüllproteins fusioniert. Infiziert man nun bei der ein Antikörper wirksam ist. Die verab-
das Virusgenom in den Wirt eingeschleust Bakterien, die die Bibliothek exprimieren, so reichte Menge entscheidet über Nebenwir-
wird [8]. Unser Ziel war es, die Interaktion präsentiert ein Teil der neu produzierten kungen und nicht zuletzt über Produktions-
zwischen RBD und ACE2 mit RBD-spezifi- Phagen einen Nanobody auf der Oberfläche kosten und Marktpreis. Dieser liegt bei dem
schen Nanobodies zu blockieren, und SARS- – daher der Name „Phage Display“ [10, 11]. mAb-Präparat REGEN-COV mit einer Dosis
CoV-2 somit zu stoppen, bevor es Zellen infi- Die Plasmide der Bibliothek, die Phagemide, von etwa einem Gramm bei mindestens 2.000
zieren kann [9]. tragen ein Phagen-eigenes Replikationssig- Euro – viel zu hoch für den breiten Einsatz
Um solche Nanobodies zu gewinnen, nal und werden daher in den Phagenparti- während einer globalen Pandemie. Indem wir
haben wir drei Tiere unserer Alpakaherde keln verpackt. Durch Selektion der Phagen die Kandidaten-Nanobodies bei unterschiedli-
mit einer geringen Menge des Spike-Proteins über die präsentierten Nanobodies (mittels chen Konzentrationen testeten, konnten wir
immunisiert. Bereits fünf Wochen später Affinitätschromatographie) kommt man so ermitteln, welche Menge für den Neutralisati-
gewannen wir aus etwas Blut periphere auch der Nanobody-Sequenz auf die Spur. onseffekt ausreicht. Das Ergebnis war erstaun-
B-Lymphozyten – jene Zellen, die auch Spike- Mit der RBD des Spike-Proteins als Köder lich: Die potentesten Nanobodies (z. B. Kandi-
Antikörper produzieren. Aus der revers- fischten wir nun die RBD-bindenden Nano- dat Re5D06) neutralisierten das Virus bereits
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bei weniger als einem millionstel Gramm pro elongierte, konvexe Gestalt (Abb. 1C, [12]). eine bisher einzigartige Kombination aus anti-
Liter. Für einen Patienten könnte also bereits Dadurch passen sie in für IgGs nur schwer viraler Aktivität und Thermostabilität. Letzte-
ein Milligramm dieses Nanobodys ausreichen, zugängliche konkave Oberflächenbereiche re gilt sogar als Schlüsselkriterium in der
um die effektive therapeutische Dosis 100fach und können so auch komplizierte 3D-Epitope Wirkstoffentwicklung [14]: Zum einen zeigt
zu überschreiten [9]. lesen und sogar aktive Zentren von Enzymen sie, dass Nanobodies die oft langen Produk-
blockieren [13]. Das Paratop von IgGs ist hin- tions- und Lieferketten unbeschadet durchlau-
Mechanismus der antiviralen gegen meist flach oder konkav, wodurch die- fen können, zum anderen ist sie ein Indikator
Aktivität se eher lineare Peptide mit hoher Affinität für lange Wirksamkeit im Körper.
Mit Immunfluoreszenz-Experimenten binden [12]. Über Kryo-Elektronenmikrosko-
erkannten wir bereits früh, dass neutralisie- pie erschlossen wir, dass Re5D06 das Spike- Schutz vor SARS-CoV-2-Varianten
rende Nanobodies eines von zwei nicht über- Protein in all dessen Konformationen zu blo- Seit Herbst 2020 traten immer neue Virus-
lappende RBD-Epitopen (1 oder 2) besetzen, ckieren vermag – es kann sich dem Nanobody varianten auf, die das Pandemiegeschehen
wobei die besten Neutralisierer (wie z. B. praktisch nicht entziehen. Die Röntgenstruk- rasch dominierten. Die nun allgegenwärtigen
Re5D06) Epitop 1 abdecken. Re5D06 gehört tur des freien, nicht RBD-gebundenen Re5D06 Delta- und Omikron-Varianten sind ist leich-
gar zu den am stärksten bindenden Nanobo- zeigte zudem, dass dieser außerordentlich ter übertragbar und entziehen sich auch häu-
dies, die jemals beschrieben wurden. Mittels formstabil ist und seine RBD-kompatible Kon- figer dem Impfschutz, da die Mutationen vor
Röntgenstrukturanalyse ermittelten wir die formation nicht erst allmählich mit der RBD- allem Epitope neutralisierender Antikörper
3D-Struktur eines Komplexes aus RBD, Bindung einnimmt, sondern diese von Anbe- betreffen. Dies führt nicht nur zu Infektions-
Re5D06 und einem Epitop-2-Binder (Abb. 2). ginn aufweist. durchbrüchen; auch bereits entwickelte the-
Hier zeigte sich, dass beide Nanobodies die rapeutische Antikörper (wie z. B. Bamlani-
ACE2-Bindung verhindern. Das Paratop von Außergewöhnliche Stabilität vimab von Eli Lilly) verlieren einen Großteil
Re5D06 schließt einen auffällig langen CDR3- Strukturelle Stabilität von Proteinen geht ihrer Wirkung. Mit der Nanobody-Pipeline
Loop ein, wodurch der Nanobody formgenau nicht selten mit Temperaturtoleranz einher. lässt sich eine solche „therapeutische Lücke“
auf Epitop 1 der RBD passt. Solche Bindungs- Unsere Favoriten-Nanobodies überstehen zügig schließen: Mittels Phage Display selek-
muster sind eine strukturelle Besonderheit sogar eine Temperatur von 95 °C, ohne tierten wir bereits jene Nanobodies aus der
von Nanobodies: CDR3 verleiht ihnen oft eine unwirksam zu werden [9]. Sie zeigen damit Bibliothek unserer besten RBD-Binder, die
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¯ Abb. 2: Die Rezeptorbindedomäne (RBD, grün) des SARS-CoV-2
Spike-Proteins (links) wird durch Nanobodies gegen Epitop 1 (magenta)
und Epitop 2 (blau) blockiert, wodurch das Virus neutralisiert wird.
aussichtlich kon- [6] Ward ES, Güssow D, Griffiths AD et al. (1989) Binding
activities of a repertoire of single immunoglobulin variable
ventionellen domains secreted from Escherichia coli. Nature 341: 544–546
mAbs überlegen [7] Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S et al.
(1993) Naturally occurring antibodies devoid of light chains.
sein. Die intrana- Nature 363: 446–448
sale Anwendung [8] Jackson CB, Farzan M, Chen B et al. (2021) Mechanisms
of SARS-CoV-2 entry into cells. Nat Rev Mol Cell Biol 23:3–20
oder Inhalation [9] Güttler T, Aksu M, Dickmanns A. et al. (2021)
ist für anti-RBD- Neutralization of SARS-CoV-2 by highly potent, hyperthermo-
stable, and mutation-tolerant nanobodies. EMBO J 40:
Nanobodies e107985
trotz der RBD-Mutationen die Alpha-, Beta-, besonders vielversprechend, denn Nanobo- [10] Smith GP (2019) Phage display: simple evolution in a
petri dish (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl 58:
Gamma- und Delta-Varianten des Virus inak- dies können leicht in Gewebe eindringen und 14428–14437
tivieren können [9]. das Virus bereits am Infektionsort ausbrem- [11] Winter G (2019) Harnessing evolution to make medi-
cines (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl 58: 14438–
Alle RBD-Mutationen vor Omikron der bis- sen oder sogar stoppen. Erste Ergebnisse aus 14445
lang global dominanten Virusvarianten tra- dem Hamstermodell sind vielversprechend. [12] Jovčevska I, Muyldermans S (2020) The therapeutic
potential of nanobodies. BioDrugs 34: 11–26
fen Epitop 1; Epitop 2 blieb bis dahin ver- Falls diese sich bestätigen lassen, könnten [13] Desmyter A, Transue TR, Ghahroudi MA et al. (1996)
schont. Da Epitop-1- und Epitop-2-Binder klinische Studien bereits im kommenden Crystal structure of a camel single-domain VH antibody
fragment in complex with lysozyme. Nat Struct Biol 3: 803–
gleichzeitig dieselbe RBD besetzen können, Jahr beginnen. 811
konnten wir sie zu wirksamen Tandems [14] Jarasch A, Koll H, Regula JT et al. (2015) Developability
assessment during the selection of novel therapeutic anti-
fusionieren. Diese neutralisieren auch die Danksagung bodies. J Pharm Sci 104: 1885–1898
Virusvarianten Alpha bis Delta und übertra- Wir danken unseren Arbeitsgruppen am MPI Funding note: Open Access funding enabled and organized by Projekt DEAL.
fen sogar die Nanobody-Monomere in ihrer für Multidisziplinäre Naturwissenschaften Open Access: Dieser Artikel wird unter der Creative Commons Namensnennung
4.0 International Lizenz veröffentlicht, welche die Nutzung, Vervielfältigung,
antiviralen Aktivität. und an der Universitätsmedizin Göttingen Bearbeitung, Verbreitung und Wiedergabe in jeglichem Medium und Format
erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle
In einer dritten Strategie bündelten wir für die hervorragende Teamarbeit an den ordnungsgemäß nennen, einen Link zur Creative Commons Lizenz beifügen und
angeben, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die in diesem Artikel
Epitop-2-Binder zu trimeren Komplexen. So SARS-CoV-2-Projekten sowie den Facility- enthaltenen Bilder und sonstiges Drittmaterial unterliegen ebenfalls der
genannten Creative Commons Lizenz, sofern sich aus der Abbildungslegende
entsprechen sie der Dreier-Symmetrie des Teams am MPI (Tierhaltung, Kristallisation, nichts anderes ergibt. Sofern das betreffende Material nicht unter der
genannten Creative Commons Lizenz steht und die betreffende Handlung nicht
Spikes und binden auch die Alpha bis Delta cryo-EM und Live-Cell Imaging) für die aus- nach gesetzlichen Vorschriften erlaubt ist, ist für die oben aufgeführten
Weiterverwendungen des Materials die Einwilligung des jeweiligen
praktisch irreversibel. Nanobodies lassen gezeichnete Unterstützung. Diese Arbeit Rechteinhabers einzuholen. Weitere Details zur Lizenz entnehmen Sie bitte der
Lizenzinformation auf http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/deed.de.
sich also modular zu effektiven Wirkstoffen wurde von der Max-Planck-Gesellschaft und
kombinieren. Die Nanobody-Pipeline kann der Max-Planck-Stiftung gefördert. ó
man in Echtzeit dem Pandemiegeschehen Korrespondenzadressen:
anpassen. Unsere derzeitige Aufmerksam- Literatur Prof. Dr. Dirk Görlich
[1] Köhler G, Milstein C (1975) Continuous cultures of fused
keit gilt vor allem der Omikron-Variante. cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256:
Max-Planck-Institut für Multidisziplinäre
495-497 Naturwissenschaften
Therapeutische Anwendung im Blick [2] The Antibody Society, www.antibodysociety.org Am Fassberg 11
[3] Better M, Chang CP, Robinson RR et al. (1988) D-37077 Göttingen
Caplacizumab, ein Thrombozytenaggrega- Escherichia coli secretion of an active chimeric antibody frag-
goerlich@mpibpc.mpg.de
ment. Science 240: 1041–1043
tionshemmer, ist das bislang einzige zugelas- [4] Skerra A, Plückthun A (1988) Assembly of a functional
sene Nanobody-basierte Präparat [12]. Dass immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli. Science 240: Prof. Dr. Matthias Dobbelstein
weitere Nanobodies den Weg in die Klinik 1038–1041 Universitätsmedizin Göttingen
[5] Huston JS, Levinson D, Mudgett-Hunter M et al. (1988) Institut für molekulare Onkologie
finden, ist wahrscheinlich. Vor allem dort, wo Protein engineering of antibody binding sites: recovery of
Justus-von-Liebig-Weg 11
specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue
kompakte Struktur und hohe Stabilität aus- produced in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 85: D-37077 Göttingen
schlaggebend sind, werden Nanobodies vor- 5879–5883 mdobbel@uni-goettingen.de
AUTOREN
Thomas Güttler Matthias Dobbelstein Dirk Görlich
1998–2003 Studium der Biolo- 1986–1992 Medizinstudium an 1985–1989 Biochemiestu-
gie und Molekularen Zellbiologie der LMU München mit Promo- dium an der Universität Halle.
an den Universitäten Jena, tion am Institut für Biochemie. 1990–1993 Promotion am
Oxford, MS, USA, und Heidel- 1993–1996 Postdoktorand an Max-Delbrück-Zentrum/HU
berg. 2004–2010 Promotion am der Princeton University, USA. Berlin. 1993–1995 Postdokto-
Max-Planck-Institut für biophysi- 1997–2004 Gruppenleiter am rand am Wellcome/CRC Insti-
kalische Chemie und an der Uni- Institut für Virologie der Univer- tute Cambridge, UK. For-
versität Göttingen. 2010–2019 sität Marburg. 2005–2006 Pro- schungsgruppenleiter (1996–
Postdoktorand an der Harvard fessor an der Süddänischen 2001) und Professor (2001–
Medical School und Boston Uni- Universität Odense. Seit 2006 2006) am Zentrum für Moleku-
versity, USA. Seit 2019 Wissen- Professor an der Universitäts- larbiologie der Universität Hei-
schaftler am Max-Planck-Institut medizin Göttingen. delberg (ZMBH). Seit 2005
für Multidisziplinäre Naturwis- Direktor am Max-Planck-Insti-
senschaften (früher Max-Planck- tut für Multidisziplinäre Natur-
Institut für biophysikalische wissenschaften (früher Max-
Chemie) in Göttingen. Planck-Institut für biophysika-
lische Chemie) in Göttingen.
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