Tuning of strueture and funetion of Chinese Hamster Ovary (CHO) eells by systematie design of defined miero-environments

Diss. ETH No 9559

 Tuning of strueture and funetion of
Chinese Hamster Ovary (CHO) eells
  by systematie design of defined
        miero-environments

              A dissertation submitted to the
      SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY
                          ZURICH
                    for the degree of
               Doctor of Natural Sciences

                     presented by
                  FERRUCCIO MESSI
                   Dip!. sc. nato ETH
                born February 11, 1963
                  citizen of Croglio TI

           Accepted on the recommendation of
              Prof. Dr. A. Rechter, examiner
            Prof. Dr. J. Nüesch, co-examiner
                Dr. C. Leist, co-examiner

                         1991

5

1. Zusammenfassung

         Die vorliegende Arbeit beschreibt die Entwicklung von physikalisch-
chemisch definierten Mikroumgebungen für Zellkulturen, welche die Modulation
von Struktur und Stoffwechselfunktionen einer Hamster-Zellinie (Chinese Hamster
Ovary, CHO) erlauben.
Das Entwicklungskonzept besteht aus drei Teilen. Die erste Phase umfaßt die
Beseitigung von komplexen, chemisch nicht definierten Variablen wie z.B. fetales
Kälberserum, eine der kritischen Komponenten in Zellkulturmedien. Selektion und
Zubereitungstechnik eines geeigneten Basalmediums erlauben das Erreichen
dieses Zieles. Die zweite Phase umfasst die Entwicklung von vollständig
definierten zellulären Mikroumgebungen, die imstande sind, die physiologischen
Bedürfnisse der Zelle zu erfüllen. Zu diesem Zweck wird eine detaillierte Analyse
bezüglich der physikalischen (pH, osmotischer Druck, Sauerstoff-partialdruck) und
chemischen Anspruche (Energiequellen, Aminosäuren, Vitamine, Prekursoren von
Fett- und Nukleinsäuren, anorganische Salze, Spurenelemente und chemische
Verunreinigungen) der Zellen, die während der ersten Phase selektioniert wurden,
durchgeführt. Die dritte und letzte Phase umfaßt die Nachprüfung der erhaltenen
Resultate mittels Kultivierung in mechanisch gerührten Bioreaktoren. Diese
erlauben die homogene Dispersion d.er Kultur und ermöglichen eine exakte
Kontrolle der wichtigsten physikalischen Kulturparameter (Temperatur, pH, p02);
die Reproduzierbarkeit der Resultate ist damit geWährleistet.
Die Ergebnisse zeigen, daß gute Kenntnisse bezüglich der Variablen, die einen
Einfluß auf die zellulären Wachstumsprozesse haben, zahlreiche Vorteile mit sich
bringen. Zum ersten erlaubt die beschriebene Drei-Phasen-Strategie die
Erfassung essentieller physiologischer Bedürfnisse von Zellen; hierdurch ist eine
ausführliche Kontrolle sowie die Modulation der Hauptfunktionen des
Stoffwechsels möglich geworden. Zum zweiten wurden bei der Kultivierung im
Bioreaktor bezüglich Zellproliferation kinetische Werte erreicht, die mit denen
serumabhängig wachsender Zellinien vergleichbar sind: Die Entwicklung von
physikalisch-chemisch definierten Kulturmedien ermöglichte den Zellen, sich mit
einer Wachstumsrate Jl von 1.0 d-1 (1.1 d-1 mit Serumzusatz; Kurano et aL, 1990c)
bei einer maximalen Zelldichte von 1.5 x 106 ml- 1 (1.8 x 106 ml- 1 mit Serum) zu
vermehren.

6

Die vorliegende Arbeit formuliert erstmals eine physikalisch und chemisch
definierte proteinfreie Mikroumgebung für tierische Zellen in Kultur. Allein eine
definierte Mikroumgebung erlaubt den gezielten Eingriff in Metabolismus- und
Genregulation. Maximale Wachstumsraten und Syntheseraten, wie sie in
komplexen Medien üblich sind, können durch definierte Verhältnisse eingestellt
werden. Diese Perspektive wird beim Verzicht auf komplexe und teure
Mediumskomponenten bei industriellen Kulturprozessen noch bedeutsamer, da
eine Verminderung des Kontaminationsrisikos sowie eine Senkung der
Produktions- und Aufarbeitungskosten damit verbunden ist.

7

1. Riassunto

           La presente rieerea deserive 10 sviluppo di mieroambienti eellulari,
 ehimieamente e fisicamente definiti, atti a permettere la modulazione di strutture e
 funzioni metaboliehe di una linea eellulare originariamente derivata dal erieeto
 (Chinese Hamster Ovary eells, CHO).
 11 proeesso di sviluppo e suddiviso in tre parti ben distinte. La prima fase eomporta
 I'eliminazione di variabili complesse e di eomposizione seonoseiuta quali il siero di
feto di vitello, eonsiderato iI prineipale additivo e al tempo stesso iI piu grosso
problema eoneernente i terreni di eoltura per eellule animali. L'obbiettivo viene
 raggiunto attraverso la selezione di un conveniente terreno di base e la relativa
teeniea di preparazione. La seeonda fase inelude 10 sviluppo vero e propria di
mieroambienti eellulari ben definiti in grade di soddisfare i bisogni fisiologiei della
eellula. A queste seopo viene eondotta un'analisi dettagliata sulle esigenze
ehimieo-fisiehe (pH, pressione osmotiea, tenore di ossigeno) e nutritive (fonti di
energia, amino aeidi, vitamine, preeursori di aeidi grassi e nueleiei, sali inorganiei,
tracce e eontaminanti ehimiei) delle eellule selezionate durante la prima fase. La
terza e ultima parte eomprende la verifiea dei risultati ottenuti nelle preeedenti fasi
attraverso proeessi di coltivazione in appositi bioreattori. Questi ultimi, essende
prowisti di agitatore meeeanieo a eliea e di sistemi analitiei on-line per iI eontrollo
dei prineipali parametri fisiei (temperatura, pH e pressione parziale dell'ossigeno),
permettono una dispersione omogenea delle eolture, assieurando pereie le
premesse ideali per la riprodueibilitA dei risultati.
 I dati ottenuti dimostrano ehe I'esatta eonoseenza delle variabili ehe influiseono sul
proeesso di ereseita eellulare porta eon se numerosi vantaggi. Innanzitutto, la
strategia in tre fasi applieata durante queste studio ha permesso di individuare eon
aceuratezza i fabbisogni essenziali delle eellule eoltivate in vitro, ereando di
eonseguenza le eondizioni necessarie per un eontrollo e una modulazione piu
estesi delle loro funzioni metaboliehe prineipali. Oltre a eie, iI proeesso di coltura'
       e           e
ehe ne risultato earatterizzato da valori einetiei di ereseita prossimi a quelli gia
deseritti eon eellule ereseiute eon I'apporto di siero. Lo sviluppo di terreni idonei
ehimieamente e fisieamente definiti ha permesso di eoltivare le cellule tramite
teeniea bateh a una densitA massima di 1.5 x 106 ml-1 (1.8 x 106 ml-1 in presenza

8

di siero; Kurano et al., 1990c) con una velocita di crescita J.1 pari a 1.0 d- 1 (1.1 d- 1 in
presenza di siero).
11 presente studio mostra per la prima volta 10 sviluppo di un microambiente per Ja
coltura di cellule animali in vitro caratterizzato da parametri fisici e chimici ben
definiti. Solo operando in queste condizioni e possibile esercitare un influsso sulle
funzioni dei metabolismo e dell'informazione cellulare. Tassi di crescita e sintesi
massimi, come quelli ottenuti tramite I'apporto di terreni di coltura complessi,
possono essere moduJati a piacimento attraverso la definizione fisica e chimica
degli ambienti in cui proliferano le cellule. Questa interessante prospettiva assurne
ancor piu importanza se si tiene conto dei fatto ehe, in processi di produzione
industriale, la rinuncia ad additivi complessi e chimicamente indefiniti quali iI siero
per I'impiego di terreni di coltura ben definiti porta a una riduzione dei costi di
produzione e lavorazione, nonehe dei rischi di contaminazione.