Ein Lehrmeister war das Immunsystem - Genetische Information lesen und verändern - Hochschule Mittweida
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GeneAufsatzthemaKurz
lesen und verändern
Ein Lehrmeister war das Immunsystem
Genetische Information lesen und verändern
Röbbe Wünschiers
Abbildung 1: Dieses sinnliche Bild ist nicht nur ein Schmuckfoto. Der Artikel hier zeigt auf, dass Mechanismen der Immunab-
wehr maßgeblich die moderne Gentechnik beeinflusst haben. Für das Immunsystem der abgebildeten jungen Frau ist ihre Situ-
ation mehrfach von Bedeutung: Einerseits wird es von den Mikroben der Wiesenumwelt gefordert und gleichzeitig trainiert.
Fernhalten von Stress ist ihm zuträglich, ebenso das Sonnenlicht: Einige Abwehrzellen besitzen auf ihrer Oberfläche einen Toll-
like-Rezeptor, eine Struktur des angeborenen Abwehrsystems. Dieser Rezeptor wird bei einer Bakterieninfektion aktiviert und
veranlasst Abwehrzellen, eine Vorstufe von Vitamin D zu produzieren. Gleichzeitig bildet dieselbe Zelle verstärkt einen weite-
ren Rezeptortyp aus, der Vitamin D erkennt. Das Sonnenlicht wandelt die Vitamin-D-Vorstufe in das aktive Vitamin D um, wel-
ches sich nun an den Rezeptor heftet. Dadurch wird die Abwehrzelle angeregt, das antibakteriell wirkende Cathelizidin zu
bilden. Spinnt man die dargestellte Szene im Sinne sexueller Annäherung weiter, gibt es noch eine interessante Eigenschaft
des Immunsystems zu berichten: Ein zentraler Teil des Immunsystems, das HLA-System, fügt dem Körpergeruch spezielle mole-
kulare Marker hinzu. Diese Biomoleküle kann man nicht riechen, aber unser Unterbewusstsein reagiert darauf. Bemerkens-
wert: Je unterschiedlicher HLA von Mann und Frau sind, umso stabiler sind die Abwehrkräfte des späteren Kindes. Bei der
Partnerwahl sucht man also unbewusst auch nach einem möglichst andersartigen Immunsystem (Foto: Kickuth).
Die Abwehr höherer Lebewesen gegen Mikroorganismen,
schädliche Stoffe oder auch fehlerhafte eigene Zellen, das
Der Autor: Immunsystem, ist sehr komplex. Es umfasst auch eine
Prof. Dr. Röbbe Wünschiers studierte Biologie und promovierte in adaptive Immunabwehr. So kann sie sich nicht nur gegen
Pflanzenphysiologie an der Universität Marburg. 2006 habilitierte bekannte Schadstukturen wehren, die über die
er sich an der Universität zu Köln in Genetik. Ab 2007 arbeitete er angeborene Immunabwehr erkannt werden, sondern sich
bei BASF Plant Science. Seit September 2009 ist er Professor für auch an neue oder veränderte Krankheitserreger
Biochemie/Molekularbiologie an der Hochschule Mittweida. Seine anpassen (Abbildung 1). Dies erfordert jedoch einen
Lehrgebiete sind Biochemie, Genetik/Molekularbiologie sowie Speicher, der in der Lage ist, Informationen über
Computational Biology. In seiner Forschung nutzt er labor- und molekulare Strukturen zu erhalten. Solch ein
computerbasierte DNA- und RNA-Analytik für die Analyse und ggf. Speichersystem gab den Anstoß, eine der aufregendsten
Optimierung unterschiedlicher biologischer Systeme. Diese Möglichkeiten moderner Gentechnologie aufzudecken
reichen von Purpurbakterien über Pflanzenpollen und Schafpudel und zu nutzen, die als „Genschere“ umschrieben wird.
bis hin zu Metasystemen wie Biofilme und Bioaerosole. Dazu mussten die Forscher zunächst wissen, wie sich
Dieser Artikel erschien in ähnlicher Form in dem Buch Gene zusammensetzen – diese also lesen, und dann
„Generation Gen-Schere“. Dazu gibt es in dieser CLB eine lernen, wie man sie verändert. Beide Entwicklungen
Rezension in der Rubrik „Literatur“. werden hier beschrieben..
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GeneAufsatzthemaKurz
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1. DNA-Sequenzierung
ab 1975 entwickelt
Im Jahr 1975 publizierte der britische Biochemiker
Frederick Sanger (Abbildung 3) eine enzymatische
Methode und im Jahr 1977 die US-amerikanischen
Wissenschaftler Allan Maxam und Walter Gilbert
eine chemische Methode zur Analyse der Abfolge der
Nukleotide in der DNA, die DNA-Sequenzierung [1,
2]. Bemerkenswerterweise hatte Sanger bereits An-
fang der 1950er Jahre eine Methode zu Analyse der
Aminosäuresequenz in Proteinen entwickelt und ist
einer von bislang vier Wissenschaftlern, die mit zwei
Nobelpreisen ausgezeichnet wurden.
1.1 Die enzymatische Sanger-Sequenzierung Abbildung 2: Vergleich der Leistungsfähigkeit unterschiedli-
Die Sanger-Sequenzierung, auch als Strangab- cher Sequenziertechnologien der ersten, zweiten (engl. next
bruch-Methode bekannt, arbeitet auf Basis des En- generation sequencing) und dritten Generation. M=Mega,
zyms DNA-Polymerase. Diese ist natürlicherweise in G=Giga, T=Tera (Abb.: Wünschiers).
jeder Zelle für die Verdopplung des Erbgutes vor der
Zellteilung verantwortlich. Enzyme sind in der Regel
schwieriger zu handhaben als Chemikalien, da sie Um schneller zu sein, zerschneiden wir das Buch in
erst aus Organismen isoliert werden müssen und viele Schnipsel von je 800 Zeichen und können diese
meist auch nicht lange haltbar sind. Aber wegen der parallel in drei Stunden lesen. Aber woher weiß man
besseren Automatisierbarkeit setzte sich die Sanger- am Ende, welche Zeichenfolgen aufeinanderfolgen?
Sequenzierung durch und blieb bis in die 1990er Jah- Gar nicht! Daher braucht man mindestens zwei Bü-
re die dominante Sequenziermethode. cher, die jeweils an unterschiedlichen Stellen zer-
Sie hat aber auch den Nachteil, dass die Sequenzie- schnippselt werden, beispielsweise ein Buch ab
rung in zwei getrennten Schritten abläuft. In einem Zeichen 1 alle 800 Zeichen und ein anderes Buch ab
ersten Schritt werden – in Abhängigkeit von der zu Zeichen 200 alle 800 Zeichen. So erhält man überlap-
analysierenden DNA-Sequenz – unterschiedlich lan- pende Schnipsel, und die Zeichen-
ge DNA-Fragmente erzeugt. Dieser Schritt dauert folge des ursprünglichen Buches Abbildung 3: Frederick Sanger (1918-
etwa zwei Stunden. In einem zweiten Schritt werden lässt sich rekonstruieren. Auf die- 2013) war ein britischer Biochemiker.
diese Fragmente entweder in einem Agarosegel oder se Weise funktioniert Genomse- Er gehörte zu den wenigen Personen,
in einer Kapillare ihrer Größe nach aufgetrennt, was quenzierung (Abbildung 4). Die die zweimal mit dem Nobelpreis geehrt
wurden: 1958 erhielt Sanger den No-
mehrere Stunden dauert. Aus dem Muster der Frag- vielen Sequenzfragmente à 800 belpreis für Chemie (als alleiniger Preis-
mentgrößen kann schließlich die Abfolge der Nukleo- Nukleotide (reads) müssen zum träger) für die Aufklärung der Struktur
tide der zu sequenzierenden DNA ermittelt werden. Gesamtgenom zusammengefügt des Insulins und seine Arbeiten zur Pro-
teinsequenzierung. 1980 wurde er er-
Weiterentwicklungen der Sanger-Sequenzierung werden. Diese Assemblierung ist neut mit dem Nobelpreis für Chemie
betrafen vor allem die Parallelisierung der Analyse. ein wichtiger Schritt und funktio- ausgezeichnet (zusammen mit Paul
Während man in der Anfangsphase rund 10 000 Nu- niert umso besser, je länger die Berg, geb. 1926, und Walter Gilbert,
kleotide pro Tag und Gerät analysieren konnte, war analysierte Sequenz ist und umso geb.1932), dieses Mal für Untersuchun-
gen zur Ermittlung der Basensequenz in
es mit modernen Kapillarsequenziergeräten der mehr Genomkopien sequenziert Nukleinsäuren (Foto: US National Insti-
2000er Jahre etwa eine Million Nukleotide. Die San- werden. Wenn also davon die tutes of Health).
ger-Sequenzierung ist eine Sequenziermethode der Rede ist, dass ein Genom sequen-
ersten Generation. Sie hat sich auch deshalb so lange ziert wurde, wurden in Wirklich-
auf dem Markt behauptet, weil sie bis vor Kurzem keit meistens Tausende Kopien
mit ca. 800 Nukleotiden die größte Leselänge ermög- analysiert (Abbildung 4).
lichte – die Nanoporensequenzierung stellt in diesem
Zusammenhang eine Revolution dar (s. u.; Abbildung 1.2 Pyrosequenzierung
2). Im Jahr 1996 entwickelte der
800 Nukleotide ist jedoch eine kleine Anzahl, ge- schwedische Biochemiker Pål Ny-
messen an der zu lösenden Aufgabe: Das menschli- rén von der Königlichen Techni-
che Genom beinhaltet 3,2 Milliarden Nukleotide. Ein schen Hochschule in Stockholm
Vergleich des Erbgutes mit einem Buch zeigt auf, wie gemeinsam mit seinem Doktoran-
man diese Aufgabe angehen kann. Mit der Sanger-Se- den Mostafa Ronaghi die Pyrose-
quenzierung können die ersten 800 Zeichen in rund quenzierung [3]. Sie hat nichts mit
drei Stunden gelesen werden. In weiteren drei Stun- einem Feuerwerk zu tun, sondern
den die nächsten 800 Zeichen und so weiter. viel mehr damit, dass das Molekül
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Gene lesen und verändern
weniger als 1,5 Millionen US-Dol-
lar ein komplettes menschliches
Genom entziffert werden kann.
Als die Ergebnisse des Projekts
Jim der Öffentlichkeit präsentiert
wurden, stellte Watson nur eine
Bedingung: Er wollte auf keinen
Fall, dass Informationen über sei-
ne Allele des apoE-Gens bekannt-
gegeben werden (es codiert das
Apolipoprotein E, das im Fett-
stoffwechsel eine wichtige Rolle
spielt). Denn die Variante 4 die-
ses Gens steht mit einem frühen
Einsetzen von Alzheimer in Ver-
bindung – Watson war zu Zeit sei-
ner Sequenzierung 79 Jahre alt.
1.3 Menschliches Genom
sequenziert
Man kann sagen, dass das Pro-
jekt Jim das erste große Sequen-
zierprojekt einer neuen Gene-
ration von
Abbildung 4: Schematischer Ablauf einer Genomsequenzierung. Links: Mit nur einem DNA-Molekül als Hochdurchsatz-Sequenziergeräten
Vorlage wäre keine Sortierung der Fragmente möglich. Rechts: Bei mehreren Kopien der zu analysieren- war – und das zweite vollständig
den DNA entstehen sich überlappende Fragmente. Daher kann die DNA-Sequenz korrekt assembliert sequenzierte menschliche Erbgut.
werden (Abb.: Wünschiers). Denn ebenfalls 2007 präsentierte
der US-amerikanische Biochemi-
Pyrophosphat (auch Diphosphat genannt) detektiert ker Craig Venter seine Genomsequenz [6]. Diese Se-
wird. Das Pyrophosphat wird freigesetzt, wenn die quenzierung erfolgte mit der Sanger-Methode auf
DNA-Polymerase – wie bei der Sanger-Sequenzie- Hochdurchsatzautomaten namens ABI 3730xl der
rung, auch hier die Grundlage der Sequenzanalyse – Firma Applied Biosystems. Das Projekt dauerte rund
aktiv ist. Über mehrere enzymatische Schritte wird sieben Jahre und kostete etwa 100 Millionen US-Dol-
daraufhin ein Lichtsignal erzeugt. lar. Auf Basis seiner genetischen Daten hat Venter
Das revolutionäre an dieser Technologie der zwei- ebenfalls 2007 seine Autobiografie publiziert – die
ten Generation war die Zusammenlegung des mole- erste, die Lebensereignisse mit Genvarianten in Be-
kularen „Lesens“ und der Ergebnisausgabe [4]. So ziehung stellt [7].
erhält man mit der Pyrosequenzierung fast in Echtzeit Beide Projekte machten sich zunutze, dass im Jahre
das Ergebnis. Zusätzlich konnte das technische Analy- 2000 ein erster Entwurf einer unvollständigen Se-
sesystem erheblich kleiner werden, sodass sehr viel quenz des menschlichen Erbgutes veröffentlicht wur-
mehr Reaktionen pro Gerät parallel analysiert werden de. Diese Daten halfen beiden Teams beim
können. Aber: Die Länge der Sequenzen (reads) ist Zusammenfügen der reads. Heutzutage sind Tausen-
auf rund 100 Nukleotide reduziert. Es hängt von der de individuelle menschliche Genome entziffert, sogar
wissenschaftlichen Fragestellung ab, ob diese Länge das des Neandertalers, und die Kosten pro Genom lie-
ausreicht. gen unter 1000 Dollar. Erst Ende 2019 habe ich ein
kombiniertes Black-Friday-Cyber-Monday-Angebot
1.2.1 Firma 454 und das Projekt Jim von der US-amerikanischen Firma Dante Labs erhal-
Nachhaltige Geschichte in Kombination mit der Py- ten. Sie boten eine komplette Erbgutsequenzierung
rosequenziertechnologie schrieb die schwedische für 169 Euro an (Abbildung 5).
Firma 454 im Jahr 2007. Mit ihrem Genome-Se- In den 2000er Jahren wurden zahlreiche neue Se-
quencer-FLX-Sequenzierapparat entschlüsselten sie quenziermethoden entwickelt und zur Marktreife ge-
das komplette Erbgut des Mitentdeckers der DNA- bracht. Die Sequenzierautomaten wurden
Struktur und Nobelpreisträgers James Watson [5]. kompakter, billiger und können mehr Nukleotide pro
Obwohl das Projekt durchaus auch als Werbeaktion Zeit und Gerät analysieren. Dazu trugen vor allem
für ihre Technologie gedacht war, zeigte 454 (damals Fortschritte in der Mikrofluidik bei. Moderne Se-
bereits zu Hoffmann-La Roche gehörend), dass inner- quenzierautomaten haben etwa die Größe eines La-
halb von vier Monaten, mit einer Handvoll Wissen- serdruckers, kosten rund 40 000 Euro und können
schaftlerinnen und Wissenschaftlern und etwas 100 Milliarden Nukleotide am Tag analysieren.
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1.4 Sequenzierung mit Nanoporen
Ein neues Zeitalter der Genomanalyse läutete 2013
die englische Firma Oxford Nanopore ein, als sie
während einer Konferenz in Marco Island, Florida ei-
nen Sequenzierautomaten präsentierte, der auf der
Handfläche Platz hat und an den USB-Anschluss eines
handelsüblichen Computers angeschlossen werden
kann: der MinION. Dieser Sequenzierautomat der
dritten Generation, der seit 2014 auf dem Markt ist,
basiert auf Poren in einer Membran, durch welche
das DNA-Molekül hindurchgezogen wird [8]. Dies ist
mit einer Änderung des Stromflusses durch die Pore
verbunden, was wiederum gemessen wird (Abbildung
6).
Die Nanoporen-Sequenzierung beruht auf Ände-
rungen des Ionenstromes durch Nanoporen, die in
eine künstlich erzeugte Membran eingelagert sind.
Als Nanopore werden sowohl biologische (kleine
Transmembranproteine ähnlich eines Ionenkanals, z.
B. α-Hämolysin als auch synthetische Poren (aus Sili-
ciumnitrid oder Graphen) sowie halbsynthetische Po-
ren verwendet. Die Nanopore ist eingelassen in eine
künstliche Membran, die einen besonders hohen
elektrischen Widerstand aufweist. Die Pore ist im Ge-
gensatz zu gewöhnlichen Ionenkanälen permanent
geöffnet und erlaubt somit, nach Anlegung eines Po-
tentials, einen konstanten Ionenfluss durch die Mem- Abbildung 5: Aktuelle Angebote Ende 2019/Anfang 2020 ermöglichen eine Ge-
bran. DNA-Moleküle, die die Pore passieren, führen nomsequenzierung bereits im niedrigen dreistelligen Dollar/Euro-Bereich (Abbil-
zu einer Verringerung des Stromes. Diese Stromab- dung: Bildschirmfotos von Nebula Genomics (oben) sowie Dante Labs).
nahme hat eine für jedes Nukleotid spezifische Am-
plitude, welche gemessen und dem entsprechenden und Anwendungen teils sehr kontrovers diskutiert
Nukleotid zugeordnet werden kann. wird. Neben dem gesundheitlichen Volkswohl wird
Das Revolutionäre ist zum einen die Kompaktheit die Steuerung der Reproduktion auch mit der finanzi-
des Gerätes (Abbildung 7) und zum anderen, dass Se- ellen Entlastung des Gemeinwesens begründet.
quenzen von mehreren Tausend Nukleotiden am Ohne dies an dieser Stelle zu werten, muss klar sein,
Stück gelesen werden. dass dies, wenn es zu einem Schwangerschaftsab-
Die mobile Sequenzierung mit Nanoporen wird bruch oder, in vitro, der Entsorgung eines Embryos
nicht nur die Gendiagnostik revolutionieren führt, schützenswertes Leben „geopfert“ wird.
[9].Schon jetzt können mit der Methodik RNA und in Ethisch entlastend kann in einigen Fällen angeführt
Zukunft sicher auch Proteine analysiert werden [10]. werden, dass die Eingriffe dem Schutz der Gesund-
Mittels der Nanoporentechnologie könnten dann ein- heit der Schwangeren dienen.
zelne Proteine oder Proteinveränderungen (post- Heute stehen wir vor der Situation, dass wir Gene
translationale Modifikationen) identifiziert und DNA- „editieren“, also „korrigieren“ können. Das ist an sich
Protein-Wechselwirkungen analysiert werden. Da-
durch, dass mit dem MinION ein Handgerät zur Ver- Abbildung 6: Bei der Nanoporense- Abbildung 7: Hocherfreut erhält er Au-
fügung steht, müssen zu analysierende Proben nicht quenzierung wird das DNA-Molekül tor im Juli 2016 eine der ersten MinI-
durch eine Pore geleitet, an die ein ON-Auslieferungen in Deutschland. Der
mehr zu einem Dienstleister gesendet, sondern kön- elektrisches Potenzial angelegt ist. Aus mobile Sequenzierautomat wird über
nen in Echtzeit vor Ort (am Krankenbett, im Gelände den dabei entstehenden Stromschwan- einen USB-Anschluss mit einem Com-
etc.) analysiert werden. Es ist sehr gut vorstellbar, kungen lässt sich die Sequenz ableiten puter verbunden (Foto: R. Leidenfrost).
dass in naher Zukunft kleine Sequenzierautomaten in (Abb.: Wünschiers).
Lernbaukästen für Kinder im Spielzeuggeschäft ver-
kauft werden.
2. DNA gezielt verändern
Es gibt heute bereits Fälle, in denen die Gendia-
gnostik zur Reduzierung von Erbkrankheiten in
Bevölkerungsgruppen führte. Maßgeblich dafür ist
die Pränataldiagnostik, die in ihren Möglichkeiten
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Gene lesen und verändern
sische Mikrobiologin Emmanuelle Charpentier (geb.
1968), heute Direktorin am Max-Planck-Institut für
Infektionsforschung in Berlin, eine bahnbrechende
Arbeit (Abbildung 8); man kann von einem „game
changer“ sprechen: eine Methode zur gezielten Ver-
änderung einer spezifischen DNA-Sequenz im Erbgut
[14]. Einige Monate später, im Februar 2013, publi-
zierte der US-amerikanische Biochemiker Feng
Zhang, wie das System auf menschliche und Mäuse-
zellen angewendet werden kann [15]. Die Methode
basiert auf dem CRISPR/Cas-System, der Genschere,
und kann so präzise wie ein Skalpell am OP-Tisch im
Genom Nukleotid-genaue Veränderungen herbeifüh-
ren. Daher wird das Verfahren auch als Genchirurgie
oder, in Anlehnung an den genetischen Code, als Ge-
neditierung bezeichnet.
Abbildung 8: Emmanuelle Charpentier (links) und Jennifer Doudna nach der An- Heute ist klar: Die Genschere funktioniert bei je-
kündigung in Tokio, den Japan-Preis 2017 erhalten zu haben (Foto: Japan Prize dem lebenden Organismus. Das Verfahren ist so ein-
Foundation). fach, dass es in den USA sogar als
Experimentalbaukasten für aktuell 159 US-Dollar an
nichts Neues. Züchtung stellt verschiedene Metho- jedermann verkauft wird und in Schulen angewendet
den für den Eingriff in das Erbgut von Lebewesen be- werden kann.
reit. Allerdings sind ungerichtete Methoden, die Und zu guter Letzt: Die Genschere hat einen Streit
nach dem Zufallsprinzip entweder über ionisierende zwischen Vertreterinnen und Vertretern aus der Wis-
Strahlung oder über Chemikalien genetische Verän- senschaft und Wirtschaft sowie den Regulierungsbe-
derungen hervorrufen, von spezifischen beziehungs- hörden darüber entfacht, ob die mit der Genschere
weise ortsgerichteten zu unterscheiden. Letztere behandelten Lebewesen als gentechnisch veränderte
Verfahren gewinnen zunehmend an Interesse und Organismen zu bewerten und so zu regulieren sind
sind heute in der Wissenschaft als Geneditierung oder nicht. Der Europäische Gerichtshof (EuGH) hat
(engl. genome editing) oder Genchirurgie in aller in seinem Urteil vom 25. Juli 2018 entschieden, dass
Munde. mithilfe der Geneditierung entwickelte Organismen
Infolge der zunehmenden Aufklärung des Zusam- wie alle anderen gentechnisch veränderten Organis-
menhangs zwischen dem Erscheinungsbild (Phäno- men zu regulieren sind.
typ) eines Organismus und seines Erbgutes (Genotyp)
ist man nicht mehr auf den Zufall angewiesen. Ganz 2.1.1 Nach Produkt
im Gegenteil: Man möchte gezielt in das Genom ein- oder Verfahren klassifizieren
greifen. Ein wichtiger Meilenstein in der modernen Ein wichtiger Grund, warum dieses Urteil nun hef-
Molekularbiologie war 1978 die erstmalige Beschrei- tig diskutiert wird: Das deutsche Gesetz zur Regelung
bung der ortsspezifischen Mutagenese (engl. site-di- der Gentechnik, kurz Gentechnikgesetz, ist von
rected mutagenesis) mithilfe von kurzen spezifischen 1990. Das Hauptproblem der aktuellen Fassung des
DNA-Sequenzen (die primer-extension-method). Für Gesetzes liegt in den Worten „wie sie unter natürli-
die Etablierung dieser Technik wurde der englische chen Bedingungen durch Kreuzen oder natürliche Re-
Biochemiker Michael Smith 1993 mit dem Nobel- kombination nicht vorkommt“.
preis ausgezeichnet. Verschiedene nachfolgende Ver- Einzelne Nukleotidaustausche, Punktmutationen,
fahren wurden immer ausgefeilter und genauer. Aber kommen durchaus natürlicherweise vor und können
der letzte große Durchbruch gelang mit der Anwen- ungerichtet durch ionisierende Strahlung oder Che-
dung der CRISPR/Cas-Genschere, wie sie 2012 erst- mikalien hervorgerufen werden. Daher ist die Muta-
mals beschrieben wurde. Sie befeuert zurzeit eine genese ausgenommen. Die Geneditierung mittels der
weltweite bioethische Diskussion [11–13]. Wir kön- CRISPR/ Cas-Genschere ist ein Mutageneseverfah-
nen durch einen genetischen Eingriff also die Argu- ren, das allerdings der Gentechnik zugeordnet wird.
mentation der gesundheitlichen Unversehrtheit auf Entscheidend dafür ist der Verfahrensweg.
den Embryo ausweiten und ihn, bei der Diagnose ei- Wenn Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler
ner genetischen Erkrankung, durch einen Eingriff in zwei Organismen zur Untersuchung vorgelegt be-
sein Erbgut gentherapeutisch heilen. kommen, um zu entscheiden, welche per klassischer
Mutagenese und welche per Geneditierung entstan-
2.1 Genschere CRISPR/Cas den ist, so werden sie scheitern. Das ist in vielen
Im August 2012 publizierten die US-amerikanische nicht-europäischen Ländern – und war vor dem
Biochemikerin Jennifer Doudna (geb. 1964) von der EuGH-Urteil am 25. Juli 2018 auch in einigen europä-
Kalifornischen Universität in Berkeley und die franzö- ischen Ländern – die Grundlage gewesen, „geCRIS-
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Abbildung 9: Links: Ein Bakterium wird von einem ihm unbekannten Phagen befallen. Er injiziert seine DNA in die Zelle. Die Phagen-DNA wird un-
spezifisch durch Nukleasen zerschnitten. Dadurch entstandene DNA-Fragmente können in den CRISPR-Lokus in das Bakteriengenom eingebaut wer-
den. Mitte: Der CRISPR-Lokus wird wie ein Gen abgelesen. Das Transkript wird aufgetrennt und die entstandene CRISPR-RNA (crRNA) von Cas-
Proteinen gebunden. Rechts: Wird das Bakterium von einem ihm bekannten Phagen infiziert, können die Cas-Nukleasen (Genscheren) die Phagen-
DNA zerschneiden. Die Spezifität wird durch die gebundenen crRNA-Moleküle erreicht (Abb.: Wünschiers).
PERte“ Organismen nicht zu regulieren. In den USA zu bedeuten, dass solche DNA-Sequenzen in einem
und Kanada basiert das gesamte Zulassungswesen auf Genom vorkommen?
diesem Äquivalenzprinzip, beziehungsweise einem Entdeckt wurden sie in Bakterien schon 1987, als
produktorientierten Zulassungsverfahren: Wenn der japanische Molekularbiologe Ishino Yoshizumi
sich ein Produkt nicht von einem bereits zugelasse- von der Universität Osaka in einer Veröffentlichung
nen oder natürlichen Produkt unterscheidet, wird es schrieb: „an unusual [DNA] structure was found“
zugelassen beziehungsweise nicht reguliert. In allen [16]. Es war eine nebensächliche Bemerkung. Der
anderen Ländern, in denen es gesetzlich festgelegte spanische Mikrobiologe Francisco Mojica beschrieb
Zulassungsverfahren für neue Züchtungen von Pflan- 1993 diese ungewöhnliche DNA-Sequenz genauer
zen oder Tieren gibt, gilt ein verfahrensorientiertes und fand rund zehn Jahre später heraus, dass die sich
Zulassungsverfahren. wiederholenden palindromischen Sequenzen nur die
Separatoren für DNA-Sequenzen waren, die große
2.1.2 Menschen „geCRISPERt“ Ähnlichkeit mit dem Erbgut von bekannten Bakteri-
Natürlich ist diese Diskussion wichtig, wurde aber enviren haben [17–19]. Im Jahr 2002 hat der nieder-
am 27. November 2018 von der Realität eingeholt. ländische Mikrobiologe Ruud Jansen gemeinsam mit
An diesem Tag hat der chinesische Biophysiker Jian- Mojica den Namen CRISPR vorgeschlagen [20].
kui He verkündet, dass er menschliche Embryonen Während repetitive Sequenzen für die meisten
mit der Genschere behandelt, also genetisch verän- Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler nicht von
dert hat, und dass diese zum Zeitpunkt der Ankündi- Interesse waren, nahm die Forschung nun Fahrt auf.
gung bereits geboren waren. Obwohl viele Der US-amerikanische Bioinformatiker Eugene Koo-
Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler es geahnt, nin publizierte 2006 eine umfassende Studie zu
befürchtet, gehofft, vorhergesagt hatten, schlug die CRISPR und zeigte erstmals, wie weit verbreitet sie
Ankündigung ein wie eine Bombe. bei Bakterien sind [21]. Er entwickelte die Hypothe-
se, dass es sich um ein bakterielles Immunsystem ge-
2.2 Ein Speicher des Immunsystems gen bakterielle Viren (Phagen) handeln könnte
Aber der Reihe nach. CRISPR steht für clustered re- (Abbildung 9) [22].
gularly interspaced short palindromic repeats. Es sind So wie unser Immunsystem sich „merkt“, mit wel-
zusammenhängende (clustered) palindromische Se- chen Stoffen (Antigenen) es bereits in Kontakt ge-
quenzen, die sich wiederholen (repeats) und in glei- kommen ist, so werden in der CRISPR-Region
chen Abständen (regulary) voneinander getrennt Sequenzen von Phagen hinterlegt, mit der das Bakte-
(interspaced) sind. Ein simples Palindrom ist der rium, oder ein Vorgänger, bereits Kontakt hatte. Wis-
Name Otto: Er kann von vorne und hinten gelesen senschaftlerinnen und Wissenschaftler aus der
werden. In der Genetik kennzeichnet eine palindro- Lebensmittelindustrie konnten diese Hypothese mit
mische Sequenz, dass sie auf dem Gegenstrang der Joghurtbakterien im Jahr 2007 erstmals erfolgreich
DNA in umgekehrter Richtung die gleiche Zeichenab- bestätigen [23]. In der Folgezeit berichteten mehrere
folge hat. Zum Beispiel liest sich die Sequenz AA- Wissenschaftsteams, das CRISPR-assoziierte Gene
CGTT auf dem Gegenstrang genauso. Was hat es nun (abgekürzt Cas) für Proteine codieren, welche DNA-
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Gene lesen und verändern
Abbildung 10: Die CRISPR/Cas-Genschere basiert auf einem synthetischen Leit-RNA-Molekül (sgRNA, single guide RNA), das
aus einer variablen crRNA (CRISPR-RNA) und einer tracr-RNA (trans activating crRNA) besteht, die über ein Brückenstück (lin-
kerRNA) miteinander verbunden sind. Die crRNA arbeitet wie eine Sonde und leitet die Genschere an die Zielsequenz auf der
doppels- trängigen DNA (dsDNA). Nachdem die DNA geschnitten wurde, wird sie durch verschiedene Reparaturmechanismen
(HDR: homo- logy directed repair; NHEJ: non-homologous end joining) wieder zusammengesetzt. Diese Reparatur kann durch
zugesetzte DNA-Moleküle (Reparaturvorlagen) beeinflusst werden. NHEJ führt zu einer ungenauen Veränderung der Gense-
quenz (eine Insertion oder Deletion) und damit in der Regel zum Abschalten des Gens. Über den HDR-Mechanismus können
Basenpaare gezielt ausgetauscht (Substitution) oder ganze Gene eingefügt (Insertion) werden. Im Gegensatz zur DNA ist bei
der RNA ein T (Thymin) durch ein U (Uracil) ersetzt. Wie das T paart auch das U mit A (Adenin; Abb.: Wünschiers).
Sequenzen zerschneiden können. Diese Cas-Nuklea- Tatsächlich hat man das CRISPR-System auch
sen sind die eigentlichen molekularen Genscheren. schon dahingehend abgewandelt, dass bestimmte Er-
Es ist primär der Forschungskooperation zwischen eignisse wie die Detektion einer Chemikalie im Erb-
den Gruppen um Doudna und Charpentier zu verdan- gut abgespeichert werden [25]: Mit jeder Zellteilung
ken, dass der vollständige Mechanismus aufgeklärt wird die Information an die Nachkommen weiterge-
und soweit optimiert wurde, dass er sich auf alle Le- geben. Außerdem wird aus allen Phagen-DNA-Frag-
bewesen anpassen lässt. Heute wissen wir, dass es menten im CRISPR-Lokus je ein CRISPR-RNA-
drei unterschiedlich CRISPR-Immunsysteme bei Bak- Molekül (crRNA) gebildet. Dieses verbindet sich zu-
terien gibt und von denen wiederum viele Abwand- nächst mit einer tracrRNA zu einem cr/ tracrRNA-Hy-
lungen [24]. Das zur biotechnologischen Reife brid, das als guideRNA bezeichnet wird. Diese bildet
weiterentwickelte System basiert auf dem Typ II, auf dann einen gemeinsamen Komplex mit einer Cas-Nu-
den ich mich hier daher beschränken möchte. klease (Abbildung 10).
Hiernach wird ein kurzes, in der Regel zwanzig Ba- Während die tracrRNA und die Cas-Nuklease im-
senpaare langes Fragment der doppelsträngigen DNA mer identisch und somit universell sind, ist die crR-
des Phagen (spacer genannt) in einen speziellen Be- NA, abgeleitet vom Phagengenom, spezifisch. Der
reich auf dem Chromosom des befallenen Bakteriums energetische Preis, den ein Bakterien für die spezifi-
eingebaut. Dieser Bereich wird CRISPR-Lokus ge- sche Phagenabwehr zu zahlen hat, ist die ständige
nannt. Das Phagen-DNA-Fragment wird von bereits Biosynthese der drei Komponenten des Abwehrsys-
vorhandenen Fragmenten durch die CRISPR-Sequenz tems. Wird eine Bakterienzelle von einem Phagen be-
(repeat) abgegrenzt (Abbildung 9). Die Information fallen, von dem bereits ein DNA-Fragment im
über den Phagenbefall ist so gespeichert. CRISPR-Lokus hinterlegt ist, dann kann die entspre-
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Gene lesen und verändern
chend mit einem cr/tracrRNA-Hybrid beladene Cas- das entstehende Protein nicht mehr korrekt arbeiten.
Nuklease spezifisch an die Phagen-DNA binden und Man sagt, das Gen wurde ausgeschaltet (engl. gene
an der Bindestelle durchtrennen (Abbildung 10). silencing oder knockout). Dies sind die grundlegen-
den Möglichkeiten, die Genschere einzusetzen.
2.2.1 Universelle Einsetzbarkeit
Für die biotechnologische Anwendung war es eine 2.2.3 Vielfältige Abwandlungen
wichtige Entdeckung, dass die crRNA und die tracrR- Es gibt aber noch vielfältige Abwandlungen. So wie
NA über eine kurze linkerRNA, also ein verbindendes es für die Scheren unseres Alltags verschiedene Aus-
RNA-Molekül, miteinander verbunden werden kön- führungsformen (zum Beispiel Bügel-, Endgelenk-
nen. Dieses synthetische Konstrukt wird als sgRNA und Gelenkscheren) für unterschiedliches Schnittgut
(single guide RNA) bezeichnet. Diese lässt sich billig (wie Papier, Fingernägeln, Stoffen oder Knochen)
chemisch herstellen und wird in der Regel bei Dienst- gibt, so gibt es auch verschiedene Nukleasen für un-
leisterfirmen bestellt. Man muss lediglich die Se- terschiedliche DNA- und RNA-Ziele. Erst vor Kurzem
quenz des spezifischen Bereichs angeben. Diese ist wurde sogar gezeigt, dass sich mit einer abgewandel-
abhängig von der Gensequenz, die geschnitten wer- ten Genschere auch Tausende Positionen auf einmal
den soll. editieren lassen.
Zerschnittene DNA? Das klingt erst einmal nicht
gut. Tatsächlich werden in einer Zelle sofort Repara- 2.3 Rückblick: Schon der
turmechanismen aktiv, wenn das Erbmolekül durch- zweite bakterielle Abwehrmechanismus
trennt wird. Diese Reparaturmechanismen sind Mit der Genschere ist aus einem bakteriellen Im-
universell in jedem bekannten Lebewesen in jeder munsystem das zurzeit wirkungsvollste gentechni-
Zelle vorhanden, denn DNA-Strangbrüche sind nichts sche Werkzeug geworden [11]. Die CRISPR/Cas-
Ungewöhnliches. Sie können beispielsweise durch Genschere ist wirkungsvoller, billiger und einfacher
UV-Licht oder ionisierende Strahlen verursacht wer- anzupassen als die seit 1996 verfügbaren ZFN (zink-
den. Dadurch, dass jede Zelle zerschnitte DNA wie- finger nucleases) und die seit 2010 angewandten
der zusammenfügen kann, ist auch die CRISPR/Cas- TALEN (transcription activator-like effector nucleases
Genschere universell einsetzbar. Zwei grundsätzlich (siehe dazu den Artikel „Gentechnik wird präziser –
verschiedene Reparaturmechanismen sind zu unter- Zinkfinger und TAL-Effektoren finden spezifisch ihre
scheiden, die homologe Rekombination (HDR, homo- DNS-Sequenz“ von Dr. Mechthild Kässer in CLB 7/8-
logy directed repair) und die nicht-homologe 2013, Seiten 312-316)). Es ist schon bemerkenswert,
Reparatur (NHEJ, non-homologous end joining; Abbil- dass nach der Revolution der Lebenswissenschaften
dung 10). durch Restriktionsenzyme in den 1970er Jahren in
den 2010er Jahren wiederum ein bakterieller Ab-
2.2.2 Homologe und wehrmechanismus gegen Phagen Furore macht.
nicht homologe Reparatur
Bei der homologen Rekombination dient ein zwei- 2.3.1 Erforschung von Antibiotikaresistenzen
tes Chromosom als Vorlage, im Regelfall also das un- Die Ursprünge des gentechnischen Arbeitens ge-
versehrte Tochterchromosom. Bei den meisten hen nämlich auf den Anfang der 1970er Jahre zurück.
Tieren, Pflanzen und beim Menschen liegen die Der US-amerikanische Wissenschaftler Stanley Co-
Chromosomen ja doppelt (diploid) vor. Durch die In- hen (geb. 1935) aus Stanford erforschte die Mecha-
jektion einer hohen Konzentration von DNA-Frag- nismen, die bei Bakterien zu Antibiotikaresistenzen
menten steigt die Wahrscheinlichkeit, dass diese führen. Dabei fand er heraus, dass die Bakterien ge-
anstelle des Schwester-Allels als Vorlage für die Repa- netische Informationen zur Resistenz neben der Erb-
ratur verwendet werden. Wichtig ist nur, dass die information auf den Chromosomen bereithalten, also
Randbereiche der zugegebenen DNA-Fragmente mit extrachromosomal. Diese zusätzliche Erbinformation
den Rändern der Schnittstelle übereinstimmen (ho- liegt auf DNA-Molekülen, die bereits seit den 1950er
molog sind). Sie müssen Basenpaarungen eingehen Jahren bekannt sind und Plasmide genannt werden.
können. Auf diese Weise können einzelne Basenpaa- Diese können unter Bakterien leicht ausgetauscht
re editiert oder ganze Gene inseriert (eingefügt) wer- werden, weshalb sich beispielsweise eine Antibioti-
den (Abbildung 10). karesistenz schnell ausbreiten kann.
Dagegen werden bei der nicht-homologen Repara- Cohen erreichte es, diesen Austausch im Labor
tur die Randbereiche ohne Vorlage verknüpft. Hier- durchzuführen. Er entwickelte eine Methode, mit
bei entstehen Fehler, das heißt, dass es zu der er Plasmide aus Bakterien isolieren und in andere
zusätzlichen oder fehlenden Basenpaarungen kommt. Bakterien einführen konnte.
Wir sprechen dann von InDels (insertions or deleti-
ons). Wurde in einem Gen geschnitten, das für ein 2.3.2 Wie sich Bakterien vor Viren schützen
Protein codiert, so kommt es mit größter Wahrschein- Parallel zu den Arbeiten von Cohen forschte der
lichkeit durch das InDel zu einer Verschiebung des US-amerikanische Wissenschaftler Herbert Boyer (
Leserasters im genetischen Code. Infolgedessen wird geb. 1936) aus San Francisco an Molekülen, mit de-
CLB 71. Jahrgang, Heft 03 - 04/2020 137
Gene lesen und verändern
gendein DNA-Fragment von irgendeinem Organis-
mus in irgendein Plasmid einbrachten, Lizenz-
gebühren zahlen. Dies brachte den Universitäten von
Stanford und San Francisco und anteilig auch Boyer
und Cohen über die Laufzeit des Patents rund 300
Millionen. US-Dollar ein. Dieses Beispiel motivierte
auch andere Universitäten weltweit, ihre Forschen-
den zur Patentierung von Verfahren zu bewegen – bis
heute. Im Jahr 1976 gründete Herbert Boyer gemein-
sam mit dem Investor Robert Swanson die erste Gen-
technikfirma namens „Genentech“, die noch heute
existiert und 1978 das erste rekombinante Insulin
auf den Markt brachte.
Herbert Boyer und Stanley Cohen haben für ihre
Arbeiten bislang keinen Nobelpreis erhalten. Es
bleibt abzuwarten, wie es Jennifer Doudna, Emmanu-
elle Charpentier, Feng Zhang und eventuell anderen
Beteiligten ergeht.
2.4 Probleme mit dem CRISPR/Cas-System
Gibt es auch Probleme? Ja, es kann vorkommen,
Abbildung 11: Stanley Cohen (links) und Herbert Boyer
(rechts) wohl 1972 in Hawaii (Foto: US National Library of
dass das CRISPR/Cas-System Fehler macht und zu-
Medicine; https://circulatingnow.nlm.nih.gov/2019/01/24/ sätzlich an anderen Stellen im Genom Änderungen
stanley-n-cohen-papers-open-for-research/). induziert.
2.4.1 Off-target-Effekte
nen sich Bakterien vor Viren schützen. Dies sind Re- Wir sprechen hierbei von off-target-Effekten. Wo-
striktionsenzyme, mit denen DNA an ganz bestimm- mit dies zusammenhängt ist nicht immer ganz klar.
ten Nukleotidabfolgen (Sequenzen) durchtrennt Die Wahrscheinlichkeit, dass dieselbe Nukleotidab-
wird, sodass an den Enden der doppelsträngigen DNA folge von zwanzig Buchstaben in einem Genom ein
einzelsträngige Überhänge mit einer spezifischen Nu- zweites Mal vorkommt und die Genschere deshalb
kleotidabfolge entstehen können. Diese Abfolge dort bindet und schneidet, ist sehr gering: Bei vier
hängt wiederum von dem verwendeten Restriktions- Buchstaben (A, T, G und C), die zwanzigmal aufeinan-
enzym ab. der folgen, ist sie 1:1 099 511 627 776, also rund
Während einer Konferenz auf der Insel Hawaii im eins zu einer Billion.
Jahr 1972 (Abbildung 11), bei der beide Wissen- Die off-target-Effekte zu minimieren, ist derzeit ein
schaftler ihre Forschungsarbeiten unabhängig vonein- wichtiges Ziel der weltweiten Forschung. Ein weite-
ander vorstellten, machte es bei beiden „klick“: res wichtiges Ziel ist, off-target-Effekte sicher zu er-
Wenn man ein Plasmid mit einem Restriktionsenzym kennen. Hierbei helfen die aktuellen Entwicklungen
öffnet und DNA von einem anderen Organismus mit der DNA-Sequenzierung im Allgemeinen und der Ein-
genau demselben Restriktionsenzym behandelt, dann zelzell-DNA-Sequenzierung im Besonderen.
können beide Fragmente an den Überhängen Basen-
paarungen bilden und fusionieren (Ligation). Es ent- 2.4.2 Möglicher Immunschock
steht wieder ein geschlossener DNA-Ring, ein Hybrid durch Antikörper gegen die Cas-Nuklease
aus dem bakteriellen Plasmid und dem DNA-Frag- Ein weiteres Problem stellt kurioser Weise eine Im-
ment des Organismus. Das ist rekombinante DNA munität von Organismen gegenüber dem bakteriellen
(rDNA). Diese kann wieder mit dem von Cohen ent- Immunsystem dar, genauer, dem Cas-Protein [26]. So
wickelten Verfahren in Bakterien eingebracht (Trans- sind verschiedene Forschungsteams auf Antikörper
formation) und dort vermehrt werden (Klonierung). gegen die Cas-Nuklease im menschlichen Immunsys-
Im Jahr 1974 gelang es auf diese Weise, den ersten tem gestoßen [27].
transgenen Organismus zu erzeugen. Dadurch könnte im Falle einer Gentherapie nicht
Dies war ein Escherichia-coli-Bakterium, das ein nur die Genschere inaktiviert werden, es könnte
Fragment des Genoms von Staphylococcus aureus in auch zu einem Immunschock kommen. Auch hier
einem Plasmid des Bakteriums Salmonella panama wird an Lösungen geforscht. Außerdem ist noch nicht
enthielt. Am 4. November 1974 meldeten Boyer und endgültig geklärt, wie andere Zellbestandteile auf das
Cohen das Verfahren beim US-amerikanischen Pa- CRISPR/Cas-System reagieren. Diese Probleme stel-
tentamt an. Im Jahr 1980 wurde ihnen das erste Pa- len sich aber nur im Moment der Anwendung. Ist die
tent erteilt, weitere folgten. Damit mussten alle DNA erst einmal editiert, geht das System bei nach-
Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler, die ir- folgenden Zellteilungen verloren.
138 CLB 71. Jahrgang, Heft 03 - 04/2020
Gene lesen und verändern
2.4.3 Mosaikbildung: Wenn nicht alle Zellen ten als auch aus nicht-editierten Zellen. Das ist an
genetisch umgeschrieben werden sich nicht schlimm. In gewisser Weise sind wir alle
Ein besonderes Risiko bei der Anwendung der Gen- genomische Mosaike, da zum Beispiel in Stammzel-
schere an befruchteten Eizellen ist die Mosaikbil- len vereinzelt Mutationen auftreten können, die alle
dung. Bei den meisten Anwendungen werden drei abstammenden Zellen dann ebenfalls tragen.
Komponenten (die Cas-Nuklease, die sgRNA und eine Auch Frauen sind ein Mosaik, in deren Zellen
Reparaturvorlage) in die Zellen injiziert (Abbildung nach jeder Zellteilung per Zufall bestimmt wird, wel-
10). ches der beiden X-Chromosomen inaktiviert wird.
Würden beide aktiv sein, käme es zu schweren Schä-
2.5 CRISPR/Cas beim Menschen den. Das Auftreten von Mosaiken nach der Behand-
Ein Team um den chinesischen Stammzellforscher lung mit der CRISPR/Cas-Genschere zeigt aber, dass
Junjiu Huang war im Jahr 2015 das erste, das die der Versuch einer „Reparatur“ einer genetischen Er-
Genschere an menschlichen Embryonen einsetzte krankung auch unvollständig enden kann.
[28]. Sie verwendeten dazu sogenannte tripronuklea-
re (3PN) Zygoten, die sich nicht zu vollständigen Em- 2.5.2 Sehr umstritten: Nana und Lulu
bryonen weiterentwickeln können. Sie entstehen bei Das umstrittenste Experiment an menschlichen
der In-vitro-Fertilisation, wenn statt einem zwei Sper- Embryonen hat der chinesische Biophysiker Jiankui
mien in die Eizelle gelangen. Dies kommt in etwa vier He durchgeführt: Er hat menschliche Embryonen
Prozent aller Fälle vor. Daher werden sie normaler- mit der Genschere behandelt, die dann als die Zwil-
weise vernichtet. Aber gerade wegen ihrer Unfähig- linge Nana und Lulu 2018 geboren wurden. Die ge-
keit, sich zu Embryonen zu entwickeln, eigenen sie sellschaftlichen Auswirkungen beleuchte ich in
sich aus ethischen Gründen für die Embryonenfor- meinem Buch (siehe Rezension in dieser CLB). Über
schung. Die Forscher injizierten in die Zygoten, die das Experiment ist bislang kaum etwas publiziert.
bereits aus mehreren Zellen bestanden, die sgRNA, Als Grundlage kann daher primär Hes Präsentation
eine Cas9-mRNA (die nach der Translation die Cas- mit dem Titel „CCR5 gene editing in mouse, monkey
Nuklease liefert) und eine einzelsträngige DNA, die and human embryos using CRISPR/Cas9“ dienen, die
als Korrekturvorlage diente. Die sgRNA steuerte das er am 28. November 2018 beim Second Internatio-
für die β-Thalassämie verantwortli-
che HBB-Gen an (Abbildung 12). Abbildung 12: Der einfache (haploide) Chromosomensatz des Menschen. Die Chromosomen sind zwi-
Thalassämien sind Erkrankungen schen 16 und 85 cm lang. CFTR bezeichnet den Ort des Gens, das in defekter Form die cystische Fibrose
der roten Blutkörperchen, bei de- (Mukoviszidose) verursacht. AB0 bezeichnet den Ort des Gens, das die Blutgruppen bestimmt. Das
nen durch einen Gendefekt das CCR5-Gen wird mit einer Resistenz gegen das HI-Virus in Verbindung gebracht. Die Gene HBA und HBB
sind bei der α- beziehungsweise β-Thalassämie mutiert. An blau markierten Positionen liegen Gene, die
Hämoglobin nicht ausreichend ge- die Firma for me do für die Klassifizierung von Ernährungstypen verwendet; an orangen Orten dagegen
bildet bzw. gesteigert abgebaut Gene, die Voraussagen über den Sportlertyp erlauben (Abb.: Wünschiers).
wird.
Von insgesamt 86 behandelten
Embryonen überlebten 71 Embry-
onen, von denen wiederum 59 alle
injizierten Komponenten enthiel-
ten. Bei diesen hat in 28 Embryo-
nen die Cas-Nuklease korrekt
geschnitten.
Bei sieben Embryonen wurde
nicht die injizierte DNA, sondern
ein Chromosom als Reparaturvor-
lage verwendet. Bei vier Embryo-
nen wurde das HBB-Gen korrekt
mit der DNA-Vorlage editiert.
2.5.1 Zellen-Mosaik
ist nicht ungewöhnlich
Diese vier Embryonen waren
aber ein Mosaik aus Zellen, die auf
unterschiedliche Weise repariert
wurden. Das bedeutet, dass nach
der Injektion der Genscheren-
Komponenten nicht alle Zellen
editiert wurden. Die Embryonen
bestanden also sowohl aus editier-
CLB 71. Jahrgang, Heft 03 - 04/2020 139Gene lesen und verändern
wenn das Gen homozygot vor-
liegt, also sowohl das mütterliche
als auch das väterliche Allel diese
Deletion enthalten. Das Allel ist
vermutlich vor rund 2000 Jahren
zu der Zeit der Wikinger entstan-
den. In Europa liegt der Anteil ho-
mozygoter Träger bei ein bis zwei
Prozent. Interessanter Weise ist
der HI-Virus in seiner den Men-
schen infizierenden Form noch re-
lativ jung. Es wird vermutet, dass
die ersten Übertragungen vom
Schimpansen auf den Menschen
Abbildung 13: Links: Der HI-Virus infiziert eine weiße Blutzelle der Immunabwehr. Dazu muss er an den
um 1900 in Kamerun stattfanden
CCR5-Rezeptor und das CD4-Glykoprotein binden. Rechts: Das Fehlen von 32 Basenpaaren (Δ32) im CCR5- [33]. Dagegen ist die CCR5Δ32-
Gen führt dazu, dass der Virus das Protein nicht mehr erkennt. Mit dem Antikörper N6 kann das Glykoprote- Variante des Rezeptorproteins vor
in CD4 „verdeckt“ werden. Beide Mechanismen führen zu einer Immunität gegen HIV (Abb.: Wünschiers). etwa 2000 Jahren das erste Mal
beim Menschen aufgetreten, ver-
mutlich in der Region des heutigen Finnlands, und
nal Summit on Human Genome Editing in Hong Kong wurde seitdem offensichtlich positiv selektioniert
hielt – und vieles, das seitdem darüber geschrieben [34]. Das bedeutet, dass es Trägerinnen und Trägern
wurde [29]. Von He selbst gibt es dazu keine wissen- dieses Allels einen Vorteil verschafft und es sich des-
schaftliche Veröffentlichung und es ist auch eine gro- halb seit dieser Zeit ausgebreitet hat. Wissenschaftle-
ße Frage, ob es je eine geben wird. rinnen und Wissenschaftler vermuten, dass der
Welche Geneditierung hat He durchgeführt? Dazu Vorteil in einer Resistenz gegen Pockenviren gelegen
muss ich ein bisschen ausholen. Für AIDS-Kranke war hat [35].
das Jahr 2009 ein Jahr der großen Hoffnung: Das Cha-
rité Klinikum in Berlin verkündete, dass der soge- 2.5.2.3 Hes Motivation:
nannte Berliner Patient nach einer Knochenmark- Kinder für AIDS-Kranke
transplantation von AIDS geheilt wurde [30]. Hes Motivation für seine Gentherapie in der
menschlichen Keimbahn ist in erster Linie, dass
2.5.2.1 Berliner und Londoner HIV-Patienten: AIDS-kranke Paare Nachkommen bekommen kön-
Spezielle Stammzellenübertragungen nen. Das Risiko für Neugeborene, an AIDS zu er-
Hinter dem Berliner Patient verbirgt sich der da- kranken, ist in den ersten Lebensmonaten um ein
mals 40-jährige US-Amerikaner Timothy Ray Brown. Vielfaches erhöht. Durch das Einfügen einer Deleti-
Nachdem bei ihm die AIDS-Infektion über mehrere on in das CCR5-Gen bei befruchteten Eizellen will
Jahre medikamentös stabil unterdrückt wurde, kam He die Babys immun gegenüber einer Infektion mit
2006 die Diagnose einer schwerwiegenden Blut- HI-Viren machen. Für die Gentherapie hat He sie-
krebserkrankung (akute myeloische Leukämie) hinzu. ben Paare einer AIDS-Selbsthilfegruppe geworben,
Als Therapie ermöglichte ihm der Arzt Dr. Gero bei denen der Mann an AIDS erkrankt ist, die Frau
Hütter vom Charité Klinikum im Februar 2007 die aber nicht. Den Paaren und Babys wurden die Be-
Übertragung blutbildender Stammzellen eines Spen- handlungs- und Nachuntersuchungskosten erstat-
ders, der homozygoter Träger der CCR5Δ32-Variante tet. Dies entspricht einem Gegenwert von
eines Rezeptorproteins und damit immun gegenüber umgerechnet rund 35 000 Euro. Bei zwei Paaren
dem HI-Virus ist [31]. Die Therapie wirkte und konn- wurden der Mutter geneditierte Blastocysten im-
te zehn Jahre später an einem weiteren Patienten, plantiert (Abbildung 14).
dem Londoner Patienten, erfolgreich wiederholt wer- Das größte Augenmerk des Forscherteams um Jian-
den [32]. Das CCR5-Gen codiert einen Chemokin-Re- kui He lag darauf, die beschriebenen off-target-Editie-
zeptor, das dem verbreitetsten und aggressivsten HI- rungen zu vermeiden. Daher wurden sowohl die
Virus (Typ R5-tropic HIV-1), gemeinsam mit dem Eltern als auch die Blastocysten und die Babys mehr-
CD4-Glykoprotein auf den weißen Blutzellen (T-Zel- fach komplett sequenziert. Für die Genomsequenzie-
len) des Immunsystems, als Eintrittsstelle dient (Ab- rungen (Kap. 4) nutzte He auch die Einzelzell-
bildung 13). sequenzierung, bei der eine einzelne Zelle ausreicht,
um das gesamte Erbgut zu lesen.
2.5.2.2 CCR5Δ32 2000 Jahre alt – HIV 120 Von der Blastocyste können vor der Implantation
Bei der CCR5Δ32-Variante fehlen 32 Basenpaare – nur etwa fünf Zellen entnommen werden, ohne ihre
das Delta-Zeichen steht für eine Deletion (Löschung). Entwicklung zu beinträchtigen. Es wurden bei den
Dies führt zu einer Resistenz gegen den HI-Virus, Babys keine off-target-Editierungen nachgewiesen.
140 CLB 71. Jahrgang, Heft 03 - 04/2020Gene lesen und verändern
Abbildung 14: Die Zwillinge Lulu und Nana sind die ersten gentherapierten beziehungsweise geneditierten Babys. Während
der In-vitro-Fertilisation beziehungsweise – genauer – der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) wurde ihnen neben
dem Spermium auch das Protein der DNA-Nuklease Cas9 und eine single guide RNA (sgRNA) injiziert. Cas9 und die sgRNA
bilden gemeinsam die Genschere (Abb.: Wünschiers).
2.5.2.4 Zwillinge mit unterschiedlichen Genen: ne „Korrekturvorlage“ verwendet wurde (Abbildung
Kein Erfolg bei Lulu 10), sondern nur das ungenaue DNA-Reparatursys-
Allerdings sind die Veränderungen des CCR5-Gens tem zum Einsatz kam. Die Genschere hat also präzise
bei beiden Zwillingen unterschiedlich (Abbildung geschnitten und die Editierungen sind alle in dem
15). Während Lulus Genom eine unveränderte Versi- von Hes Team anvisierten Bereich. Aber die Repara-
on (Allel) und eine Version mit einer 15 Basenpaar- tur war erwartungsgemäß nicht exakt. Die Zwillinge
Deletion enthält, sind bei Nana beide Allele veränder- sollen bis zu ihrem achtzehnten Lebensjahr regelmä-
t: Ein Allel enthält eine 4-Basenpaar-Deletion und ein ßig medizinisch untersucht werden.
Allel die Einfügung eines Basenpaares. Neben Lulu und Nana soll im Sommer 2019 die
Aus diesen Ergebnissen folgt, dass Lulu, mit nur ei- Geburt eines weiteren editierten Babys von einem
nem veränderten Allel, heterozygot ist und vom HI- weiteren Paar erfolgt sein. Alle anderen erzeugten
Virus infiziert werden kann. Das intakte CCR5-Gen Embryonen werden vorerst nicht weiterverwendet,
wirkt dominant. Die Gentherapie hatte hier also kei- da die chinesischen Behörden He die Fortsetzung der
nen Erfolg. Von Nana ist dagegen zu erwarten, dass Arbeiten verboten haben. Im Juni 2019 hat jedoch
sie resistent gegenüber AIDS sein wird. Das wirft die der russische Molekularbiologe Denis Rebrikov ange-
Frage auf, wie die Zwillinge und auch die Eltern da- kündigt, in seiner Reproduktionsklinik in Moskau
mit umgehen werden, dass nur ein Kind die ge- ebenfalls HIV-resistente CRISPR-Babies zu erzeugen.
wünschte Eigenschaft trägt. Zudem zeigt der Eingriff, Es ist wichtig zu wissen, dass He mit seinem Experi-
dass mindestens drei verschiedene Allele entstanden ment gegen chinesisches Recht verstoßen hat, das die
sind. Dies ist dem Verfahren geschuldet, bei dem kei- Einpflanzung in der Forschung generierter Embryo-
Abbildung 15: Ausschnitte der DNA-Sequenzen des CCR5-Gens auf Chromosom 13 bei den Eltern und ihren Zwillingen Lulu
und Nana. Von jedem Chromosomenpaar ist jeweils nur ein DNA-Strang dargestellt. Über beziehungsweise unter den DNA-
Sequenzen sind die Aminosäuresequenzen (als Einzelbuchstabencode) des resultierenden CCR5-Proteins gezeigt. Die Deletio-
nen und Insertionen in der DNA sind grün markiert (Abb.: Wünschiers).
CLB 71. Jahrgang, Heft 03 - 04/2020 141Gene lesen und verändern
nen ausdrücklich verbietet. Ende Dezember 2019 be- wird nicht in das Erbgut eingebaut. Er wird lediglich
richtete die staatliche Nachrichtenagentur Xinhua, exprimiert, woraufhin das CRISPR/Cas-System seine
dass er in einem nichtöffentlichen Prozess in Shenz- Arbeit verrichtet. In den Tochterzellen der
hen zu drei Jahren Freiheitsstrafe und der Zahlung anschließenden Zellteilung geht der DNA-Vektor
einer Geldstrafe von umgerechnet rund 380 000 dann verloren. Er wird nicht wie das Erbgut vervielfäl-
Euro wegen unethischer und nicht genehmigter Me- tigt und weitergegeben, sondern ist nur vorüberge-
dizinforschung verurteilt worden sei. hend (transient) vorhanden.
Ein wesentlicher Kritikpunkt an Hes Gentherapie Man kann daher sagen, dass das Verfahren Gen-
war auch ihr Ziel. AIDS ist zwar eine schwerwiegende technik ist, das Produkt aber nicht. Der EuGH kon-
Erkrankung, der aber auch anders vorgebeugt werden zentrierte sich in seinem Urteil aber auf das
kann. Damit werten die meisten Wissenschaftlerin- Verfahren. Unabhängig von dieser regulativ wichti-
nen und Wissenschaftler den Eingriff eher als ein en- gen Frage wird die Geneditierung derzeit intensiv un-
hancement, eine Verbesserung, denn als Therapie. ter anderem in der medizinischen und
Dafür aber sind die Risiken, die He eingegangen ist, Züchtungsforschung eingesetzt. Es herrscht Goldgrä-
unverhältnismäßig hoch. Hinzu kommt, dass dem berstimmung.
CCR5-Gen noch weitere Funktionen zugeschrieben
werden, die durch die Deletion beeinträchtigt sein 4. Gene erschaffen: Synthetische Biologie
können. So scheinen Trägerinnen und Träger defek-
ter CCR5-Allele anfälliger für Infektionen durch an- Neueste Methoden der Gentechnik beinhalten
dere Viren wie das West-Nil-Fieber Virus zu sein, das nicht nur die präzise Veränderung des Erbgutes ohne
eine Form der Hirnhautentzündung verursachen dabei „Spuren“ zu hinterlassen, sondern auch die
kann. komplett chemische Synthese von Erbinformation.
Es gibt auch Hinweise darauf, dass die CCR5Δ32- Das DNA-Molekül kann also im Reagenzglas syntheti-
Variante des Chemokin-Rezeptorproteins für einen siert werden. Die synthetische Biologie geht weiter
schwereren, eventuell tödlichen Verlauf einer ge- als die Gentechnik, indem sie die Bio- beziehungswei-
wöhnlichen Grippeinfektion beiträgt [36]. Zusätzlich se Gentechnik zu einer wahren Ingenieurkunst erhe-
scheint das CCR5-Gen bei der Entwicklung kogniti- ben möchte, die mit standardisierten Bauteilen
ver Prozesse eine Rolle zu spielen [37]. So konnte bei arbeitet, respektive DNA-Modulen. Details dazu habe
Mäusen gezeigt werden, dass eine Beeinträchtigung ich in der CLB in dem Artikel „Synthetische Biologie
molekularer Signalweitergaben über das CCR5-Re- – Forscher wollen Lego“ in Ausgabe 7/8-2013, Seiten
zeptorprotein zu verbesserten Gedächtnisleitungen 296-311 beschrieben. �
führen [38]. Wie die Effekte beim Menschen sind, ist
allerdings noch unerforscht. Es gibt also neben der
Ethik auch viele medizinische Gründe, um zum ge-
genwärtigen Zeitpunkt die Finger vom CCR5-Gen in
der Keimbahn zu lassen.
3. Ist CRISPR/Cas Gentechnik? Literatur
Ist Genschere nun Gentechnik? Diese Frage ist mit
einem klaren Ja zu beantworten, wenn man sich das [1] Sanger F, Coulson AR (1975). A rapid method for determining
Verfahren ansieht. In die Zielzelle muss das Werk- sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase.
zeug für die genetische Mutagenese eingebracht wer- J Mol Biol 94: 441–8.https://doi. org/10.1016/0022-
den, also ein Cas-Enzym (meist Cas9) als DNA- 2836(75)90213-2
schneidende Nuklease (oder alternativ die codieren- [2] Maxam AM, Gilbert W (1977). A new method for sequencing
de mRNA) und das sgRNA-Konstrukt, welches das En- DNA. Proc Natl Acad Sci USA 74: 560–4. https://doi. org/
zym an die richtige Position an der DNA lenkt. Dazu 10.1073/pnas.74.2.560
gibt es verschiedene Möglichkeiten. In einfachsten [3] Ronaghi M, Karamohamed S, Pettersson B, Uhlén M, Nyrén, P
Fall werden das Cas-Protein und die sgRNA direkt in (1996). Real-time DNA sequencing using detection of
eine Zelle eingebracht. Sie verrichten ihre Arbeit und pyrophosphate release. Anal Biochem 242: 84–9. https://
werden in der Zelle rasch abgebaut. Meistens werden doi.org/10.1006/abio.1996.0432
aber die beiden genetischen Sequenzinformationen [4] Shendure J, Ji H (2008) Next-generation DNA sequencing. Nat
in einen DNA-Vektor (Plasmid, Virus) integriert, der Biotechnol 26: 1135–1145. https://doi.org/10.1038/ nbt1486
dann in die Zielzelle geschleust wird. Bei beiden Ver- [5] Wheeler DA, Srinivasan M, Egholm M, et al (2008) The complete
fahren wird Erbinformation in eine Zelle integriert. genome of an individual by massively parallel DNA sequencing.
Bei Pflanzen und Bakterien wird dies Transformati- Nature 452: 872–876.https://doi. org/10.1038/nature06884
on, bei Wirbeltieren wie dem Menschen Transfekti- [6] Levy S, Sutton G, Ng PC, et al (2007) The diploid genome
on genannt und ist ein gentechnisches Verfahren. sequence of an individual human. PLoS Biol 5: e254. https://
Allerdings bleibt der Vektor immer separiert und doi.org/10.1371/journal.pbio.0050254
142 CLB 71. Jahrgang, Heft 03 - 04/2020Sie können auch lesen
