Entwicklung eines Protein-Kopplungsverfahrens basierend auf WW-Domänen
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Entwicklung eines Protein-Kopplungsverfahrens
basierend auf WW-Domänen
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium
(Dr. rer. nat.)
vorgelegt der
Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät
der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg
von Christoph Parthier
geboren am 29. Mai 1973 in Halle
Gutachter: 1. Prof. Dr. R. Rudolph, Institut für Biotechnologie, Universität Halle
2. Prof. Dr. A. Beck-Sickinger, Institut für Biochemie der Universität Leipzig
3. Prof. Dr. J. Balbach, Institut für Biophysik, Universität Halle
verteidigt am: 02. März 2005
urn:nbn:de:gbv:3-000008083
[http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn=nbn%3Ade%3Agbv%3A3-000008083]Inhaltsverzeichnis Seite 1 Inhaltsverzeichnis I. Einleitung..............................................................................4 I.1. Verfahren zur artifiziellen Proteinassoziation ...................................................... 4 I.1.1. Chemische Konjugation von Proteinen (crosslinking)............................................................ 5 I.1.2. Gerichtete Assoziation und Kopplung von Proteinen ........................................................ 6 I.2. WW-Domänen .....................................................................................................12 I.2.1. Struktur und Funktion von WW-Domänen ........................................................................ 12 I.2.2. Spezifische Bindungsmotive der WW-Domänen ............................................................... 14 I.2.3. Biologische Bedeutung von WW-Domänen ....................................................................... 16 I.2.4. Das Formin-bindende Protein 11 (FBP11) ......................................................................... 18 I.3. Ziel der Arbeit ......................................................................................................21 II. Material und Methoden.......................................................22 II.1. Geräte und Zubehör............................................................................................ 22 II.2. Chemikalien, Enzyme, Kits.................................................................................................... 23 II.3. Bakterienstämme...................................................................................................................... 24 II.4. Plasmide .................................................................................................................................... 24 II.5. Oligonukleotide........................................................................................................................ 24 II.6. Lösliche Peptide....................................................................................................................... 25 II.7. Zusammensetzung häufig verwendeter Puffer und Lösungen ......................................... 26 II.8. Nährmedien für die Kultivierung von E.coli........................................................................ 27 II.9. Molekularbiologische Methoden ........................................................................................... 28 II.9.1. Isolierung und Aufreinigung von DNA aus E.coli.............................................................. 28 II.9.2. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)........................................................................................ 28 II.9.3. Ortsgerichtete Mutagenese..................................................................................................... 28 II.9.4. DNA-Sequenzierung............................................................................................................... 28 II.9.5. Generierung der GST-WW-Fusionskonstrukte.................................................................. 29 II.9.6. Klonierung der Polyprolin-GFP-Fusionsproteine.............................................................. 30 II.10. Proteintechnologische Methoden....................................................................... 32 II.10.1. Kultivierung von E.coli und rekombinante Proteinexpression ......................................... 32 II.10.2. Kultivierung von E.coli zur Expression 15N/13C-markierter Proteine............................. 32 II.10.3. Zellernte, -aufschluß und Gewinnung des löslichen Proteinanteils ................................. 32 II.10.4. Glutathion-Affinitätschromatografie.................................................................................... 32 II.10.5. Immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatografie (IMAC) ........................................ 33 II.10.6. Proteolytische Spaltung von Fusionsproteinen durch Thrombin .................................... 33 II.10.7. Analytische und präparative Reversed-Phase-HPLC .............................................................. 33 II.10.8. Analytische und präparative Gelfiltrationschromatografie................................................ 34 II.10.9. Lyophilisation........................................................................................................................... 35 II.10.10. Konzentrierung von Proteinlösungen .................................................................................. 35 II.10.11. Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ..................... 35 II.11. Peptidchemische Methoden & Spot-Membran-Techniken............................... 36 II.11.1. Festphasensynthese und Reinigung löslicher Peptide ........................................................ 36 II.11.2. Herstellung membrangebundener Peptidbibliotheken (Spot-Synthese)........................... 36 II.11.3. N-terminale Biotinylierung der WW-Domäne .................................................................... 39 II.11.4. Bindungsanalysen unter Verwendung membrangebundener Peptidbibliotheken ......... 40 II.12. Biophysikalische Methoden & Strukturaufklärung ............................................41 II.12.1. Bestimmung der Proteinkonzentration durch UV/VIS-Spektroskopie.......................... 41 II.12.2. Bindungsanalysen mittels Fluoreszenzspektroskopie (Fluoreszenztitration).................. 42 II.12.3. Bestimmung der Dissoziationskonstante durch Bindungskompetition .......................... 43
Seite 2 Inhaltsverzeichnis
II.12.4. Bestimmung der thermodynamischen Bindungsparameter (van't Hoff-Analyse) ......... 44
II.12.5. pH-Titration der Ligandenbindung ...................................................................................... 44
II.12.6. Bestimmung des Redoxpotentials und der freien Energie ................................................ 44
II.12.7. Chemisch induzierte Entfaltungs- und Rückfaltungsübergänge ...................................... 45
II.12.8. Analyse thermisch induzierter Entfaltungsübergänge........................................................ 46
II.12.9. Differential Scanning-Kalorimetrie (DSC) .......................................................................... 47
II.12.10. Massenspektrometrie .............................................................................................................. 47
II.12.11. Strukturmodellierung und -visualisierung ............................................................................ 47
II.12.12. Kernresonanz-Spektroskopie (NMR) .................................................................................. 48
III. Ergebnisse........................................................................... 51
III.1. Charakterisierung der WW-Domäne FBP11-WW1 ..............................................51
III.1.1. Wildtyp-Varianten von FBP11-WW1: WW-AKSM und WW-∆kt.................................. 51
III.1.2. Herstellung der isolierten WW-Domäne ............................................................................. 51
III.1.2.1. Expression und Reinigung der GST-WW-Fusionsproteine ............................................. 52
III.1.2.2. Gewinnung der isolierten WW-Domäne ............................................................................. 53
III.1.3. Spektroskopische Eigenschaften........................................................................................... 54
III.1.3.1. Fluoreszenz .............................................................................................................................. 54
III.1.3.2. Circulardichroismus ................................................................................................................ 55
1
III.1.3.3. H-NMR.................................................................................................................................... 57
III.1.4. Stabilität der isolierten WW-Domäne .................................................................................. 58
III.1.4.1. Stabilität gegenüber Guanidinhydrochlorid......................................................................... 58
III.1.4.2. Thermische Stabilität............................................................................................................... 60
III.1.5. Bindung prolinreicher Liganden............................................................................................ 63
III.1.5.1. Sekundärstruktur prolinreicher Liganden ............................................................................ 63
III.1.5.2. Affinität von FBP11-WW1 zu prolinreichen Liganden..................................................... 64
III.1.5.3. pH-Abhängigkeit der Dissoziationskonstante .................................................................... 66
III.1.5.4. Temperaturabhängigkeit und Bestimmung der thermodynamischen Parameter........... 67
III.1.5.5. Abhängigkeit von der Salzkonzentration............................................................................. 69
III.1.5.6. Bindungsstudien unter Verwendung Cellulose-Membran-gebundener
Peptidbibliotheken (Spot-Technologie): Etablierung der Bindungsanalytik .................. 70
III.1.5.7. Analyse der Bindung von FBP11-WW1 an Varianten prolinreicher Liganden ............ 72
III.2. Strukturaufklärung von FBP11-WW1 .................................................................. 75
III.2.1. Herstellung und Reinigung von 13C/15N-markierter WW-Domäne ................................ 75
III.2.2. Aufnahme der NMR-Spektren und Zuordnung der Resonanzfrequenzen................... 76
III.2.3. Struktur der isolierten WW-Domäne (ohne Ligand) ......................................................... 76
III.2.4. Analyse der Ligandenbindung mittels NMR ....................................................................... 78
III.2.5. Struktur von FBP11-WW1 im Komplex mit einem prolinreichen Liganden ................ 80
III.2.6. Struktureller Vergleich der WW-Domäne im freien Zustand mit dem Komplex ........ 83
III.3. Etablierung des kovalenten Kopplungssystems................................................. 85
III.3.1. Überblick .................................................................................................................................. 85
III.3.2. Cystein-Varianten der WW-Domäne ................................................................................... 85
III.3.2.1. Modellierung und Mutagenese von WW-D24C und WW-K35C .................................... 86
III.3.2.2. Charakterisierung der Cystein-Varianten ............................................................................. 87
III.3.3. Cystein-Varianten des Polyprolin-Liganden........................................................................ 90
III.3.4. Kovalente Kopplung von WW-Domäne und prolinreichem Ligand.............................. 93
III.3.4.1. Versuche zur Verbrückung auf Peptid-Spot-Membranen................................................. 93
III.3.4.2. Verbrückung in Lösung - Etablierung der HPLC-Analytik .............................................. 94
III.3.4.3. Analyse der Stabilisierung des disulfidverbrückten Komplexes ....................................... 95
III.3.4.4. Spezifität der Stabilisierung.................................................................................................... 98
III.3.4.5. Das Redoxpotential der WW-Polyprolin-Disulfidbrücke ............................................... 100Inhaltsverzeichnis Seite 3
III.3.4.6. Disulfidverbrückung des Komplexes durch Oxidation in Gegenwart von
Luftsauerstoff .........................................................................................................................105
III.3.4.7. 1H-NMR-Analyse ausgewählter kovalenter Komplexe von WW-Domäne und Ligand
..................................................................................................................................................108
III.3.5. Kovalente Assoziation von GST-WW und PP-GFP .......................................................110
III.3.5.1. Herstellung der GST- und GFP-Fusionsproteine ............................................................111
III.3.5.2. Bindungseigenschaften von GST-WW-K35C...................................................................112
III.3.5.3. Nachweis der kovalenten Assoziation von GST und GFP.............................................113
III.3.5.4. Spezifität der Assoziation .....................................................................................................119
III.3.5.5. Thermische Stabilität des GST-GFP-Komplexes.............................................................120
IV. Diskussion ......................................................................... 122
IV.1. Stabilität, Funktion und Struktur von FBP11-WW1...........................................122
IV.1.1. Stabilität der FBP11-WW1-Varianten ................................................................................122
IV.1.2. Biochemische Charakterisierung der PPLP(P)-Bindung .................................................124
IV.1.3. Strukturelle Basis der PPLP(P)-Bindung durch FBP11-WW1 .......................................126
IV.2. Kovalent stabilisierte Assoziation vermittelt durch WW-Domänen..................130
IV.2.1. FBP11-WW1 und prolinreiche Sequenzen als Heterodimerisierungsmotiv.................130
IV.2.2. Strukturelle Aspekte der artifiziellen Disulfidbrücke........................................................132
IV.2.3. Einfluß des Oxidationsverfahrens auf Effizienz und Spezifität der Kopplung ..........135
IV.2.4. FBP11-WW1/Polyprolin im Vergleich mit anderen Assoziationsverfahren................140
IV.2.5. Szenario einer Anwendung: Modulares Vektorsystem basierend auf VP1..................143
V. Zusammenfassung ............................................................ 148
VI. Literaturverzeichnis........................................................... 150
VII. Anhang .............................................................................. 169
VII.1. Übersicht der experimentell bestimmten Molekularmassen ...........................................169
VII.2. Dissoziationskonstanten bestimmt für WW-AKSM mit PPN1/PPN2........................170
VII.3. NMR-Strukturstatistik...........................................................................................................171
VII.4. Atomnomenklatur ausgewählter Aminosäuren................................................................172
VII.5. RP-HPLC-Retentionszeiten der Kopplungsspezies .........................................................173
VII.6. Verwendete Abkürzungen und englische Fachbegriffe ...................................................174Sie können auch lesen
