Eppendorf Conical Tubes 25 mL: The Next Level - Eppendorf Corporate
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Nr. 52 – 2020
> >
Eppendorf Conical Tubes
25 mL: The Next Level (BN 52) JANUAR 2020
Optimierung der Bakterienkultur und Plasmidaufreinigung
mit Hilfe von Eppendorf Conical Tubes 25 mL
SEITE 1
RAFAL GRZESKOWIAK, EPPENDORF AG, HAMBURG
SANDRINE HAMELS, BLANDINE VANBELLINGHEN, EPPENDORF APPLICATION TECHNOLOGIES, S.A., NAMUR, BELGIEN
> Vorteile von Standardisierung in der Mikrobiom-Forschung
Zusammenfassung Gefäßes), und häufig dienen sie daher nicht der optimalen
Produktivität einer Bakterienkultur und somit der maximalen
Die Plasmidaufreinigung aus Bakterienkulturen stellt ein
DNA-Ausbeute – insbesondere bei low-copy Plasmiden.
weitverbreitetes Protokoll in Laboren der Molekularbiologie
und der Life Sciences dar. Für mittelgroße Ansätze werden Diese Nachteile werden speziell durch die Eppendorf Conical
meist 15 mL konische Gefäße mit Schraubdeckelverschluss Tubes 25 mL mit Schnappdeckel (SnapTec®) in Angriff genom-
eingesetzt; diese ziehen jedoch häufig Nachteile in der Hand- men. Sie bieten eine deutlich verbesserte Einhandbedienung,
habung nach sich und erzielen weder eine optimale Produkti- bei gleichbleibender Sicherheit für Applikationen im mittleren
vität der Bakterienkultur noch eine maximale DNA-Ausbeute. Volumenbereich zwischen 15 mL und 50 mL.
Eppendorf Conical Tubes 25 mL mit Schnappdeckel nehmen
> Eppendorf Digital Solutions: Probenverwaltung digitalisieren
Im Rahmen dieser Anwendung wurden sowohl die Bakterien-
sich dieser Hindernisse an. In der vorliegenden Application
kultur als auch die nachfolgende Aufreinigung von low-copy
Note zeigen wir, dass die Produktivität der Bakterienkultur
Plasmid-DNA durch standardmäßige alkalische Lyse mit Hilfe
sowie die DNA-Ausbeute beim Einsatz von 25-mL-Gefäßen im
von entweder Eppendorf Conical Tubes 25 mL oder regulären
Vergleich wesentlich höher ausfielen als mit standardmäßigen
15 mL konischen Gefäßen miteinander verglichen. Der Ein-
15 mL konischen Gefäßen, und dass gleichzeitig sowohl die
satz von 25-mL-Gefäßen erzielte eine erhöhte Produktivität
Handhabung als auch die Durchführung des Workflows deut-
der Bakterienkultur sowie eine erhöhte Ausbeute an Plasmid-
lich verbessert werden konnten.
DNA, bei gleichzeitiger Verbesserung der Handhabung sowie
Einleitung des gesamten Workflows.
Die Bakterienkultur und die nachfolgende Plasmidaufreinigung Material und Methoden
gehören zweifelsohne zu den am häufigsten durchgeführten
> 25 Jahre Eppendorf Award for Young European Investigators
Bakterienkultur
Protokollen in Laboren der Molekularbiologie und der Life
Sciences. Trotz zunehmender Verfügbarkeit und Erschwing- Escherichia coli Bakterien (DH5α, Invitrogen™), transformiert
lichkeit von Plasmidaufreinigungs-Kits verschiedener Anbieter mit low-copy Plasmid-DNA (pBR322™, Invitrogen), wurden in
ist die Standardmethode der alkalischen Lyse [1] nach wie vor dreifacher Ausführung über einen Zeitraum von 16 Stunden in
weit verbreitet und im akademischen Sektor fest etabliert. Diese LB-Medium mit Ampizillin kultiviert (37 °C, 250 Upm, Innova®
Methode ist kostengünstig und skalierbar, und sie erzielt typi- S44i Schüttler, Eppendorf). Das Zellwachstum wurde durch
scherweise hohe Ausbeuten an reiner Plasmid-DNA, welche Messung der optischen Dichte bei 600 nm (OD600) mit Hilfe
sodann direkt in zahlreichen nachfolgenden Anwendungen, wie eines Eppendorf BioSpectrometer ® bestimmt, und eine
z.B. Restriktionsverdau, Klonierungen oder Sequenzierungen, Schätzung der Anzahl an E. coli Bakterien wurde durch die
eingesetzt werden kann. folgende Umrechnungsformel vorgenommen:
Für mittelgroße Ansätze werden in der Regel 15 mL konische
Gefäße mit Schraubdeckel eingesetzt. Diese bieten einen OD600 of 1,0 ≈ 5 x 108 Zellen/mL
dichten Deckelabschluss und gute Zentrifugationsstabilität;
allerdings sind sie ebenfalls mit Nachteilen bei der Handhabung Extraktion von low-copy Plasmid-DNA
behaftet (der Umgang mit dem Schraubdeckel, Kreuzkonta-
Die Extraktion von Plasmid-DNA erfolgte mit Hilfe eines stan-
mination, schwierige Erreichbarkeit der Probe am Boden des
Application Notes
dardmäßigen alkalischen Lyse-Protokolls: 7,5 mL der Bakterien-
kultur wurden bei 10.000 x g zentrifugiert (5 min, Raumtem-
peratur), und die Pellets wurden in 1,5 mL Lösung 1 (50 mM
Glucose; 10 mM EDTA; 25 mM Tris pH 8,0; 100 µg/mL RNase A)
aufgenommen. Nach 5 min Inkubationszeit wurden 3 mL der
Lösung 2 (0,2 NaOH; 1 % SDS) hinzugegeben, gefolgt von einer
weiteren Inkubation (10 min, Eis). Sodann wurden 2,25 mL der
Lösung 3 (3M KOAc, pH 5,4) hinzugefügt. Die Proben wurden
durchmischt und bei 17.000 x g (30 min, 4 °C) zentrifugiert.
Bakterienkultur und Plasmidaufreinigung optimieren mit Eppendorf Conical Tubes 25 mL ∙
Die Überstände wurden in frische Gefäße überführt, mit einem
Volumen Isopropanol gefällt, durchmischt und sodann erneut
bei 17.000 x g (30 min, 4 °C) zentrifugiert. Die Pellets wurden
gewaschen und in 200 μL TE Puffer resuspendiert.
Für die 15 mL Bakterienkultur wurden die Puffer zur alkalischen
Lyse um den Faktor 2 hochskaliert. Die Zentrifugation wurde
in der Eppendorf Centrifuge 5810 R mit dem Rotor FA-45-6-30
hMSCs: Zuverlässige Expansion mit der CCCadvanced® FN1 motifs Oberfläche ∙ etc.
und entsprechenden Gefäßadaptern durchgeführt.
Your local distributor: www.eppendorf.com/contact
Eppendorf AG · Barkhausenweg 1 · 22339 Hamburg · Germany · E-Mail: eppendorf@eppendorf.com · www.eppendorf.com
2 EDITORIAL · LIEBE LESER
Impressum
Herausgeber
Eppendorf AG, Barkhausenweg 1,
22339 Hamburg, Deutschland
Telefon: + 49 40 53 801- 0
Fax: + 49 40 53 801- 556
E-Mail: bionews@eppendorf.de
www.eppendorf.com/bionews
Redaktionsteam
Berrit Hoff (Projektleitung), Dr. Hanaë
König, Dr. Tanja Musiol, Natascha Weiß
Gestaltung
Holger Paulsen Grafik-Design, Hamburg
Druck
Gebr. Klingenberg & Rompel in Hamburg
GmbH, Hamburg
Bildnachweis
Alle Bilder Eppendorf AG. Ausnahmen:
S. 10 – 11: G. Vallentin; S. 24: Science/
Liebe Leser,
AAAS; Application Note S. 8: H. Matsui
Kontakt
Eppendorf Vertrieb Deutschland GmbH
Peter-Henlein-Str. 2
arbeiten auch Sie häufig mit Probenvolumina, die größer als 15 mL, aber deutlich klei-
50389 Wesseling-Berzdorf
ner als 50 mL sind? Und ärgern Sie sich, wenn Sie ein herkömmliches 50-mL-Gefäß
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verwenden müssen, das für Ihre Probe viel zu groß ist? Dann können Sie sich jetzt
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> verbessertes Handling und Potenzial für Platzeinsparung bei der Lagerung. Der damit
E-Mail: vertrieb@eppendorf.de >
verbundene geringere Rohstoffverbrauch schont Ressourcen und reduziert die Labor- Vertrieb Schweiz
abfallmenge. Ganz neu ist auch die Variante mit Schnappdeckel, der einhändiges Öffnen Vaudaux-Eppendorf AG
und Schließen ermöglicht. Mehr dazu auf den Seiten 4 – 5. Im Kirschgarten 30
4124 Schönenbuch/Basel
Gerald Vallentin aus Leipzig hat fast 48 Jahre lang mit Eppendorf-Produkten gearbeitet.
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Kurz vor seinem Ruhestand hat er seine Karriere Revue passieren lassen (S. 11–12).
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BioNews-Ausgabe ab.
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ohne jede Diskriminierungsabsicht wird
im Text ausschließlich eine Form genutzt,
die alle Geschlechter einbezieht.
Irrtum und technische Änderungen
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Markenhinweise auf Seite 14.
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© Copyright Eppendorf AG, Januar 2020.
bionews@eppendorf.de. Wir freuen uns auf Ihr Feedback! Klimaneutral gedruckt in Deutschland.
INHALT 3
4 8 10
IM BLICKPUNKT Eppendorf Conical Tubes 25 mL: The Next Level 4–5
LABORPRAXIS Vorteile von Standardisierung in der Mikrobiom-Forschung 8
Eiszeit für Ihre Proben? 9
48 Jahre mit Eppendorf, ein Labortechniker erinnert sich 10 –11
INNOVATION Your Sample Goes Digital: Optimieren Sie Ihr Probenmanagement 6–7
NEWS / TIPPS Flaschendrehen: Steigern Sie Kapazität und Durchsatz 7
So bleiben Ihre Pipettierergebnisse reproduzierbar! 11
> >
25-jähriges Jubiläum des Eppendorf Award 12 –13
Registrieren Sie Ihre Produkte – jetzt noch einfacher! 13
Willkommen in Hamburg: Johannes Kohl und Georg Winter 14
SERVICE Markenhinweise 14
Gewinnspiel: Neues Pipettiersystem zu gewinnen 15
RAFAL GRZESKOWIAK, SANDRINE HAMELS, BLANDINE VANBELLINGHEN
(BN 52) JANUAR 2020 SEITE 1
Optimierung der Bakterienkultur und Plasmidaufreinigung
mit Hilfe von Eppendorf Conical Tubes 25 mL
RAFAL GRZESKOWIAK, EPPENDORF AG, HAMBURG
SANDRINE HAMELS, BLANDINE VANBELLINGHEN, EPPENDORF APPLICATION TECHNOLOGIES, S.A., NAMUR, BELGIEN
Optimierung der Bakterienkultur und Plasmidaufreinigung 1– 2
Zusammenfassung
Die Plasmidaufreinigung aus Bakterienkulturen stellt ein
weitverbreitetes Protokoll in Laboren der Molekularbiologie
und der Life Sciences dar. Für mittelgroße Ansätze werden
Gefäßes), und häufig dienen sie daher nicht der optimalen
Produktivität einer Bakterienkultur und somit der maximalen
DNA-Ausbeute – insbesondere bei low-copy Plasmiden.
Diese Nachteile werden speziell durch die Eppendorf Conical
mit Hilfe von Eppendorf Conical Tubes 25 mL
meist 15 mL konische Gefäße mit Schraubdeckelverschluss Tubes 25 mL mit Schnappdeckel (SnapTec®) in Angriff genom-
eingesetzt; diese ziehen jedoch häufig Nachteile in der Hand- men. Sie bieten eine deutlich verbesserte Einhandbedienung,
habung nach sich und erzielen weder eine optimale Produkti- bei gleichbleibender Sicherheit für Applikationen im mittleren
vität der Bakterienkultur noch eine maximale DNA-Ausbeute. Volumenbereich zwischen 15 mL und 50 mL.
SANDRINE HAMELS & ERIC GANCAREK, MARC-MANUEL HAHN
Eppendorf Conical Tubes 25 mL mit Schnappdeckel nehmen
Im Rahmen dieser Anwendung wurden sowohl die Bakterien-
sich dieser Hindernisse an. In der vorliegenden Application
kultur als auch die nachfolgende Aufreinigung von low-copy
Note zeigen wir, dass die Produktivität der Bakterienkultur
Plasmid-DNA durch standardmäßige alkalische Lyse mit Hilfe
sowie die DNA-Ausbeute beim Einsatz von 25-mL-Gefäßen im
von entweder Eppendorf Conical Tubes 25 mL oder regulären
Einfache Automatisierung der Erstellung metagenomischer
Vergleich wesentlich höher ausfielen als mit standardmäßigen
3–4
15 mL konischen Gefäßen miteinander verglichen. Der Ein-
15 mL konischen Gefäßen, und dass gleichzeitig sowohl die
satz von 25-mL-Gefäßen erzielte eine erhöhte Produktivität
Handhabung als auch die Durchführung des Workflows deut-
der Bakterienkultur sowie eine erhöhte Ausbeute an Plasmid-
lich verbessert werden konnten.
DNA, bei gleichzeitiger Verbesserung der Handhabung sowie
Einleitung des gesamten Workflows.
Die Bakterienkultur und die nachfolgende Plasmidaufreinigung
gehören zweifelsohne zu den am häufigsten durchgeführten
Protokollen in Laboren der Molekularbiologie und der Life
Sciences. Trotz zunehmender Verfügbarkeit und Erschwing-
Material und Methoden
Bakterienkultur
Escherichia coli Bakterien (DH5α, Invitrogen™), transformiert
Bibliotheken mit der epMotion® 5073m NGS
lichkeit von Plasmidaufreinigungs-Kits verschiedener Anbieter mit low-copy Plasmid-DNA (pBR322™, Invitrogen), wurden in
ist die Standardmethode der alkalischen Lyse [1] nach wie vor dreifacher Ausführung über einen Zeitraum von 16 Stunden in
weit verbreitet und im akademischen Sektor fest etabliert. Diese LB-Medium mit Ampizillin kultiviert (37 °C, 250 Upm, Innova®
Methode ist kostengünstig und skalierbar, und sie erzielt typi- S44i Schüttler, Eppendorf). Das Zellwachstum wurde durch
AURÉLIE TACHENY, WIÂME BEN EL MOSTAPHA, FRANÇOISE DE LONGUEVILLE, NADINE MELLIES
scherweise hohe Ausbeuten an reiner Plasmid-DNA, welche Messung der optischen Dichte bei 600 nm (OD600) mit Hilfe
sodann direkt in zahlreichen nachfolgenden Anwendungen, wie eines Eppendorf BioSpectrometer ® bestimmt, und eine
z.B. Restriktionsverdau, Klonierungen oder Sequenzierungen, Schätzung der Anzahl an E. coli Bakterien wurde durch die
eingesetzt werden kann. folgende Umrechnungsformel vorgenommen:
Robuste Expansion von humanen mesenchymalen Stammzellen mit der 5–6
Für mittelgroße Ansätze werden in der Regel 15 mL konische
Gefäße mit Schraubdeckel eingesetzt. Diese bieten einen OD600 of 1,0 ≈ 5 x 108 Zellen/mL
dichten Deckelabschluss und gute Zentrifugationsstabilität;
allerdings sind sie ebenfalls mit Nachteilen bei der Handhabung Extraktion von low-copy Plasmid-DNA
behaftet (der Umgang mit dem Schraubdeckel, Kreuzkonta-
synthetischen CCCadvanced® FN1 motifs Wachstumsoberfläche
Die Extraktion von Plasmid-DNA erfolgte mit Hilfe eines stan-
mination, schwierige Erreichbarkeit der Probe am Boden des
dardmäßigen alkalischen Lyse-Protokolls: 7,5 mL der Bakterien-
kultur wurden bei 10.000 x g zentrifugiert (5 min, Raumtem-
peratur), und die Pellets wurden in 1,5 mL Lösung 1 (50 mM
Glucose; 10 mM EDTA; 25 mM Tris pH 8,0; 100 µg/mL RNase A)
aufgenommen. Nach 5 min Inkubationszeit wurden 3 mL der
Lösung 2 (0,2 NaOH; 1 % SDS) hinzugegeben, gefolgt von einer
weiteren Inkubation (10 min, Eis). Sodann wurden 2,25 mL der
Lösung 3 (3M KOAc, pH 5,4) hinzugefügt. Die Proben wurden
durchmischt und bei 17.000 x g (30 min, 4 °C) zentrifugiert.
Die Überstände wurden in frische Gefäße überführt, mit einem
Volumen Isopropanol gefällt, durchmischt und sodann erneut
bei 17.000 x g (30 min, 4 °C) zentrifugiert. Die Pellets wurden
HIDENORI MATSUI
7– 8
gewaschen und in 200 μL TE Puffer resuspendiert.
Für die 15 mL Bakterienkultur wurden die Puffer zur alkalischen
Lyse um den Faktor 2 hochskaliert. Die Zentrifugation wurde
in der Eppendorf Centrifuge 5810 R mit dem Rotor FA-45-6-30
und entsprechenden Gefäßadaptern durchgeführt.
Optimierung einer „Long-range“ PCR mit dem Mastercycler® X50
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von Eppendorf
4 IM BLICKPUNKT · EPPENDORF CONICAL TUBES 25 ML: THE NEXT LEVEL
BRIGITTE KLOSE & BERRIT HOFF, EPPENDORF AG
Eppendorf Conical Tubes 25 mL:
The Next Level
Speziell für Probenvolumina größer als 15 mL, aber deutlich kleiner als 50 mL hat Eppendorf ein Conical Tube im
Format 25 mL entwickelt. Es schließt die Lücke zwischen den herkömmlichen konischen Gefäßen mit 15 mL und
50 mL Volumen. Dieser innovative Gefäßtyp ist wahlweise mit Schraubdeckel oder dem patentierten SnapTec®-
Schnappdeckel erhältlich. Ein komplettes Zubehörsystem ermöglicht die Verwendung des 25-mL-Gefäßes in ver-
schiedenen Workflowschritten.
deckel oder als Schraubdeckelvariante.
Wie alle anderen Eppendorf Tubes® wer-
den die 25-mL-Gefäße aus hochwertigen
Rohstoffen ohne Einsatz von Gleitmitteln,
Weichmachern oder Bioziden hergestellt.
> >
*Geschützt durch Europäische Patente EP 2 965 816 A1,
EP 2 654 958 A1
Spart Platz und schont Ressourcen
Das 25-mL-Gefäßformat hat den gleichen
Durchmesser wie herkömmliche 50 mL
Conical Tubes, allerdings mit einer ca.
20 % geringeren Höhe. Dies spart nicht
nur Platz bei der Lagerung; dank der
geringeren Höhe ist der Verbrauch von
wertvollen Rohstoffen bei der SnapTec-
Schnappdeckelvariante um 20 % und bei
dem Gefäß mit Schraubdeckel sogar um
26 % geringer als bei herkömmlichen
Das neue 25-mL-Format (Mitte) schließt die Lücke zwischen den herkömmlichen konischen Gefäßen mit 15 mL und 50 mL
50 mL Conical Tubes – eine sichtbare
Volumen. Vermeidung von Laborabfall und Scho-
nung von Ressourcen.
Auf den Gebieten der Bakterien- und Eine nicht ganz unberechtigte Frage
Mikroorganismenkultur, für die Aufreini- Verbesserte Probenverarbeitung
„Warum gibt es eigentlich kein konisches
gung von Plasmiden/Biomolekülen, in
Gefäß mit einem Volumen zwischen 15 mL Die zuvor erwähnte weite Öffnung bei ge-
der Zellkultur oder bei der Aufbereitung
und 50 mL ?“, lautete daher eine häufig ringerer Höhe erleichtert den Zugang zur
von Assays wird oft mit Probenvolumina
gestellte Frage im Laboralltag, der wir im Probe sowie die Probenrückgewinnung.
zwischen 15 mL und 25 mL gearbeitet.
Gespräch mit Anwendern immer wieder Besonders beim Arbeiten mit Pipetten und
Mangels Alternative greifen Anwender in begegneten. Der Beantwortung dieser Spitzen kleinerer Volumina ist das Risiko
diesem Fall auf traditionelle 50-mL-Gefäße Frage haben sich die Eppendorf-Entwick- einer Kreuzkontamination zwischen Pi-
zurück, in dem Wissen, dass d iese eigent- ler nur zu gerne angenommen. pette und Gefäß durch das Berühren der
lich viel zu groß sind. Hierdurch wird – inneren Gefäßwand minimiert.
Unsere Lösung
ärgerlicherweise – nicht nur kostbarer
Schraub- oder Schnappdeckel?
Gefäßrohstoff verschwendet, sondern es Speziell für Probenvolumina größer als
entsteht auch unnötiger Kunststoffabfall. 15 mL, aber deutlich kleiner als 50 mL Der Schraubdeckel ist geriffelt und da-
Ganz zu schweigen von dem Lagerplatz, hat Eppendorf das Conical Tube 25 mL durch sicher und ergonomisch in der
den Gefäße dieser Größenordnung bei entwickelt. Dieses ist erhältlich mit dem Handhabung. Darüber hinaus ist er seit-
Aufbewahrung im Freezer einnehmen. neuen patentierten SnapTec*- Schnapp- lich abgeflacht, d.h. er rollt nicht weg und
EPPENDORF CONICAL TUBES 25 ML: THE NEXT LEVEL · IM BLICKPUNKT 5
Ob sich mit dem 25-mL-Gefäßformat
Verbesserungen erzielen lassen, haben
die Eppendorf-Applikationsspezialisten
untersucht. In einer Low-Copy Plasmid-
DNA-Extraktion konnten sie nachweisen,
dass die Verwendung von 25-mL-Gefäßen
mit SnapTec-Schnappdeckel zu erheblich
höherer Produktivität der Bakterienkultur
und daraus resultierender DNA-Ausbeute
führte als in herkömmlichen 15 mL Conical
Tubes mit Schraubdeckel. Mehr dazu auf
den Seiten 1 – 2 der Application Notes im
Innenteil.
Konsequenter Systemgedanke
Bei aller Liebe zum kleinsten technischen
Detail ist es uns ein Anliegen, dass sich
jedes unserer Gefäße reibungslos in be-
stehende Laborabläufe einfügt. So ermög-
licht ein komplettes Zubehörsystem für
Zentrifugation, Heizen, Mischen, Auto-
mation, Probenvorbereitung und Lage-
rung den sofortigen Einsatz des 25-mL-
Gefäßes.
> Fazit >
Das neue Mitglied der großen Eppendorf
Tubes-Familie schließt die Lücke zwischen
den herkömmlichen konischen Gefäßen
mit 15 mL und 50 mL Volumen. Ein kom-
plettes Zubehörsystem ermöglicht die
Verbesserter Probenzugang, verbesserte Probenwiedergewinnung
Verwendung des 25-mL-Gefäßes in ver-
schiedenen Workflowschritten.
kann aufrecht auf dem Labortisch gelagert Der patentierte SnapTec-Deckel des 25-mL-
Die besonderen Stärken des Eppendorf
werden. Das Kontaminationsrisiko wird Gefäßes ist eine Besonderheit bei koni-
Conical Tube 25 mL
so minimiert. Diesem intelligenten Deckel- schen Gefäßen. Der Deckel ist fest mit
design vertrauen bereits die Anwender dem Gefäß verbunden und kommt somit >> Einhändige Bedienung
der Eppendorf Conical Tubes 15 mL und nicht mit dem Labortisch in Berührung. (SnapTec-Schnappdeckel)
50 mL. Das Risiko einer Kreuzkontamination wird
>> Reduziertes Kontaminationsrisiko
reduziert und die Verwechslung mit an-
deren Deckeln ausgeschlossen. >> Verbesserter Probenzugang, verbes-
serte Probenwiedergewinnung
Der SnapTec-Deckel ermöglicht einhän
diges Öffnen und Schließen für eine >> 30 % Platzeinsparung bei Lagerung
schnelle Flüssigkeitsentnahme oder
haben wir in einem kurzen Video an-
Probenzugabe. Insbesondere in mehr-
schaulich visualisiert. Einfach QR-Code
stufigen Labor-Protokollen spart dies
scannen oder bit.ly/2LhxTKd eingeben.
Zeit und damit auch Kosten. Das 25-mL-
Gefäß mit SnapTec-Deckel ist darüber
hinaus autoklavierbar.
SnapTec: Auf Herz und Nieren geprüft
Die Plasmidaufreinigung aus Bakterien-
kulturen gehört zu den Standardmethoden
in Life Science-Laboren. Für die Medien- Weitere Informationen finden Sie auf der
aufbereitung kommen üblicherweise Landingpage www.eppendorf.com/25mL,
15 mL Conical Tubes mit Schraubdeckel wo Sie auch ein kostenloses Muster be-
SnapTec-Deckel ermöglicht einhändiges Öffnen und Schließen zum Einsatz. stellen können.
6 INNOVATION · YOUR SAMPLE GOES DIGITAL
ANN-CLAIRE FOETSCH & JAN-HENDRIK BEBERMEIER, EPPENDORF AG
Your Sample Goes Digital
Haben Sie jemals den Wert der in Ihrem Ultratiefkühlgerät gelagerten Proben überschlagen? Ausgehend von
einem Durchschnittswert von 10 EUR pro Gefäß, kommt man leicht auf 500.000 EUR. In anderen Worten: Ihr
Freezer ist eine wahre Schatztruhe! Wenn Sie Ihre Schätze sicher lagern, einfach identifizieren und problemlos
erreichen möchten, wird Ihnen eine sorgfältige Probenkennzeichnung das Leben leichter machen.
Keine Lust, alle 20 Gefäße zu beschrif- lässiges Beschriften von Proben ein müh- vereinfacht. Die RackScan Geräte arbeiten
ten? Alles mit der Hand abzutippen, wo sames Unterfangen ist. perfekt in Kombination mit den digitalen
Sie doch so viel anderes auf dem Zettel Labor-Lösungen von Eppendorf – der
Smarte Beschriftungen Ihrer wertvollen
haben? Von 1 bis 20 zu beschriften käme eLABInventory und der eLABJournal®
Proben sind jedoch für die sichere Identi-
natürlich auch in Frage. Aber es muss Software.
> doch auch einfacher gehen! Falls Ihnen
fikation und letztendlich für zuverlässige >
Ergebnisse unerlässlich. Mit einfacher
diese Gedanken bekannt vorkommen,
Schrift bedruckte Etiketten auf Gefäßen
hat Eppendorf die Lösung: Eppendorf
stellen die Mindestvoraussetzung für ein-
Digital Lab Solutions.
deutige Lesbarkeit dar. Barcodes gehen
Genervt von unleserlicher einen Schritt weiter in die Richtung der
Probenkennzeichnung? schnellen und sicheren Probenidentifika-
tion.
Eine klare und eindeutige Probenbeschrif-
tung wird empfohlen, um das Lesen so Ab 2020 sind unleserliche Proben ein
einfach wie möglich zu gestalten. Darüber Problem der Vergangenheit. Eppendorf
mag man sich in allen Laboren einig sein, bietet Ihnen serienmäßig vorbeschriftete
doch im wahren Leben findet man häufig Verbrauchsartikel zum sofortigen Einsatz
Gefäße im Freezer, die entweder über- an. Ihre Proben werden durch ein lang-
haupt nicht gekennzeichnet sind oder fristig beständiges Etikett zur sicheren
deren Beschriftung unleserlich ist. Einer Probenidentifikation digitalisiert.
der Hauptgründe liegt darin, dass zuver-
Sie haben mehrere Proben?
Fühlen Sie sich verloren zwischen
Der erste Schritt ist gemacht. Ihre Proben Proben und Prozessen?
sind schnell und gut lesbar beschriftet.
Kombinieren Sie jetzt die akkurate Bar-
Nun gilt es die nächste Hürde zu überwin-
code-Beschriftung Ihrer Proben mit den
den: die Lagerung. Hierbei ist es notwen-
Datensätzen Ihrer Schätze in Ihrem Ge-
dig, die Proben sowohl sicher als auch
friergerät. Mit Hilfe der eLABInventory
zugänglich zu verwahren. Ihre Kollegen
Software können Sie Ihre Proben auf
müssen in der Lage sein, die gewünsch-
einfache Weise verwalten. Die Software
ten Proben zu finden.
erkennt freie Plätze in Ihrem Freezer, und
Nehmen Sie ein Rack, beladen Sie es mit das Einlesen der Barcodes ermöglicht
Ihren vorbeschrifteten Probengefäßen eine problemlose Probenidentifikation.
und scannen Sie alle Ihre Proben gleich- Keine Probe wird verlorengehen. Ihre
zeitig. Das RackScan Gerät für Datamatrix- Kollegen werden es Ihnen danken. Darüber
kodierte Proben ist ein komfortables, hinaus dokumentiert eLABJournal alle
einfaches Plug-in-System, welches das Arbeitsschritte im Labor. Was kann jetzt
Lesen von mehr als einer Probe deutlich noch passieren?
YOUR SAMPLE GOES DIGITAL · INNOVATION 7
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VisioNize® Touch-Interface ausgestattet, Archivierung Ihrer gesammelten Daten. Flasche wurde speziell für den Aus-
welches es Ihnen ermöglicht, die Leistung Alle aus eLABInventory bekannten schwingrotor S-4xUniversal entwickelt.
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angeboten. Daten von Barcode-beschrifte- Mehr Informationen auf
ten Gefäßen, wie z.B. den CryoStorage www.eppendorf.com/next-benchmark
Vials mit SafeCode™, können problemlos in
die Software integriert werden. Ergänzen-
de Dokumente können ebenfalls gespei-
chert werden. Mittels externer Etiketten-
drucker können Sie mit eLABInventory
ebenfalls Ihre eigenen maßgeschneider-
ten Barcodes erstellen. Erfassen Sie alle
Informationen über Ihre wertvollen Proben
online – mit Sicherheit.
8 LABORPRAXIS · VORTEILE VON STANDARDISIERUNG IN DER MIKROBIOM-FORSCHUNG
HANAË KÖNIG, EPPENDORF AG
Vorteile von Standardisierung in der
Mikrobiom-Forschung
Die Mikrobiom-Forschung liefert hilfreiche Erkenntnisse zur Diagnose und Behandlung von Krankheiten. Dieses
Forschungsgebiet ist jedoch äußerst komplex und stellt hohe Anforderungen an den Forscher und das Labor.
Dabei spielen die Standardisierung von Prozessen und Methoden sowie die passende Laborausstattung eine
entscheidende Rolle, um die Probenbearbeitung reproduzierbar und verlässlich zu gestalten.
behandlung und kontinuierlich hohe Anders als bei der manuellen Probenbe-
Probenqualität unabdingbar. Neben der arbeitung führen standardisierte, auto-
Probennahme und -lagerung betrifft dies matisierte Methoden zur Aufreinigung
die Extraktionsmethoden, das Verfahren der DNA/RNA und Erstellung der NGS-
und das Gerät zur Erstellung der Next- Bibliothek zu vergleichbaren und quali-
> Generation Sequencing (NGS) Biblio- tativ hochwertigen Ergebnissen. Da die
>
thek, das Verbrauchsmaterial sowie den epMotion auch Inkubationsschritte über-
Thermocycler für die PCR. nimmt, können Anwender sich während-
dessen anderen Aufgaben widmen und
Viele Labore aus Universitäten und In-
somit wertvolle Zeit sparen.
dustrie haben sich in Großprojekten zur
Mikrobiom-Forschung zusammenge- Ein weiterer Erfolgsfaktor ist die verläss-
Die Analyse des Mikrobioms kann Aufschluss über den Ge- schlossen. Umso entscheidender ist es, liche PCR, welche einen qualitativ hoch-
sundheitszustand eines Patienten geben.
dass alle Kollaborationspartner mit den wertigen Thermocycler wie z. B. den
Wir teilen unsere Welt mit Milliarden mi- gleichen Methoden und Geräten arbei- Mastercycler ® X50 erfordert, der die
kroskopisch kleiner Einzeller, den Bakte- ten, um die Daten vergleichen und die notwendige Temperaturstabilität sowie
rien. Sie leben auf uns, in uns und um richtigen Schlüsse ziehen zu können. schnelle Heiz- und Kühlraten bietet. Vor
uns herum – von den Tiefen des Ozeans Probenverlust und Kontamination in der
Um Fehler in der Bearbeitung der Probe
bis hinauf ins Weltall. Die Zusammenset- gesamten Prozesskette schützt grund-
auszuschließen und die Reproduzierbar-
zung der Bakterien, das Mikrobiom, ist sätzlich die Verwendung qualitativ hoch-
keit massiv zu erhöhen, werden langwie-
dabei für jedes Habitat einzigartig, cha- wertiger Verbrauchsartikel.
rige Dosieraufgaben von automatisierten
rakteristisch und essentiell. So kann die
Pipettiersystemen wie z. B. der epMotion® Fazit
Analyse des Mikrobioms Aufschluss über
übernommen.
den Gesundheitszustand eines Patienten Gerade bei groß angelegten Studien und
geben. Sind die Arten und Mengen der internationalen Kooperationen ist eine
Bakterien aus dem Gleichgewicht gera- Investition in Standardisierung enorm
ten, lassen sich durch Förderung „guter“ hilfreich. Diese schützt vor unzureichen-
Bakterien zahlreiche Probleme lösen. den Ergebnissen und ermöglicht ver-
Allerdings sind große Datenmengen er- gleichbare, reproduzierbare Daten, die
forderlich, um Abweichungen zwischen global genutzt werden können.
verschiedenen Mikrobiomen festzustellen
Weitere Informationen auf
und herauszufinden, was gesund ist und
www.eppendorf.com/automation
was nicht.
Erfolgsfaktor Standardisierung
Um die statistische Verwertbarkeit der
Daten zu garantieren, sind standardisier- Automatisierte Pipettiersysteme, wie z.B. die epMotion,
te Abläufe für eine stets gleiche Proben- übernehmen langwierige Pipettieraufgaben.
(BN 52) JANUAR 2020 SEITE 1
Optimierung der Bakterienkultur und Plasmidaufreinigung
mit Hilfe von Eppendorf Conical Tubes 25 mL
RAFAL GRZESKOWIAK, EPPENDORF AG, HAMBURG
SANDRINE HAMELS, BLANDINE VANBELLINGHEN, EPPENDORF APPLICATION TECHNOLOGIES, S.A., NAMUR, BELGIEN
Zusammenfassung Gefäßes), und häufig dienen sie daher nicht der optimalen
Produktivität einer Bakterienkultur und somit der maximalen
Die Plasmidaufreinigung aus Bakterienkulturen stellt ein
DNA-Ausbeute – insbesondere bei low-copy Plasmiden.
weitverbreitetes Protokoll in Laboren der Molekularbiologie
und der Life Sciences dar. Für mittelgroße Ansätze werden Diese Nachteile werden speziell durch die Eppendorf Conical
meist 15 mL konische Gefäße mit Schraubdeckelverschluss Tubes 25 mL mit Schnappdeckel (SnapTec®) in Angriff genom-
eingesetzt; diese ziehen jedoch häufig Nachteile in der Hand- men. Sie bieten eine deutlich verbesserte Einhandbedienung,
habung nach sich und erzielen weder eine optimale Produkti- bei gleichbleibender Sicherheit für Applikationen im mittleren
vität der Bakterienkultur noch eine maximale DNA-Ausbeute. Volumenbereich zwischen 15 mL und 50 mL.
Eppendorf Conical Tubes 25 mL mit Schnappdeckel nehmen
Im Rahmen dieser Anwendung wurden sowohl die Bakterien-
sich dieser Hindernisse an. In der vorliegenden Application
kultur als auch die nachfolgende Aufreinigung von low-copy
Note zeigen wir, dass die Produktivität der Bakterienkultur
Plasmid-DNA durch standardmäßige alkalische Lyse mit Hilfe
sowie die DNA-Ausbeute beim Einsatz von 25-mL-Gefäßen im
von entweder Eppendorf Conical Tubes 25 mL oder regulären
Vergleich wesentlich höher ausfielen als mit standardmäßigen
15 mL konischen Gefäßen miteinander verglichen. Der Ein-
15 mL konischen Gefäßen, und dass gleichzeitig sowohl die
satz von 25-mL-Gefäßen erzielte eine erhöhte Produktivität
Handhabung als auch die Durchführung des Workflows deut-
der Bakterienkultur sowie eine erhöhte Ausbeute an Plasmid-
lich verbessert werden konnten.
DNA, bei gleichzeitiger Verbesserung der Handhabung sowie
Einleitung des gesamten Workflows.
Die Bakterienkultur und die nachfolgende Plasmidaufreinigung Material und Methoden
gehören zweifelsohne zu den am häufigsten durchgeführten
Bakterienkultur
Protokollen in Laboren der Molekularbiologie und der Life
Sciences. Trotz zunehmender Verfügbarkeit und Erschwing- Escherichia coli Bakterien (DH5α, Invitrogen™), transformiert
> lichkeit von Plasmidaufreinigungs-Kits verschiedener Anbieter mit low-copy Plasmid-DNA (pBR322™, Invitrogen), wurden in
>
ist die Standardmethode der alkalischen Lyse [1] nach wie vor dreifacher Ausführung über einen Zeitraum von 16 Stunden in
weit verbreitet und im akademischen Sektor fest etabliert. Diese LB-Medium mit Ampizillin kultiviert (37 °C, 250 Upm, Innova®
Methode ist kostengünstig und skalierbar, und sie erzielt typi- S44i Schüttler, Eppendorf). Das Zellwachstum wurde durch
scherweise hohe Ausbeuten an reiner Plasmid-DNA, welche Messung der optischen Dichte bei 600 nm (OD600) mit Hilfe
sodann direkt in zahlreichen nachfolgenden Anwendungen, wie eines Eppendorf BioSpectrometer ® bestimmt, und eine
z.B. Restriktionsverdau, Klonierungen oder Sequenzierungen, Schätzung der Anzahl an E. coli Bakterien wurde durch die
eingesetzt werden kann. folgende Umrechnungsformel vorgenommen:
Für mittelgroße Ansätze werden in der Regel 15 mL konische
Gefäße mit Schraubdeckel eingesetzt. Diese bieten einen OD600 von 1,0 ≈ 5 x 108 Zellen/mL
dichten Deckelabschluss und gute Zentrifugationsstabilität;
allerdings sind sie ebenfalls mit Nachteilen bei der Handhabung Extraktion von low-copy Plasmid-DNA
behaftet (der Umgang mit dem Schraubdeckel, Kreuzkonta-
Die Extraktion von Plasmid-DNA erfolgte mit Hilfe eines stan-
mination, schwierige Erreichbarkeit der Probe am Boden des
dardmäßigen alkalischen Lyse-Protokolls: 7,5 mL der Bakterien-
kultur wurden bei 10.000 x g zentrifugiert (5 min, Raumtem-
peratur), und die Pellets wurden in 1,5 mL Lösung 1 (50 mM
Glucose; 10 mM EDTA; 25 mM Tris pH 8,0; 100 µg/mL RNase A)
aufgenommen. Nach 5 min Inkubationszeit wurden 3 mL der
Lösung 2 (0,2 NaOH; 1 % SDS) hinzugegeben, gefolgt von einer
weiteren Inkubation (10 min, Eis). Sodann wurden 2,25 mL der
Lösung 3 (3M KOAc, pH 5,4) hinzugefügt. Die Proben wurden
durchmischt und bei 17.000 x g (30 min, 4 °C) zentrifugiert.
Die Überstände wurden in frische Gefäße überführt, mit einem
Volumen Isopropanol gefällt, durchmischt und sodann erneut
bei 17.000 x g (30 min, 4 °C) zentrifugiert. Die Pellets wurden
gewaschen und in 200 μL TE Puffer resuspendiert.
Für die 15 mL Bakterienkultur wurden die Puffer zur alkalischen
Lyse um den Faktor 2 hochskaliert. Die Zentrifugation wurde
in der Eppendorf Centrifuge 5810 R mit dem Rotor FA-45-6-30
und entsprechenden Gefäßadaptern durchgeführt.
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SEITE 2 (BN 52) JANUAR 2020
Optimierung der Bakterienkultur und Plasmidaufreinigung
mit Hilfe von Eppendorf Conical Tubes 25 mL
Gesamtzellzahl E. coli Kulturen Gesamtausbeute an low-copy Plasmid-DNA
1,6 x 1010
800
Plasmid DNA-Ausbeute [µg]
1,2 x 1010
600
E. coli Zellzahl
8 x 109 400
4 x 109 200
0 0
15 mL Kultur 7,5 mL Kultur 7,5 mL Kultur 15 mL Kultur 7,5 mL Kultur 7,5 mL Kultur
25 mL Gefäß 25 mL Gefäß 15 mL Gefäß 25 mL Gefäß 25 mL Gefäß 15 mL Gefäß
Abb. 1: Gesamtzellzahl der E.coli Kulturen, inkubiert in Eppendorf Conical Tubes 25 mL Abb. 2: Gesamtausbeute an low-copy Plasmid-DNA (pBR322), aufgereinigt aus Bakterien
mit Schnappdeckel bzw. standardmäßigen 15 mL konischen Gefäßen kulturen, welche entweder in Eppendorf Conical Tubes 25 mL mit Schnappdeckel oder in
standardmäßigen 15 mL konischen Gefäßen inkubiert worden waren
Die Plasmidausbeute und -qualität wurden durch Absorptions- OD-Quotienten bestätigten die Reinheit der DNA-Aufberei-
messungen bei 260 nm bestimmt (Eppendorf BioSpectrometer). tungen: A260/280 > 1,9 und A260/230 > 2,0.
Ergebnisse und Diskussion Fazit
Der Vergleich von Wachstum und Produktivität der verschie- Die Ergebnisse zeigen, dass sowohl die Produktivität der in
denen Bakterienkulturen ist in Abb. 1 dargestellt. Die Dichte Eppendorf Conical Tubes 25 mL mit Schnappdeckel (SnapTec)
> der Bakterienkultur sowie die Gesamtzellzahlen waren sowohl kultivierten Bakterienkulturen als auch die daraus resultieren- >
für die 7,5 mL als auch die 15 mL Kulturvolumina, welche in den Ausbeuten an Plasmid-DNA sehr viel höher waren (70 %
Eppendorf Conical Tubes 25 mL mit Schnappdeckel inkubiert bis 400 %) als Kulturen aus den standardmäßigen 15 mL koni-
worden waren, höher. Dies weist auf bessere Wachstumsraten schen Gefäßen. Die signifikant erhöhten Wachstumsraten, die
sowie eine bessere Gesamtproduktivität durch effizientere mit den 25-mL-Gefäßen erzielt wurden, waren auf die effizien-
Belüftung und Mischeigenschaften in Eppendorf Conical tere Belüftung sowie Mischeigenschaften der Bakterienkultur
Tubes 25 mL im Vergleich zu regulären 15-mL-Gefäßen hin. zurückzuführen.
Extraktion von low-copy Plasmid-DNA Sowohl die dichte Deckelversiegelung und die sichere Hand-
habung als auch die Zentrifugationsstabilität der Eppendorf
Bakterienkulturen wurden direkt zur Extraktion von low-copy
Conical Tubes 25 mL standen den 15 mL konischen Gefäßen
Plasmid-DNA (pBR322, Invitrogen) mit Hilfe eines standard-
mit Schraubdeckel in nichts nach. Gleichzeitig wird die Hand-
mäßigen alkalischen Lyseprotokolls eingesetzt. Insbesondere
habung von Ansätzen im mittleren Volumenbereich zwischen
ist hervorzuheben, dass im Rahmen dieser Methode mehr
15 mL und 50 mL deutlich optimiert.
fache Hochgeschwindigkeits-Zentrifugationsschritte (bis zu
17,000 x g) sowie Misch- und Phasengewinnungsschritte Nicht zuletzt ermöglichten Eppendorf Conical Tubes 25 mL
stattfinden. Die dichte Versiegelung des Deckels und die damit einen verbesserten Zugang zur Probe, was das Risiko einer
einhergehende Sicherheit der Eppendorf Conical Tubes 25 mL Kreuzkontamination während der Aufreinigung reduzierte.
waren mit den regulären 15 mL konischen Gefäßen mit Dies bietet weitere Vorteile bei der Durchführung zahlreicher
Schraubdeckel vergleichbar. Protokolle in der Molekularbiologie und den Life Sciences.
Kreuzkontaminationen sind bei der parallelen Bearbeitung Literatur
mehrerer Schraubdeckelgefäße nicht auszuschließen; die [1] Birnboim, HC. A rapid alkaline extraction method for the isolation of
Schnappdeckel ermöglichten ein drastisch reduziertes Kon- plasmid DNA. Methods Enzymol. 1983; 100: 243–255.
taminationsrisiko bei gleichzeitig schnellerer Handhabung.
Wie in Abb. 2 gezeigt, waren die mittels Eppendorf Conical
Tubes 25 mL erzielten Ausbeuten an Plasmid-DNA deutlich
höher als jene, die mit regulären 15 mL konischen Gefäßen
gewonnen worden waren. Für die 7,5 mL und 15 mL Bakteri-
enkultur-Volumina konnten 70 % bzw. 400 % höhere Ausbeu-
ten verzeichnet werden, was auf eine hohe Kulturdichte und
verbesserte Wachstumsparameter schließen lässt, wodurch
eine erhöhte Produktion von Plasmid-DNA ermöglicht wurde.
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Einfache Automatisierung der Erstellung metagenomischer
Bibliotheken mit der epMotion® 5073m NGS
SANDRINE HAMELS & ERIC GANCAREK, EPPENDORF APPLICATION TECHNOLOGIES, S.A., NAMUR, BELGIEN
MARC-MANUEL HAHN, EPPENDORF AG, HAMBURG
Zusammenfassung Reagenzien und Verzögerungen bei der Sequenzierung. Sie
reduziert ebenfalls die Variabilität zwischen verschiedenen
Metagenomische Studien sind in der Lage, die genetische
Anwendern sowie Fehler bei der Probennachverfolgung. Diese
Zusammensetzung von mikrobiologischen Proben zu ermit-
Application Note beschreibt die automatisierte Bearbeitung
teln. Diese Studien beruhen in der Regel auf sog. Marker-
mikrobieller DNA-Proben auf der epMotion (Eppendorf) zu
Genen, wie z.B. der 16S rDNA, zur phylogenetischen Klassifi-
sequenzfertigen Bibliotheken.
kation. Welches spezifische Marker-Gen und welche DNA-
Region untersucht und wie tief diese sequenziert werden, Experimenteller Versuchsaufbau
hängt von der Zielsetzung der Studie ab. Das grundlegende
Die Bibliotheken wurden mit Hilfe einer automatisierten Ver-
Prinzip der Bibliothekserstellung ist jedoch allen experimen-
sion eines Illumina® Protokolls erstellt [2]. Das automatisierte
tellen Ansätzen gemein. Zur fehlerfreien Analyse der Proben
Protokoll ist in zwei Submethoden unterteilt (Abb. 1), die jeweils
ist ein robuster Workflow unerlässlich. In dieser Application
an einem sicheren Endpunkt gestoppt werden. Sämtliche
Note stellen wir einen Workflow vor, der an spezifische Kun-
Amplifikationen wurden auf einem Mastercycler ® X50 von
denbedürfnisse angepasst werden kann.
Eppendorf durchgeführt. Zu Beginn des Experiments wurden
Einleitung 12,5 ng genomischer Escherichia coli MG1655 DNA (ATCC®
700926D5™) eingesetzt. Pro Lauf wurden 24 Proben vorberei-
Wissenschaftliche Fragestellungen rund um das Mikrobiom, wie
tet. Für jede Bibliothek wurde eine Qualitätskontrolle (Größen-
z. B. Fallkontroll- oder Longitudinalstudien, brauchen bewährte
verteilung und Quantifizierung) mit Hilfe eines Agilent ® 2100
Praktiken und standardisierte und reproduzierbare Labor-
Bioanalyzer ® DNA 1000 Kits durchgeführt. Im zweiten Teil
Workflows, um hunderte, manchmal tausende von Proben zur
des Experiments wurde eine Mock Community aus 20 Strain
Identifikation zu bearbeiten und vergleichbare Resultate zu
Staggered Mix Genomic Material (ATCC MSA1003™) verwen-
generieren [1]. Eine Automatisierung der Bibliothekserstellung
det, um 16 auf der epMotion erstellte und 8 manuell herge-
minimiert den Verlust von Proben, die Verschwendung von
stellte Bibliotheken miteinander zu vergleichen.
> >
Um eine Anzahl von 24 Proben für den automatisierten Lauf zu
Laufzeit: vervollständigen, schlossen wir zur Kontrolle 4 E. coli Proben
PCR-Ansatz 3 h 35 min sowie 4 Proben ohne DNA (sog. Non-Template-Control [NTC])
Spitzenverbrauch:
ein. Da die Kontrollen gute Ergebnisse zeigten, wurden die
PCR off-deck 300 µL-Spitzen: 272 gepoolten Bibliotheken auf einem Illumina MiSeq® System im
50 µL-Spitzen: 39 paired-end Modus (2 x 150 bp) sequenziert. Die Daten wurden
mit Hilfe der Illumina BaseSpace® 16S Metagenomics App
Submethode 1
PCR-Reinigung 1 ausgewertet.
Ergebnisse und Diskussion
Index PCR-Ansatz Etablierung einer 16S rDNA-Methode mit Hilfe genomischer
DNA aus E. coli
PCR off-deck Wir planten zunächst, die Funktionalität unseres Ansatzes
durch Amplifikation der V3-V4 Region der 16S rDNA aus
E. coli zu veranschaulichen. Wir untersuchten die Variabilität
PCR-Reinigung 2 und die Ausbeute von 24 verschiedenen Replikaten derselben
Input-DNA. Die Resultate pro Probe waren ähnlich, mit einer
mittleren Amplifikatgröße von 657 bp (CV 0,5 %) und einer
QK und Quantifizierung mittleren Ausbeute von 218 nM (CV 10,9 %). Es waren keine
Laufzeit: Primer Dimer zu verzeichnen, was auf effiziente PCR-Ansätze
Submethode 2
15 min sowie Bead-Aufreinigungen schließen ließ.
Normalisierung
Spitzenverbrauch: Ein Faktor mit potenziell negativer Relevanz in metageno
300 µL-Spitzen: 0 mischen Studien ist die Kreuzkontamination. Um dies zu
50 µL-Spitzen: 25
untersuchen, wurde ein Bibliotheks-Präparationslauf mit
abwechselnden Sets von E. coli DNA-Template bzw. Non-
Abb. 1: Dargestellter Workflow des Illumina 16S rDNA Protokolls auf der epMotion. Die Template Controls (NTC) entworfen und ausgeführt. Die nach
grauen Kästen zeigen die zwei auf der epMotion durchgeführten Teilprotokolle. In grün folgende Gelelektrophorese zeigte keinerlei Amplifikation
unterlegte Schritte werden „off-deck“ ausgeführt. PCR-Amplifikationen wurden auf dem
Mastercycler X50 von Eppendorf durchgeführt. Im Einklang mit dem Protokoll werden die innerhalb der NTC-Proben, sondern lediglich einige Primer
Workflows in logische Einheiten unterteilt, die an sicheren Endpunkten gestoppt werden Dimer, welche in den Proben mit DNA jedoch nicht vorkamen
können. Detaillierte Laufzeiten sowie die benötigten Verbrauchsgüter sind neben jeder
Submethode aufgezeigt. (Abb. 2).
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Einfache Automatisierung der Erstellung metagenomischer
Bibliotheken mit der epMotion ® 5073m NGS
rung unterzogen, um zu untersuchen, ob die einzelnen Ge-
E. coli DNA nera innerhalb der künstlichen Gemeinschaft re-identifiziert
E. coli DNA
E. coli DNA
E. coli DNA
werden konnten. Die Anzahl der Reads aus diesem Experi-
ment war mit einem robusten Durchschnittswert von 87,1 %
Leiter
NTC
NTC
NTC
NTC
groß genug, um die Zuordnung zu einem jeden Genus bei den
verschiedenen Proben nicht zu beeinträchtigen. Manuelle
oberer Marker
sowie automatisierte Probenansätze sind nötig, um mögliche
1000 bp
700 bp Unterschiede in der Community zu beurteilen; eine Principal
Coordinate Analysis (PCoA) wurde zum Vergleich der Ansätze
500 bp auf Genus-Niveau durchgeführt (Abb. 3).
400 bp Die PCoA zeigte ein sehr dichtes Clustering der Proben, was
auf eine sehr geringe bis keine Variation zwischen dem manu-
300 bp
ellen und dem automatisierten Verfahren zur Bibliothekser-
stellung schließen ließ. Die dargestellten Ergebnisse qualifi-
200 bp
zieren die automatisierte Methode dahingehend, dass sie
150 bp
Sequenzierbibliotheken von gleicher bzw. besserer Qualität
100 bp erzeugt als die manuelle Methode.
unterer Marker Fazit
Die steigende Nachfrage nach hochqualitativen NGS-Biblio-
theken in Laboren erforderte die Entwicklung von robusten,
Abb. 2: Die automatisierte Bibliothekserstellung mit alternierenden Sets von E. coli DNA automatisierten Methoden zur Herstellung solcher Bibliothe-
und NTC-Kontrollen bestätigt die Abwesenheit einer Kreuzkontamination.
ken. Diese Application Note veranschaulicht die erfolgreiche
Studien zur Reproduzierbarkeit mit Hilfe einer aus 20 Stämmen und reproduzierbare Automation von 16S rDNA Amplikon-
> bestehenden Mock Community Bibliotheken auf der epMotion 5073m NGS solution von >
Eppendorf, und sie bestätigt eine mit manuellen Protokollen
Sodann setzten wir die oben beschriebene Methode ein, um
vergleichbare Leistung.
die Reproduzierbarkeit der metagenomischen Diversität zu
testen. Dazu wurden 16 Replikate einer Mock Community Literatur
aus 20 Stämmen auf der epMotion angesetzt. Zum Vergleich [1] Knight, R. et al. Best practices for analyzing microbiomes. Nature
führten wir das gleiche Experiment manuell in 8 Replikaten Microbiology Review 2018; 16:410-422.
durch. Die daraus resultierenden 24 Proben wurden zusam- [2] Illumina. 16S Metagenomic Sequencing Library Preparation Guide.
men in einem 2 x 150 bp MiSeq-Lauf sequenziert. Mit Hilfe der Part # 15044223 Rev. B
Illumina 16S BaseSpace App wurden die daraus resultierenden Die Langversion dieser Application Note können Sie unter
Dateien einer „operational taxonomic unit“ (OTU)-Klassifizie- www.eppendorf.com/appnote420 herunterladen.
1,00
0,75
0,50
Principal Coordinate 2
0,25
0,00
Abb. 3: Principle Coordinate Analysis
−0,25 (PCoA) der OTU-Klassifikation von
24 Replikaten der Mock Community.
Die Principal Coordinates sind per
−0,50 Probentyp für die 8 manuellen Proben
(orange) bzw. die 16 in der epMotion
Methode 5073m NGS solution erstellten
−0,75 epMotion Proben farblich unterlegt. Dieses
Manuell Streudiagramm zeigt eine PCoA der
normalisierten relativen Häufigkeit aller
Proben. Die PCoA misst Unterschiede
−1,00
in der Verteilung von taxonomischen
−1,00 −0,75 −0,50 −0,25 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00
Klassifikationen zwischen den Proben
Principal Coordinate 1 auf dem Genus-Niveau. Das Genus-
Niveau zeigt ein dichtes taxonomisches
Clustering der Ergebnisse.
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Robuste Expansion von humanen mesenchymalen Stammzellen
mit der synthetischen CCCadvanced® FN1 motifs Wachstumsoberfläche
AURÉLIE TACHENY, WIÂME BEN EL MOSTAPHA, FRANÇOISE DE LONGUEVILLE, EPPENDORF APPLICATION TECHNOLOGIES S.A., NAMUR, BELGIEN
NADINE MELLIES, EPPENDORF AG, HAMBURG
Einleitung Beschichtung auf der Kulturoberfläche Die FN1 motifs Oberfläche unterstützt
notwendig, die die Zelladhäsion unter- das effiziente Wachstum von hMSC-BM
Humane mesenchymale Stammzellen
stützt. Dabei sind die häufig eingesetzten in Kombination mit unterschiedlichen
(hMSCs) haben in den letzten zehn
Beschichtungen biologischen Ursprungs xeno-freien (XF) Kulturmedien (Abb. 1).
Jahren zunehmendes Interesse geweckt.
und naturgemäß komplex und undefi-
Es handelt sich hierbei um multipotente In einem serumhaltigen Kultursystem
niert, was die Reproduzierbarkeit von
Zellen in einer heterogenen Population, adhärieren und proliferieren hMSCs in
Experimenten beeinträchtigen kann.
die aus unterschiedlichen Geweben vergleichbarer Weise auf der FN1 motifs
isoliert werden können [1]. Ihre spezifi- Die FN1 motifs Oberfläche besteht aus und TCT-Oberfläche. Auf beiden Ober-
schen Eigenschaften, wie z.B. ihr mesen- synthetischen, von RGD abgeleiteten flächen zeigen die Zellen ihre typische
chymales Differenzierungspotenzial Motiven, die spezifisch konzipiert wur- fibroblastenähnliche Morphologie.
sowie die Immunmodulation und Sekre- den, um die Zellanheftungsstellen natür-
In einem serumfreien Medium haben
tion von entzündungshemmenden licher Proteine der extrazellulären Matrix,
die hMSCs auf der TCT-Oberfläche
Molekülen, machen sie zu einer vielver- wie z.B. Fibronektin, zu imitieren. Kom-
Schwierigkeiten zu proliferieren, was
sprechenden Stammzellpopulation auf biniert mit synthetischen Kulturmedien
auf die Notwendigkeit einer zusätzlichen
verschiedenen Gebieten der Grundlagen- und Dissoziationslösungen, ist diese
adhäsionsfördernden Beschichtung
bzw. angewandten Forschung [2]. Da Oberfläche eine effektive synthetische
schließen lässt. Im Gegensatz dazu unter-
sie in ihren Ursprungsgeweben in relativ Alternative zu biologischen Beschich-
stützt FN1 motifs die Adhäsion und das
geringer Zellzahl vorliegen, erfordert tungen. Da sie gebrauchsfertig ist, redu-
Wachstum von hMSCs effizient, unab-
es einen robusten in vitro Expansions- ziert sich zudem der Aufwand und damit
hängig von den untersuchten Medien.
prozess, um eine ausreichende Anzahl die Arbeitszeit.
Die Zellen zeigen die für eine xeno-freie
an qualitativ hochwertigen hMSCs zu
Hier zeigen wir, dass die FN1 motifs Kultivierung charakteristische länglich-
erhalten.
Wachstumsoberfläche in Kombination spindelförmige Morphologie [4].
> Für gewöhnlich werden hMSCs in vitro mit verschiedenen xeno-freien Medien
>
Robuste langfristige Expansion von
in serumhaltigem Medium auf einer sowohl für eine erfolgreiche kurzzeitige
hMSC-BM in einem vollständig definierten,
TC-behandelten (TCT) Oberfläche ex- als auch langfristige Expansion von aus
synthetischen Kultursystem
pandiert. Allerdings ist der Gebrauch Knochenmark gewonnenen hMSCs
von aus Tieren gewonnenen Materialien, (hMSC-BM) geeignet ist.* Um zu bestätigen, dass die FN1 motifs
wie z.B. Serum, mit zahlreichen Nach- Oberfläche die langfristige Expansion
Ergebnisse und Diskussion
teilen behaftet [3]. Enthält das Kultur- von hMSC-BM in einem vollständig
system keine Serumproteine, ist für die Effiziente Expansion von hMSC-BM in synthetischen Kultursystem unterstützt,
Kultivierung von hMSCs eine zusätzliche verschiedenen xeno-freien Kulturmedien ohne die Zellqualität zu beeinträchtigen,
Serumhaltiges Medium Xeno-freie Medien
MSCGM StemPro Stemgro hMSC MesenCult-ACF
FN1 motifs Oberfläche
TC-behandelte Oberfläche
Abb. 1: hMSC-BM Morphologie nach kurzer Expansion auf der CCCadvanced FN1 motifs Oberfläche in verschiedenen Kulturmedien
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