RIDASCREEN Salmonella Art. No.: R4201 - Food & Feed ...
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RIDASCREEN® Salmonella
Art. No.: R4201
Enzymimmunoassay für den Nachweis von
Salmonella spp. in Lebens-, Futtermitteln und Umweltproben
Enzyme immunoassay for the detection of
Salmonella spp. in food, feed and environmental samples
Test immuno-enzymatique pour la détection des
Salmonella spp. dans les aliments et produits alimentaires ainsi
que dans les échantillons d’environnement
RBP 31/01 – 06/08
ALTERNATIVE ANALYTICAL METHODS FOR AGRIBUSINESS
http://nf-validation.afnor.org/en
In vitro Test
Lagerung bei 2 - 8 °C
Storage at 2 - 8 °C
Stockage à 2 - 8 °C
Für weitere Fragen stehen Ihnen gerne zur Verfügung:
Please contact for questions and further information:
Zentrale/Switchboard
Tel./Phone: +49 (0) 61 51 - 81 02-0
Auftragsannahme/Order department
Fax: +49 (0) 61 51 - 81 02-20
E-Mail: orders@r-biopharm.de
Marketing & Vertrieb/Marketing & sales
Tel./Phone: +49 (0) 61 51 - 81 02-40
E-Mail : info@r-biopharm.de
RIDA® und RIDASCREEN®
sind eingetragene Marken der R-Biopharm AG
Hersteller: R-Biopharm AG, Darmstadt, Deutschland
R-Biopharm AG ist ISO 9001 zertifiziert.
RIDA® and RIDASCREEN®
are registered trademarks of R-Biopharm AG
Manufacturer: R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany
R-Biopharm AG is ISO 9001 certified.
2 RIDASCREEN® Salmonella 16-06-27Kurzinformation
RIDASCREEN® Salmonella (Art. Nr.: R4201) ist ein Sandwich-Enzymimmunoas-
say zum Nachweis von Salmonella spp. in Lebens-, Futtermitteln und
Umweltproben innerhalb von 23 Stunden.
Alle Reagenzien für die Durchführung des Enzymimmunoassays sind im Testkit
enthalten.
Ein Kit ist ausreichend für 96 Bestimmungen.
Probenvorbereitung: Homogenisieren und Anreichern
Zeitbedarf: Probenanreicherung ......................................... 16 - 20 h
Testdurchführung (ELISA) ................................ 6,5 - 7 h
Testdurchführung gesamt ............................. 22,5 - 27 h
(inklusive Anreicherung)
Nachweisgrenze: 1 KbE Salmonella aus 25 g Probe, entsprechend
mindestens 104 Salmonellen/ml nach Anreicherung.
Validierung: Zertifizierte Methode durch AFNOR CERTIFICATION
nach NF EN ISO 16140 (2003) für den Nachweis von
Salmonella spp. (beweglicher und unbeweglicher
Salmonellen einschließlich S. Pullorum und
S. Gallinarum) aus Lebens-, Futtermitteln und
Umweltproben (ausgenommen Proben aus der
Viehzucht).
Zertifikat: RIDASCREEN® Salmonella RBP 31/01-06/08 (gültig
bis 30.06.2020)
Die Spezifität des RIDASCREEN® Salmonella Tests wurde durch die Bestimmung
der Kreuzreaktivität zu den entsprechenden Nicht-Zielorganismen aus
Reinkulturen ermittelt. In Proben kann die Spezifität aufgrund der natürlichen
bakteriellen Begleitflora von der aus Reinkulturen ermittelten abweichen. Bei der
Analyse von Proben mit natürlicher Begleitflora muss daher auf die Einhaltung der
Vorschriften zur selektiven Probenvoranreicherung geachtet werden. Der Test
kann nicht zwischen Zielorganismen und kreuzreaktiven Nicht-Zielorganismen
diskriminieren.
RIDASCREEN® Salmonella 16-06-27 3Zur Erhöhung der Prüfungsqualität bei ELISA-Verfahren verweisen wir zusätzlich auf unser ELISA-Handbuch in der jeweiligen Fassung. Dieses führt Mindeststandards hinsichtlich der Rahmenbedingungen auf, die bei der Verwendung von Testsystemen der R-Biopharm AG und der Durchführung von ELISA-Analysen mit diesen Testsystemen zu beachten sind. Das Handbuch kann unter der R-Biopharm-Webseite www.r-biopharm.com/de/produkte/lebensmittel- futtermittelanalytik abgerufen, gedruckt und gespeichert werden. 1. Verwendungszweck RIDASCREEN® Salmonella (Art. Nr.: R4201) ist ein Sandwich-Enzymimmunoas- say für den Schnellnachweis von Salmonellen aus Anreicherungskulturen von Lebens- und Futtermitteln sowie Umweltproben. Der Nachweis erfolgt aus der Probe nach Anreicherung (gemäß ISO, FDA, USDA, FSIS, BAM). Das Screening- Ergebnis (positiv/negativ) liegt nach 23 Stunden vor. 2. Allgemeines Salmonellosen sind gegenwärtig die bedeutendsten und häufigsten durch Lebensmittel übertragenen Infektionskrankheiten beim Menschen. Sie sind weltweit verbreitet, wobei in europäischen Ländern Enteritis-Salmonellosen am häufigsten vorkommen. Mit dem RIDASCREEN® Salmonella Test ist eine schnellere Bestätigung der Unbedenklichkeit einer Produktionscharge möglich als mit anderen Methoden. 3. Testprinzip RIDASCREEN® Salmonella ist ein zuverlässiger und flexibler Test zum Nachweis sowohl beweglicher als auch unbeweglicher Salmonellen (inkl. S. Pullorum und S. Gallinarum) aus einer Über-Nacht-Anreicherung. Der Test arbeitet mit einer einfachen Ein-Schritt-Anreicherung zur Revitalisierung und Vermehrung sub-letal geschädigter Salmonellen. An die Oberfläche einer Mikrotiterplatte gebundene spezifische, gereinigte Antikörper binden selektiv in der Probe vorhandene Salmonellen. Nach einem Waschschritt werden die so immobilisierten Salmonellen nach Zugabe eines geeigneten Mediums (im Testkit enthalten) vermehrt. Der Sandwich-Test wird durch Zugabe von enzymmarkierten Salmonellen-spezifischen Antikörpern (Konjugat) weitergeführt. Nach Zugabe von Substrat/Chromogen setzt das gebundene Enzymkonjugat das rötlich gefärbte Chromogen zu blauem Endprodukt um. Das Ergebnis kann visuell abgelesen oder durch Messung der Extinktion im Mikrotiterplatten-Photometer gemessen werden. 4 RIDASCREEN® Salmonella 16-06-27
Die Zugabe der Stopp-Lösung führt zu einem Farbumschlag von blau nach gelb.
Bleibt die Farbreaktion aus, so weist das darauf hin, dass in der
Anreicherungsbouillon keine Salmonellen vorhanden waren und die Originalprobe
somit ebenfalls keine Salmonellen enthielt. Alle Reagenzien sind unterschiedlich
gefärbt, damit die einzelnen Pipettierschritte optisch besser nachvollzogen werden
können.
4. Packungsinhalt
Jeder Testkit enthält alle Reagenzien für 96 Tests:
Komponente Deckelfarbe Zustand Inhalt
Microtiter plate
- gebrauchsfertig 96 Kavitäten
Mikrotiterplatte
Positive control
rot gebrauchsfertig rot gefärbt 2 ml
Positivkontrolle
Negative control
weiß gebrauchsfertig blau gefärbt 2 ml
Negativkontrolle
2 x Wash buffer salt Salz zum
-
Waschpuffersalz Auflösen
Salmonella broth Pulver zum
weiß 3,6 g
Salmonella Bouillon Auflösen
Conjugate
rot gebrauchsfertig grün gefärbt 10 ml
Konjugat
Substrate/Chromogen
Substrate/Chromogen braun gebrauchsfertig rot gefärbt 13 ml
Red Chromogen Pro
Stop Solution
gelb gebrauchsfertig 14 ml
Stopp-Lösung
4 x Coverfilm
- gebrauchsfertig
Abdeckfolie
5. Zusätzlich benötigte Reagenzien - erforderliches Zubehör
5.1. Geräte:
Laborwaage
Stomacher oder Äquivalent (zum Homogenisieren der Probe)
Stomacher-Beutel oder Äquivalent (optional mit Filtereinsatz)
100 µl und 250 µl Mikropipetten
Saubere Einmal-Pipettenspitzen
Inkubator 36 ± 1 °C (37 ± 1 °C im Rahmen der NF VALIDATION)
Optional: Multikanalpipette oder Mikrotiterplatten-Washer
Optional: Mikrotiterplatten-Photometer mit 450 ± 10 nm/620 ± 10 nm Filtern
Optional: Mikrotiterplatte für Transfer der Salmonella-Bouillon
Optional: Tupfer
RIDASCREEN® Salmonella 16-06-27 55.2. Reagenzien:
Salmonella-Anreicherungsmedium: gepuffertes Peptonwasser (BPW)
Destilliertes Wasser (optional steriles Wasser)
6. Vorsichtsmaßnahmen
Für die Durchführung des RIDASCREEN® Salmonella Tests empfiehlt sich die
Einhaltung der allgemeingültigen Richtlinien der „guten Laborpraxis“ (beschrieben
im Standard EN ISO 7218). Alle Proben müssen als potentiell infektiös behandelt
werden.
Alle verwendeten Reagenzien, Waschlösungen und Materialien, die mit potentiell
infektiösen Proben in Berührung kommen, müssen mit geeigneten
Desinfektionsmitteln behandelt oder mindestens 15 min bei 121 °C autoklaviert
werden.
Dieser Kit kann gesundheitsgefährdende Substanzen enthalten. Sicherheits-
hinweise zu den enthaltenen Komponenten entnehmen Sie bitte den
Sicherheitsdatenblättern (MSDS) zu diesem Produkt auf unserer Internetseite
www.r-biopharm.de.
7. Reagenzien und ihre Lagerung
Die Reagenzien bei 2 - 8 °C lagern. Komponenten des Testkits auf keinen Fall
einfrieren!
Nicht benötigte Mikrotiterstreifen zusammen mit dem Trockenmittel im
Folienbeutel gut verschlossen aufbewahren und weiterhin bei 2 - 8 °C lagern.
Das rötlich gefärbte Substrat/Chromogen ist lichtempfindlich, deshalb direkte
Lichteinwirkung vermeiden.
Nach Ablauf des Verfalldatums (siehe Außenetikett unter Expiry) kann keine
Qualitätsgarantie mehr übernommen werden.
Der Test kann bei ordnungsgemäßer Lagerung mindestens bis zum Verfallsdatum
(angegeben auf der Kitpackung) für eine ordnungsgemäße Analyse eingesetzt
werden.
Ein Austausch von Einzelreagenzien zwischen Kits verschiedener Chargennum-
mern ist nicht zulässig.
6 RIDASCREEN® Salmonella 16-06-278. Anzeichen für Reagenzienverfall
Bläuliche Färbung des rötlichen Substrat/Chromogens vor Zugabe in die
Kavitäten
Gemessene Extinktion der Positiv-Kontrolle ist kleiner 1,0 (E450/620 nm < 1,0)
9. Probenvorbereitung
1 Teil Probe in 9 Teile gepuffertes Peptonwasser (z.B.: 25 ml oder g in 225 ml,
entsprechend der NF VALIDATION) einwiegen und homogenisieren, alternativ
Swab oder Transportmedium in gepuffertes Peptonwasser geben.
Die Probe bei 36 ± 1 °C* für 16 - 20 h inkubieren. Entsprechend Standard EN
ISO 7218 kann die Anreicherungsbouillon bis zu 48 h bei 2-8 °C gekühlt
gelagert werden, falls die Durchführung eines Tests zur Bestätigung positiver
Proben direkt im Anschluss an das Screening nicht möglich ist (nicht innerhalb
der NF VALIDATION mitvalidiert).
10. Testdurchführung
10.1. Testvorbereitungen
1. Alle Reagenzien vor Gebrauch auf Raumtemperatur (20 - 25 °C) bringen.
2. Es ist wichtig, alle Anreicherungsmedien vor der Zugabe der Proben auf
Raumtemperatur (20 - 25 °C) vorzuwärmen. Die Proben müssen mittels
Mixer oder Stomacher sorgfältig mit dem Medium gemischt werden.
3. Reagenzien nach Gebrauch sofort wieder bei 2 – 8 °C lagern.
10.2. Salmonella-Bouillon
Zur Herstellung der Salmonella-Bouillon entweder den gesamten Inhalt des
Fläschchens (3,6 g) in 100 ml sterilem, destillierten Wasser auflösen oder eine
geeignete Teilmenge mit einer Toleranz von ± 10% abwiegen und im
entsprechenden Volumen Wasser lösen (z.B.: 1,8 ± 0,18 g für 50 ml).
Anschließend entweder für 10 min im Wasserbad aufkochen (100 °C),
autoklavieren oder sterilfiltrieren. Die Bouillon wird vor Gebrauch auf 36 ± 1 °C*
temperiert. Bei 2 - 8 °C kann sie bis zu einem Monat gelagert werden.
10.3. Waschpuffer
Zur Herstellung des Puffers wird der gesamte Inhalt eines der mitgelieferten
Waschpuffersalz-Briefe in 1 Liter destilliertem Wasser gelöst. Bei eventueller
mikrobiologischer Belastung sollte steriles, destilliertes Wasser verwendet
RIDASCREEN® Salmonella 16-06-27 7werden. Der Puffer wird bei 2 - 8 °C gelagert und vor Verwendung auf 36 ± 1 °C*
erwärmt. Bei 2 - 8 °C kann der Puffer bis zu einem Monat gelagert werden.
10.4. Testdurchführung
1. Plattenvorbereitung: So viele Kavitäten in den Halterahmen einsetzen, wie für
die Kontrollen und alle Proben benötigt werden. Nicht benötigte
Mikrotiterstreifen zurück in den Folienbeutel geben und gut verschließen.
2. Probenzugabe: Jeweils 100 µl der vorbereiteten Probe, der Negativkontrolle
und der Positivkontrolle in die entsprechenden Kavitäten pipettieren. Dabei
jeweils eine neue Pipettenspitze verwenden. Die Positionen der Kontrollen
und Proben protokollieren. Die Platte mit einer der mitgelieferten Abdeckfolien
abdecken und für 30 min bei 36 ± 1 °C* inkubieren.
3. Erster Waschschritt: Die Kavitäten werden entleert und 7-mal mit jeweils
300 µl Waschpuffer gewaschen. Der Vorgang kann manuell
(Multikanalpipette) oder mittels Mikrotiterplatten-Washer mit entsprechender
Programmierung durchgeführt werden. Gründliches Waschen der Kavitäten
ist wichtig und notwendig für eindeutige Resultate.
4. Anreicherung: Je 250 µl Salmonella-Bouillon in jede Kavität pipettieren. Die
Platte abdecken und für 4 h bei 36 ± 1 °C* inkubieren. Entsprechend dem
Protokoll der NF VALIDATION oder generell bei sauren oder
säureproduzierenden Proben (z.B.: Rohmilch) muss die Inkubationszeit 5,5
bis maximal 6 h betragen.
5. Übertragung zur Bestätigung (optional): Die angereicherten Proben können
aufbewahrt werden, wenn die Bestätigung positiver Ergebnisse auf selektiven
Medien gewünscht ist. Dazu direkt nach Ende der Inkubationszeit 100 –
250 µl der Salmonella-Bouillon in eine neue Mikrotiterplatte übertragen und
abdecken. Entsprechend Standard EN ISO 7218 kann die
Anreicherungsbouillon bis zu 48 h bei 2-8 °C gekühlt gelagert werden, falls
die Durchführung eines Tests zur Bestätigung positiver Proben direkt im
Anschluss an das Screening nicht möglich ist (nicht innerhalb der NF
VALIDATION mitvalidiert). Die Kavitäten der ELISA-Platte müssen vollständig
entleert werden.
6. Konjugatzugabe: Je 100 µl Konjugat in die vollständig entleerten Kavitäten
(optional: 3 - 5-mal waschen) pipettieren. Die Platte abdecken und für 30 ± 1
min bei 36 ± 1 °C* inkubieren.
7. Zweiter Waschschritt: Die Kavitäten werden entleert und 7-mal mit jeweils
300 µl Waschpuffer gewaschen.
8 RIDASCREEN® Salmonella 16-06-278. Substratzugabe: Je 100 µl Substrat/Chromogen in die vollständig entleerten
Kavitäten pipettieren und für 15 ± 1 min bei Raumtemperatur (20 - 25 °C) im
Dunkeln inkubieren, anschließend sofort auswerten.
9. Visuelle Auswertung: Ein Farbumschlag von rot nach blau deutet auf das
Vorhandensein von Salmonellen hin. Die Farbentwicklung beginnt meist am
Rand der Kavitäten - leichtes Klopfen an den Rand der Mikrotiterplatte verteilt
die Farbe gleichmäßig.
10. Stoppen der Reaktion: Hierzu jeweils 100 µl Stopp-Lösung in die Kavitäten
pipettieren. Ein Farbumschlag von blau nach gelb deutet auf das
Vorhandensein von Salmonellen hin.
11. Instrumentelle Auswertung: Die Extinktion wird im Mikrotiterplatten-
Photometer bei 450 nm gemessen (Referenzwellenlänge 620 nm).
11. Auswertung
Für die Auswertung ist bei R-Biopharm die speziell für die RIDASCREEN ®
Enzymimmunoassays entwickelte Software RIDA®SOFT Win.NET (Art. Nr.
Z9996) erhältlich.
11.1. Qualitätskontrolle des Tests
Visuell:
Positivkontrolle: blau (gelb nach Zugabe der Stopp-Lösung).
Negativkontrolle: farblos oder sehr schwach blau (farblos oder sehr schwach gelb
nach Zugabe der Stopp-Lösung).
Eine Auswertung sollte nur erfolgen, wenn beide Bedingungen erfüllt sind.
Instrumentell:
Der Extinktionswert der Positivkontrolle sollte größer oder gleich 1,000 sein.
Der Extinktionswert der Negativkontrolle sollte kleiner 0,150 sein.
Falls diese Kriterien nicht erfüllt werden, sollten die folgenden Arbeitsschritte
überprüft und evtl. korrigiert werden. Anschließend den Test wiederholen.
Überprüfen des Haltbarkeitsdatums des Testkits
Sicherstellen, dass alle Reagenzien des Testkits vor Gebrauch auf Raum-
temperatur gebracht werden
RIDASCREEN® Salmonella 16-06-27 9 Verwendung von neuen Pipettenspitzen beim Pipettieren der Proben und
Kontrollen (Vermeidung von Kreuzkontamination)
Überprüfen der Sterilität des Wassers für das Ansetzen des Waschpuffers und
der Salmonella-Bouillon (evtl. steriles Wasser verwenden)
Unzureichendes Waschen / zu wenige Waschschritte (10.4.3.)
Kontaminierte Pipetten (regelmäßig reinigen)
11.2. Interpretation der Ergebnisse
Visuell:
1. Eine Probe wird als POSITIV bewertet, wenn die Negativkontrolle farblos
oder nur sehr schwach blau gefärbt ist und die Probe deutlich intensiver
gefärbt ist. Eine positive Probe kann weniger stark gefärbt sein als die
Positivkontrolle.
2. Eine Probe wird als NEGATIV bewertet, wenn die Negativkontrolle farblos
oder nur sehr schwach blau gefärbt ist und die Probe weniger oder gleich
gefärbt ist wie die Negativkontrolle.
Instrumentell:
1. Eine Probe wird als POSITIV bewertet, wenn der Test als valide beurteilt
wurde und die Extinktion der Probe größer oder gleich 0,200 ist.
2. Eine Probe wird als grenzwertig bewertet, wenn der Test als valide beurteilt
wurde und die Extinktion der Probe zwischen 0,185 und 0,200 liegt.
3. Eine Probe wird als NEGATIV bewertet, wenn der Test als valide beurteilt
wurde und die Extinktion der Probe kleiner 0,185 ist.
Bestätigung positiver Proben
Laut dem Protokoll der NF VALIDATION müssen alle Proben, die durch diese
alternative Methode als positiv identifiziert wurden, nach einer der folgenden
Methoden bestätigt werden:
1. Anwendung der konventionellen Tests, die in den Standard-Methoden von
CEN oder ISO beschrieben sind und von auf Nährböden gewachsenen
Kolonien ausgehen (inklusive der Aufreinigung). Die Bestätigung muss mit
der Anreicherung der Salmonellen beginnen (z.B.: BPW).
2. Direktes Ausstreichen der angereicherten Salmonella-Bouillon (10.4.5) auf
standardisiertem selektiven Agar unter Verwendung von Impföse oder
Tupfer. Falls sich die Anwesenheit von Salmonellen direkt aus der
10 RIDASCREEN® Salmonella 16-06-27Salmonella-Bouillon nicht bestätigen lässt, kann eine selektive Anreicherung
dazwischen geschaltet werden (z. B.: 0,1 ml Salmonella-Bouillon in RVS-
Bouillon, MKTT-n, TBG, etc. animpfen). Darauffolgend werden
entsprechende konventionelle Tests, die in den Standard-Methoden von
CEN oder ISO beschrieben sind, durchgeführt.
Im Fall von diskrepanten Ergebnissen (präsumtiv positives Ergebnis mit dieser
alternativen Methode, das mit keiner der oben genannten Methoden bestätigt
werden konnte) müssen die notwendigen Schritte zur Absicherung der erhaltenen
Ergebnisse durchgeführt werden.
Die Bestätigung kann auch mit diesen Methoden erfolgen:
1. PCR (Polymerase-Kettenreaktion) aus der Salmonella-Bouillon (10.4.5) oder
der Anreicherungsbouillon (im Rahmen der NF VALIDATION nicht
durchgeführt).
2. Probenzugabe (10.4.2) in eine neue Kavität, Fangen der Salmonellen aus
der Probe über die Antikörper, anschließendes Waschen (10.4.3),
Auswischen der Kavität mit einem Tupfer und Ausstreichen auf
standardisierten selektiven Nährmedien (im Rahmen der NF VALIDATION
nicht durchgeführt).
12. Automatisierung
RIDASCREEN® Salmonella ist sowohl für die manuelle als auch für die
automatisierte Durchführung geeignet. Bei der Installation des Tests auf
unterschiedlichen Automaten ist R-Biopharm gerne behilflich.
* im Rahmen der NF VALIDATION wurde bei 37 ± 1 °C inkubiert
Diese Angaben entsprechen dem heutigen Stand unserer Kenntnisse und
sollen über unsere Produkte und deren Anwendungsmöglichkeiten
informieren. Sie haben somit nicht die Bedeutung, bestimmte Eigenschaften
der Produkte oder deren Eignung für einen konkreten Einsatzzweck
zuzusichern. R-Biopharm übernimmt keine Gewährleistung, außer für die
standardisierte Qualität der Reagenzien. Defekte Produkte werden ersetzt. Für
darüber hinaus gehende direkte, indirekte Schäden oder sonstige Kosten im
Zusammenhang mit der Nutzung der Produkte haftet R-Biopharm nicht.
RIDASCREEN® Salmonella 16-06-27 11RIDASCREEN Salmonella
1. Anreicherung
25 g (ml) Probe zu 225 ml gepuffertem Peptonwasser geben (1+ 9)
bei 36 ± 1 °C* für 16-20 h inkubieren
▼
2. Binden der Salmonellen aus der Probe
je 100 µl Kontrollen bzw. Probe aus Anreicherung pro Kavität pipettieren,
bei 36 ± 1 °C* für 30 min inkubieren (Platte abdecken)
▼
3. Erstes Waschen
7 mal mit je 300 µl Waschpuffer
▼
4. Anreicherung subletal geschädigter Zellen
je 250 µl Salmonella-Bouillon in jede Kavität pipettieren,
bei 36 ± 1 °C* für 4 h inkubieren (Platte abdecken)
(5,5 bis 6 h entsprechend dem Protokoll der NF VALIDATION oder generell bei
sauren oder säureproduzierenden Proben)
▼
5. Probentransfer/Rückstellproben
Aufbewahrung der angereicherten Salmonella-Bouillon, wenn die
direkte Bestätigung positiver Ergebnisse auf selektivem Agar gewünscht ist
Kavitäten vollständig entleeren (optional 3 – 5-mal waschen)
▼
6. Konjugat-Zugabe
je 100 µl Konjugat in alle Kavitäten pipettieren
bei 36 ± 1°C* für 30 min inkubieren (Platte abdecken)
▼
7. Zweites Waschen
7-mal mit je 300 µl Waschpuffer
▼
8. Substrat/Chromogen-Zugabe, Ablesen
100 µl Substrat/Chromogen in jede Kavität pipettieren, 15 min im Dunkeln bei RT
inkubieren, Blaufärbung weist auf positive Proben hin
▼
9. Stoppen der Reaktion und Auswertung
je 100 µl Stopp-Lösung in jede Kavität pipettieren,
Gelbfärbung weist auf positive Proben hin
Messung bei 450 nm/620 nm
Negativkontrolle < 0,150 OD Einheiten
Positivkontrolle ≥ 1,000 OD Einheiten
Negative Probe < 0,185 OD Einheiten
Grenzwertige Probe ≥ 0,185 - < 0,200 OD Einheiten
Präsumtiv positive Probe ≥ 0,200 OD Einheiten
* im Rahmen der NF VALIDATION wurde bei 37 ± 1 °C inkubiert
12 RIDASCREEN® Salmonella 16-06-27RIDASCREEN® Salmonella
Brief information
RIDASCREEN® Salmonella (Art. No.: R4201) is a ‘Sandwich’ Enzyme-Immuno-
sorbent Assay for the detection of Salmonella spp. in food, feed and environ-
mental samples in less than 23 hours.
All reagents required for the enzyme immunoassay are contained in the test kit.
Each kit contains sufficient reagents for 96 tests.
Sample preparation: Homogenization and enrichment
Time requirement: Enrichment ....................................................... 16 - 20 h
Test implementation (ELISA) ............................ 6.5 - 7 h
Test implementation, total ............................. 22.5 - 27 h
(including enrichment)
Detection limit: 1 Salmonella in 25 grams of sample, equal to
104 Salmonellae/ml at least after enrichment.
Validation: Method certified by AFNOR CERTIFICATION
following the NF EN ISO 16140 (2003) referential for
the detection of Salmonella spp. (motile and non-
motile including S. Pullorum and S. Gallinarum) in
foods, animal feeds and environmental samples
(excluding breeding environmental samples).
Certificate: RIDASCREEN® Salmonella RBP 31/01-06/08 (End of
validity: 30 June 2020)
The specificity of the RIDASCREEN® Salmonella test was determined by
analyzing the cross-reactivities to corresponding non-target organisms from pure
cultures. In samples, the specificity may deviate from those determined from the
pure culture due to the natural accompanying bacteria. In the analysis of samples
containing natural bacteria the user has to take care about the compliance to
regulations about selective pre-enrichment of samples. The test cannot
discriminate between target organisms and cross-reactive non-target organisms.
RIDASCREEN® Salmonella 16-06-27 13In order to increase the quality of assessment when performing ELISA- procedures, we refer additionally to our Good ELISA Practice (GEP)–Manual in the respective version. Within that manual the minimum standards concerning the framework conditions when using test-kits of R-Biopharm AG and performing ELISA-analysis are listed. The manual can be retrieved, printed and downloaded under the website www.r-biopharm.com/products/food-feed-analysis. 1. Intended use RIDASCREEN® Salmonella (Art. No.: R4201) is a sandwich enzyme immuno- assay for the rapid detection of Salmonellae in food, feed and environmental samples after enrichment (ISO, FDA, USDA, FSIS, BAM). The screening result (presumptive presence/absence) can be obtained in less than 23 hours. 2. General Salmonella is a significant cause of food-borne illness and occurs in a variety of foods. It is the most important pathogen responsible for food poisoning worldwide. Screening samples with RIDASCREEN® Salmonella can confirm the safety of food and feed products sooner than many other methods. 3. Test principle RIDASCREEN® Salmonella is a robust, flexible test used to detect motile and non- motile Salmonella (including S. Pullorum and S. Gallinarum) from an overnight enrichment broth. It works with a simplified one step enrichment procedure to revive any sub-lethally damaged Sallmonella spp. and increase cell numbers. Highly specific, purified antibodies on the well selectively capture any Salmonella present in the sample. A suitable broth is added to the well for rapid growth. The sandwich is completed by the addition of enzyme-labelled antibodies (conjugate) specific for Salmonella. The presence of Salmonella is indicated when the bound conjugate converts the substrate to a blue colour. The results can be read visually or automated with a micro plate reader after the addition of the stop solution ending the reaction and changing the colour from blue to yellow. Production of no colour indicates absence of Salmonella in the enrichment broth and therefore in the original sample. All reagents are differently coloured for a better visual follow up of the pipeting steps. 14 RIDASCREEN® Salmonella 16-06-27
4. Reagents provided
Each kit contains sufficient reagents for 96 tests:
Component Cap color Format Volume
Microtiter plate - ready-to-use 96 wells
Positive control red ready-to-use red stained 2 ml
Negative control white ready-to-use blue stained 2 ml
2 x Wash buffer salt - salt to dissolve
Powder to
Salmonella broth white 3,6 g
dissolve
Conjugate red ready-to-use green stained 10 ml
Substrate/Chromogen brown ready-to-use red stained 13 ml
Red Chromogen Pro
Stop Solution yellow ready-to-use 14 ml
4 x Cover film - ready-to-use
5. Materials required but not provided
5.1. Equipment:
Sample weighing equipment
Blender or equivalent (for sample homogenization)
Blender bags or equivalent (filter optional)
100 µl and 250 µl pipettes
Clean, disposable pipette tips
Incubator 36 ± 1 °C (37 ± 1 °C in the context of NF VALDATION)
Multi channel pipette or micro titre plate washer (optional)
Micro plate reader with 450 ± 10 nm/620 ± 10 nm filters (optional)
Micro plate for Salmonella Bouillon transfer (optional)
Swab (optional)
5.2. Reagents:
Salmonella enrichment media: e.g. buffered peptone water (BPW)
Distilled water (sterile optional)
6. Warnings and precautions
Good microbiology laboratory practices should be employed throughout the
RIDASCREEN® Salmonella test procedure (as described in the standard EN ISO
7218). All samples should be treated as potentially infectious materials.
RIDASCREEN® Salmonella 16-06-27 15All used reagents, wash buffer and disposables which come into contact with potentially infectious samples, must be treated with effective disinfectants or autoclaved at 121 °C for 15 min. This kit may contain hazardous substances. For hazard notes on the contained substances please refer to the appropriate material safety data sheets (MSDS) for this product, available online at www.r-biopharm.com. 7. Storage instructions Store the kit at 2 - 8 °C. Do not freeze any test kit components! Return any unused micro wells to their original foil bag, reseal them together with the desiccant provided and further store at 2 - 8 °C. The reddish substrate/chromogen is light sensitive, therefore, avoid exposure to direct light. No quality guarantee is accepted after expiry of the kit (see kit label). The test kit can be regularly used at least up to the expiry date (indicated on the kit package), if stored correctly. Do not interchange individual reagents between kits of different lot numbers. 8. Indication of instability and deterioration of reagents Any bluish coloration of the reddish substrate/chromogen prior to test implementation. Absorption measured for positive control is below 1.0 (E450/620 nm < 1.0). 9. Preparation of samples Homogenize the sample or add the swab (and the transport medium) to BPW. Typically this is 1 part sample to 9 parts BPW (e.g.: 25 g or 25 ml in 225 ml according to NF VALIDATION). Incubate at 36 ± 1 °C* for 16 – 20 h. It is possible in accordance with the standard EN ISO 7218 to store the broth refrigerated at 2-8 °C for 48 h to defer the confirmation of positive samples once the test is finished (out of NF VALIDATION scope). 16 RIDASCREEN® Salmonella 16-06-27
10. Test implementation
10.1. Preliminary comments
1. Bring all reagents to room temperature before use.
2. It is important to ensure that all enrichment broths are prewarmed to room
temperature (20 - 25 °C) before combining with samples. To ensure thorough
mixing of sample in the medium, blend or stomach as appropriate.
3. Return all reagents to 2 - 8 °C immediately after use.
10.2. Preparation of Salmonella broth
For preparation of the Salmonella broth either dissolve the total content of the
flask (3.6 g) with 100 ml sterile distilled water or weight a suitable part of the
powder (tolerance is at ± 10%) and dissolve with the appropriate volume (e.g.:
1.8 ± 0.18 g for 50 ml). Subsequently either heat at 100 °C for 10 min, autoclave
or use sterile filtration. Store the broth at 2 - 8 °C when not in use and warm
again at 36 ± 1 °C* before use. The broth may be stored refrigerated for up to 1
month.
10.3. Preparation of wash buffer
Add the content of one wash buffer salt pouch to 1 litre distilled water. Where
microbial contamination of water is a problem, the use of sterilized water is
recommended. Store the solution at 2 – 8 °C when not in use and warm at
36 ± 1 °C* before use. The wash buffer may be stored refrigerated for up to
1 month.
10.4. Test procedure
1. Plate preparation: open the pouch and place number of wells needed firmly
into the frame, allowing one well for each sample, one for the positive control
and one for the negative control. Return any unused micro wells to their
original foil bag and reseal.
2. Adding Sample: using a new pipette tip for each sample, transfer 100 µl
aliquots of the controls and samples into individual wells, recording the
position of each sample. Cover the wells with the cover film and incubate for
30 min at 36 ± 1 °C*.
3. First washing: empty the wells and wash seven times with wash buffer
(300 µl), manually (optional: multi channel pipette) or use an automated plate
washer (programmed for use with this test). Thorough washing of the wells is
a critical step and is essential for a clear interpretation of results.
RIDASCREEN® Salmonella 16-06-27 174. Enrichment: add 250 µl Salmonella broth to each well. Cover the wells and
incubate for 4 h at 36 ± 1 °C*. According to the NF VALIDATION procedure
or in general if samples are acidic or acid producing (e.g.: raw milk) the
incubation time has to be 5.5 to 6 h as maximum.
5. Transfer for confirmation (optional): the enriched bouillon can be retained if a
direct confirmation of a positive result on selective media is required.
Transfer 100 to 250 µl of Salmonella broth after incubation to a new micro
plate if needed and cover. It is possible in accordance with the standard EN
ISO 7218 to store the broth refrigerated at 2-8 °C for 48 h to defer the
confirmation of positive samples once the test is finished (out of NF
VALIDATION scope). Empty the wells.
6. Adding conjugate: ensure that the wells are empty (optional: wash 3 to 5
times) before proceeding. Add 100 µl of conjugate to each well. Cover the
wells and incubate for 30 ± 1 min at 36 ± 1 °C*.
7. Second washing: empty the wells and wash seven times with 300 µl of wash
buffer.
8. Adding substrate: ensure the wells are empty before proceeding. Add 100 µl
of substrate/chromogen to each well. Incubate for 15 ± 1 min at room
temperature (20 - 25 °C) in the dark and immediately read the results.
9. Reading the results: change from red to blue colour indicates presumptive
presence of Salmonella. The colour development tends to concentrate
around the sides of the wells. Tap the micro plate gently to distribute the
colour evenly before reading.
10. Adding stop solution: add 100 µl stop solution to each well. Change from blue
to yellow indicates presumptive presence of Salmonella.
11. Automated reading of results: the absorbance of the samples is read at
450 nm and 620 nm as “reference” wavelength using a plate reader.
11. Results
A special software, the RIDA®SOFT Win.NET (Art. No. Z9996), is available to
evaluate the RIDASCREEN® enzyme immunoassays
11.1. Quality control for the test to be valid:
Visual:
Positive control: blue (yellow after addition of stop solution)
Negative control: clear or very pale blue (or very pale yellow if stopped)
18 RIDASCREEN® Salmonella 16-06-27An evaluation is valid only, if both conditions are fulfilled.
Automated:
Positive control must have reached an absorbance of 1.000 or higher
Negative control must have an absorbance of less than 0.150
If these criteria have not been met, the following steps should be checked and
corrected before repeating the test:
Check kit expiry date.
Ensure sufficient time allowed for kit components to reach room temperature.
A new pipette tip must be used for each sample or control to avoid cross
contamination.
Contaminated wash buffer (use sterile water for preparation)
Contaminated Salmonella Bouillon (use sterile water for preparation)
Inadequate washing of wells
Contaminated pipettes (clean regularly)
11.2. Interpretation of the results
Visual:
1. A sample is considered POSITIVE when the negative control is clear or very
pale blue and the positive sample is significantly deeper in colour than this;
however it needs not to be as dark as the positive control.
2. A sample is considered NEGATIVE when the negative control is clear or very
pale blue and the sample is less or equal to the colour of the negative control.
Automated:
1. A sample is considered POSITIVE when the test is valid and the sample well
has a reading greater than or equal to 0.200.
2. A sample is considered doubtful when the test is valid and the sample well
has a reading between 0.185 and 0.200.
3. A sample is considered NEGATIVE when the test is valid and the sample well
has a reading less than 0.185.
RIDASCREEN® Salmonella 16-06-27 19Confirmation of positive results:
In the context of NF VALIDATION, all samples identified as positive by the
alternative method must be confirmed in one of the following ways:
1. Using the conventional tests described in the standardized methods by
CEN or ISO starting from colonies on solid nutrient media (including the
purification step). The confirmation step must start from the Salmonella
enrichment broth.
2. Directly by streaking the enriched Salmonella bouillon (10.4.5) onto
standard selective agar using a loop or swab. If the presence of
Salmonella can’t be confirmed directly by sub-culturing the Salmonella
bouillon a, selective enrichment broth may be used (ex: 0.1 ml of
salmonella bouillon in RVS broth, MKTT-n, TBG, etc.).This subculture has
to be followed by conventional tests described in the standarized methods
by CEN or ISO (including the purification step).
In the event of discordant results (presumptive positive with the alternative
method, non-confirmed by one of the means described above) the laboratory must
follow the necessary steps to ensure validity of the results obtained.
Presumptive positives can also be confirmed:
1. By PCR (polymerase chain reaction) from the Salmonella Bouillon (10.4.5) or
pre-enrichment (not performed in context of NF VALIDATION).
2. By swabbing a new well after sample capture (10.4.2) and washing procedure
(10.4.3) and streaking onto standard selective media (not performed in
context of NF VALIDATION).
12. Automation
RIDASCREEN® Salmonella has been assessed on a range of fully automated
systems; details of which are available on request.
*Incubate at 37 ± 1 °C in the context of NF VALIDATION
20 RIDASCREEN® Salmonella 16-06-27The data corresponds to our present state of technology and provides information on our products and their uses. R-Biopharm makes no warranty of any kind, either expressed or implied, except that the materials from which its products are made are of standard quality. Defective products will be replaced. There is no warranty of merchantability of this product, or of the fitness of the product for any purpose. R-Biopharm shall not be liable for any damages, including special or consequential damage, or expense arising directly or indirectly from the use of this product. RIDASCREEN® Salmonella 16-06-27 21
RIDASCREEN Salmonella
1. Enrichment
Add 25 g (ml) sample to 225 ml BPW (1+9)
Incubate at 36 ± 1 °C* for 16-20 h
▼
2. Binding of Salmonella present in the sample
Add 100 µl positive-, negative control and enrichment samples
Incubate at 36 ± 1 °C* for 30 min (cover plate)
▼
3. First washing
Wash 7 times
▼
4. Revive sub-lethally damaged cells
Add 250 µl Salmonella broth
Incubate 4 h at 36 ± 1 °C* (cover plate)
(5.5 to 6 h according to NF VALIDATION protocol or for acidic
and acid producing samples in general)
▼
5. Sample transfer/Confirmation
Retain enriched Salmonella broth if direct confirmation of
positive results on selective agar is required
Empty wells (optional: wash 3 to 5 times)
▼
6. Adding Conjugate
Add 100 µl conjugate, incubate at 36 ± 1 °C* for 30 min (cover plate)
▼
7. Second washing
Wash 7 times
▼
8. Adding Substrate & reading
Add 100 µl substrate/chromogen
Incubate 15 min at room temperature in the dark
Colour turning from red to blue indicates presumptive presence of Salmonella
▼
9. Adding Stop Solution & reading
Add 100 µl stop solution
Colour turning from blue to yellow indicates presumptive presence of Salmonella
Read absorbance at 450 nm/620 nm ref. filter
Negative control < 0.150 OD units
Positive control ≥ 1.000 OD units
Negative sample < 0.185 OD units
Doubtful sample ≥ 0.185 - < 0.200 OD units
Positive sample ≥ 0.200 OD units
*Incubate at 37 ± 1 °C in the context of NF VALIDATION
22 RIDASCREEN® Salmonella 16-06-27RIDASCREEN® Salmonella
Avant-propos
RIDASCREEN® Salmonella (Art. No.: R4201) offre une détection rapide et
spécifique des Salmonella spp. dans les aliments et produits alimentaires, ainsi
que dans les échantillons d’environnement. Des résultats positifs présomptifs
peuvent être obtenus en moins de 23 heures.
Le test est basé sur le principe d’une réaction immuno-enzymatique de type
ELISA en configuration sandwich.
Tous les réactifs nécessaires aux 96 tests sont contenus dans le coffret.
Préparation des échantillons: Homogénéisation et enrichissement
Temps nécessaire: Enrichissement ................................................ 16 - 20 h
Réalisation du test (ELISA) ............................. 6,5 - 7 h
Réalisation complète du test ......................... 22,5 - 27 h
(temps d´incubation inclus)
Limite de détection: 1 Salmonella dans 25 grammes d’échantillon, soit au
moins 104 Salmonella/ml après enrichissement.
Validation : Méthode certifiée par AFNOR CERTIFICATION selon
le référentiel NF EN ISO 16140 (2003) pour la
détection des Salmonella spp. (mobiles et immobiles
incluant S. Gallinarum et S. Pullorum) dans les
aliments et les produits d’alimentation humaine et
animale ainsi que dans les échantillons
d’environnement (hors échantillons de production
primaire).
Attestation : RIDASCREEN® Salmonella RBP 31/01-06/08 (Fin de
validité : 30 juin 2020)
La spécificité du test RIDASCREEN® Salmonella a été déterminée en analysant
les réactions croisées avec des micro-organismes provenant de cultures pures.
Dans les échantillons, la spécificité peut-être différente de celle mesurée avec les
cultures pures, à cause des autres bactéries présentes naturellement. Lors de
l’analyse d’échantillons contenant naturellement des bactéries, l’utilisateur doit
RIDASCREEN® Salmonella 16-06-27 23être attentif à respecter les règles sur le pré-enrichissement sélectif des échantillons. Le test ne peut pas différencier entre le micro-organisme cible et ceux qui montrent des réactions croisées. Afin d’améliorer la qualité des résultats lors de la realisation de tests ELISA, nous suivons aussi notre manuel de bonnes pratiques ELISA (Good ELISA Practice GEP) dans la version. Ce manuel donne les standards minimum à observer pour l'utilisation des coffrets R-Biopharm AG et la réalisation des tests ELISA. Ce manuel peut être trouvé, imprimé ou téléchargé sur notre site www.r- biopharm.com/products/food-feed-analysis. 1. Application du test RIDASCREEN® Salmonella (Art. No.: R4201) est un test immuno-enzymatique en « sandwich » qui permet une détection rapide des Salmonella spp. dans les aliments et produits alimentaires, ainsi que dans les échantillons d’environnement, préalablement enrichis (ISO, FDA, USDA, FSIS, BAM). Le résultat (présence présomptive/absence) peut être obtenu en moins de 23 heures. 2. Généralités Les toxi-infections à salmonelles appelées salmonelloses continuent d’être l’une des formes d’intoxication alimentaire les plus répandues dans le monde. Les salmonelles sont des bactéries Gram négatif appartenant à la famille des Entérobactéries et peuvent être mises en évidence dans une grande variété d’aliments et d’échantillons environnementaux. 3. Principe du test La méthode RIDASCREEN® Salmonella est basée sur une réaction immuno- enzymatique de type ELISA permettant la détection des salmonelles mobiles et immobiles (incluant S. Gallinarum et S. Pullorum). Les échantillons enrichis à tester sont distribués dans les puits de la microplaque préalablement identifiés. Hautement spécifiques, les anticorps coatés capturent de manière sélective les salmonelles présentes. Les lavages permettent d’éliminer toute substance non spécifique. Les salmonelles capturées vont alors se multiplier, après incubation dans un bouillon d’enrichissement, jusqu’à ce qu’elles atteignent un niveau détectable. Les anticorps, marqués par une enzyme spécifique aux salmonelles (conjugué), sont alors ajoutés. Le conjugué va s’accrocher aux salmonelles présentes et l’excès est éliminé par lavage. La présence des salmonelles est 24 RIDASCREEN® Salmonella 16-06-27
révélée par la dégradation du chromogène sous l’action de l’enzyme du conjugué,
qui se traduit par une coloration bleue. Les résultats peuvent être lus
visuellement, ou à l’aide d’un lecteur de microplaque après addition de la solution
d’arrêt. Les réactifs sont tous de couleurs différentes afin de pouvoir suivre
visuellement au mieux chacune des étapes de pipetage.
4. Composition du coffret
Chaque coffret contient le matériel suffisant pour 96 tests:
Cap color /
Component /
Couleur du Format Volume
Composant
capuchon
Microtiter plate
- prêt à l´emploi 96 puits
Microplaque
Positive control colorée en
Rouge prêt à l´emploi 2 ml
Contrôle positif rouge
Negative control colorée en
Blanc prêt à l´emploi 2 ml
Contrôle négatif bleu
2 x Wash buffer salt
2 x sel de tampon de - sel à dissoudre
lavage
Salmonella broth poudre à
Blanc 3,6 g
Bouillon Salmonella dissoudre
Conjugate colorée en
rouge prêt à l´emploi 10 ml
Conjugué vert
Substrate/Chromogen
colorée en
Substrat/chromogène Marron prêt à l´emploi 13 ml
rouge
Red Chromogen Pro
Stop Solution
jaune prêt à l´emploi 14 ml
Solution d’arrêt
4 x Cover film
- prêt à l´emploi
4 x Films adhésifs
5. Matériel nécessaire non fourni
5.1. Equipement:
Balance
Mélangeur ou équivalent (homogénéisation d’échantillon)
Sac mélangeur ou équivalent (filtre optionnel)
Micropipettes: 100 µl et 250 µl
Embouts de pipettes
Incubateur à 36 ± 1 °C (37 ± 1 °C dans le cadre de la marque
NF VALIDATION)
Laveur de microplaque ou multi pipette (optionnel)
Lecteur de microplaque pour lecture à 450 ± 10 nm/620 ± 10 nm (optionnel)
RIDASCREEN® Salmonella 16-06-27 25 Microplaque pour bouillon Salmonella transféré (optionnel) Ecouvillon (optionnel) 5.2. Réactifs : Bouillon d’enrichissement Salmonella (Eau Peptonée Tamponnée - EPT). Eau distillée ou déminéralisée (stérile optionnelle) 6. Précautions d´emploi Respecter les Bonnes Pratiques de Laboratoire (se reporter à la norme EN ISO 7218). La présence d’organismes viables et pathogènes est possible. Suivre les règles de sécurité en vigueur. Quand l’essai est achevé, passer les puits à l’autoclave (15 min à 121 °C) ou en disposer selon la réglementation locale. Ce coffret peut contenir des substances dangereuses pour la santé. Pour avoir les informations sur les dangers des substances présentes, merci de se référer aux fiches de sécurité appropriées (MSDS) disponibles sur notre site internet www.r biopharm.com. 7. Stockage Le coffret doit être conservé entre 2 et 8 °C. NE PAS CONGELER. Remettre les puits non utilisés dans leur sachet d’origine contenant le dessicant et le refermer. Le substrat/chromogène rouge est photosensible, conserver cette solution à l’abri de la lumière. Ne pas utiliser le coffret après la date d’expiration (inscrite sur l’emballage). Les coffrets peuvent être utilisés au moins jusqu'à la date de péremption (indiquée sur les coffrets), dans les conditions de stockage prévues. Les réactifs du RIDASCREEN® Salmonella sont indissociables. 26 RIDASCREEN® Salmonella 16-06-27
8. Signes d´instabilité ou de détérioration Toute coloration bleue de le substrat/chromogène rouge avant la réalisation du test indique une contamination ou détérioration du réactif. Contrôle positif D.O.450/620 nm < 1,000. 9. Préparation des échantillons Homogénéiser l’échantillon ou ajouter l’écouvillon (ainsi que son milieu de transport) dans l’EPT. Ajouter 1 part d’échantillon pour 9 parts d’EPT (ex: 25 g ou ml dans 225 ml). Les prises d’essais supérieures à 25 g n’ont pas été testées dans le cadre de la marque NF VALIDATION. Incuber à 36 ± 1 °C* pendant 16 - 20 h. Une fois le test réalisé, il est possible, conformément à la norme NF EN ISO 7218, de conserver le bouillon à une température de 2-8 °C jusqu’à 48 h en vue de différer la confirmation des échantillons positifs (hors cadre NF VALIDATION). 10. Réalisation du test 10.1. Conseils préliminaires Il est important de s’assurer que tous les bouillons d’enrichissement sont préchauffés à température ambiante avant addition de l’échantillon. Tous les réactifs doivent être amenés à température ambiante avant utilisation. 10.2. Préparation du bouillon Salmonella Dissoudre 3,6 g de bouillon Salmonella en poudre dans 100 ml d’eau stérile distillée ou désionisée. Il est possible de peser une partie du bouillon Salmonella (tolérance autour de ± 10%) et de la dissoudre dans un volume d’eau stérile distillée approprié (p. ex.: 1,8 ± 0,18 g pour 50 ml). Chauffer 10 min à 100 °C ou autoclaver ou filtrer. Conserver le bouillon à 2 - 8°C lorsqu’il n’est pas utilisé et le préchauffer à 36 ± 1 °C* avant utilisation. Le bouillon se conserve 1 mois au réfrigérateur. 10.3. Préparation de la solution de lavage Dissoudre le sel pour tampon de lavage dans 1 litre d'eau distillée ou désionisée. Conserver la solution à 2 – 8 °C lorsqu’elle n’est pas utilisée, et la préchauffer à 36 ± 1 °C* avant utilisation. La solution de lavage se conserve 1 mois au réfrigérateur. RIDASCREEN® Salmonella 16-06-27 27
10.4. Réalisation du test
1. Préparation de la plaque: constituer la plaque avec le nombre de puits
nécessaires à chaque série d’analyse en comptant un puits par échantillon,
un puits pour le contrôle positif et un puits pour le contrôle négatif. Replacer
les barrettes et les puits inutilisés dans leur emballage d’origine et re-sceller.
2. Ajout des échantillons: en utilisant un cône de prélèvement neuf pour
chaque échantillon, transférer 100 µl d’aliquots des contrôles et des
échantillons dans les puits individuels. Recouvrir les puits et incuber 30 min
à 36 ± 1 °C*.
3. Premier lavage: vider les puits et les laver sept fois avec la solution de
lavage (300 µl). Cette opération de lavage peut être également effectuée à
l’aide d’une multi pipette ou d’un laveur automatique (programmé pour
l’utilisation spécifique à ce test). Le lavage des puits doit être mené
consciencieusement. Il conditionne la clarté d’interprétation des résultats.
4. Enrichissement: Ajouter 250 µl de bouillon Salmonella dans chaque puits
utilisé. Recouvrir les puits et incuber 4 h à 36 ± 1 °C* (5,5 à 6 h maximum
pour l’analyse d’échantillons acides ou producteurs d’acides (ex. lait cru)
ainsi que dans le cadre de la marque NF VALIDATION).
5. Transfert pour la confirmation (optionnel): Transférer 100 à 250 µl de
bouillon Salmonella après incubation dans une nouvelle microplaque et
couvrir si une confirmation directe des échantillons présomptifs positifs sur
milieu sélectif est nécessaire sinon vider les puits. Une fois le test réalisé, il
est possible, conformément à la norme NF EN ISO 7218, de conserver le
bouillon à une température de 2 - 8 °C jusqu’à 48 h en vue de différer la
confirmation des échantillons positifs (hors cadre NF VALIDATION).
6. Ajout du conjugué: vérifier que les puits sont vides (optionnel: laver 3 à 5
fois) avant de poursuivre. Ajouter 100 µl de conjugué dans chaque puits
utilisé. Recouvrir les puits et incuber 30 ± 1 min à 36 ± 1 °C*.
7. Deuxième lavage: vider les puits et les laver sept fois avec la solution de
lavage (300 µl).
8. Ajout du substrat: vérifier que les puits sont vides avant de poursuivre.
Ajouter 100 µl de substrat dans chaque puits utilisé. Incuber pendant
15 ± 1 min à température ambiante à l’abri de la lumière, puis lire les
résultats.
9. Lecture visuelle des résultats: le virement de la couleur rouge (rose) du
substrat au bleu indique la présence présomptive de Salmonella. La couleur
développée a tendance à s’accumuler autour des puits. Avant de lire le
28 RIDASCREEN® Salmonella 16-06-27résultat, tapoter légèrement le fond des puits sur la paillasse afin
d’homogénéiser la coloration.
10. Ajout de la solution d’arrêt: l’addition de solution d’arrêt est facultative, mais
la solution doit être ajoutée pour une lecture automatique. Ajouter 100 µl de
solution d’arrêt dans chaque puits. Le virement de la couleur bleue du
substrat au jaune indique la présence présomptive de Salmonella.
11. Lecture automatique des résultats: Mesurer les densités optiques
développées dans chacun des puits en utilisant un lecteur de microplaque à
une longueur d’onde de 450 ± 10 nm et fixer la seconde longueur d’onde de
référence à 620 ± 10 nm.
11. Résultats
Un logiciel spécial, RIDA®SOFT WIN.NET (Art. No. : Z9996), est disponible pour
gérer les tests immuno-enzymatique de RIDASCREEN®.
11.1. Contrôle de qualité pour que le test soit valable:
Visuelle:
Contrôle positif: couleur bleue (ou jaune après l’addition de la solution d’arrêt)
Contrôle négatif: incolore ou bleu très clair (ou jaune très clair)
Automatique:
Le contrôle négatif doit avoir une densité optique inférieure à 0,150
Le contrôle positif doit avoir une densité optique supérieure à 1,000
Si ces critères n’ont pas été remplis, les résultats des échantillons ne peuvent être
validés. Les points suivants doivent être vérifiés avant de répéter le test :
Vérifier la date de péremption du coffret.
S’assurer que les composants du coffret ont le temps d’atteindre la
température ambiante.
Un cône de prélèvement neuf doit être utilisé pour chaque échantillon
(contamination croisée).
Eau de lavage à fort taux de contamination (utiliser de l’eau stérile pour le
lavage)
Bouillon Salmonella à fort taux de contamination (utiliser de l’eau stérile)
Les puits n’ont pas été lavés de façon adéquate.
Contamination de la pipette (nettoyer les pipettes régulièrement)
RIDASCREEN® Salmonella 16-06-27 29Sie können auch lesen
