Virus-RNA Isolation-Kit - Bio&SELL
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Virus-RNA Isolation-Kit
Datenblatt
Artikel-Nr.
BS77.861.0010 10 Präparationen
BS77.861.0050 50 Präparationen
BS77.861.0250 250 Präparationen
(Nur für Forschung und in vitro-Anwendungen)
____________________________________________________
Für:
Chargen-Nr.:
Mindestens haltbar:
Aussehen:
Farbe:
____________________________________________________
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90537 Feucht bei Nürnberg Internet: www.bio-sell.de Fax : +49 (0) 9128 – 724 32 33
1
Virus-RNA Isolation-Kit
Beschreibung
Säulchen basierte Extraktion viraler Nukleinsäuren aus den
unterschiedlichsten Ausgangsproben (Seren, Plasma, Zellkultur-
überstände, Vollblut, zellfreie Körperflüssigkeiten, Tupfern, Geweben etc.).
Das Kit enthält Carrier-RNA sowie interne Kontroll-DNA und -RNA für
QPCR-Tests. Die isolierten Nukleinsäuren sind sofort in allen Arten von
Nachfolgeanwendungen (wie z.B. PCR, QPCR, enzymatische
Applikationen) einsetzbar.
Kit-Komponenten
Vor jeder Nutzung sollten alle Komponenten Raumtemperatur haben.
Kristalle, die sich eventuell während der Lieferung bzw. Lagerung gebildet
haben, können durch vorsichtiges Erwärmen gelöst werden.
Wichtige Informationen zur Lagerung:
• Lyophilisierte Proteinase K: bei 4°C
• Gelöste Proteinase K: -20°C
(Wir empfehlen das Aliquotieren der gelösten Proteinase K um
häufiges auftauen zu vermeiden, da dies die Aktivität des Enzyms
stark reduziert)
• Lyophilisierter Carrier-Mix: bei -20°C
• Unbenutzte Carrier-Mix-Stock-Lösung: bei -20°C
(Die Lösung sollte nicht mehr als 3x aufgetaut und eingefroren
werden; Stock-Lösung daher aliquotieren und bei -20°C lagern)
• Alle weiteren Komponenten: trocken, bei Raumtemperatur
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2
Virus-RNA Isolation-Kit
Kit Komponenten 250 Aufreinigungen
Lysepuffer SM 150 ml
Bindepuffer WM 180 ml
Carrier Mix für 3 x 1,25 ml Arbeitslösung
RNase-freies Wasser 3 x 2 ml
Proteinase K für 4 x 1,5 ml Arbeitslösung
Waschpuffer IT 70 ml
Waschpuffer MT 36 ml
RNase-freies Wasser 30 ml
Zentrifugationssäulen
(lila) 5 x 50
Sammel-Tubes
2,0 ml 25 x 50
Elutions-Tubes
1,5 ml 5 x 50
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3Virus-RNA Isolation-Kit
Wichtige Schritte vor Beginn
• Zugabe von 96 – 99,8% Ethanol zu Waschpuffer IT und MT.
Waschpuffer IT
Geben Sie 70 ml 96 – 99,8%iges Ethanol zur Flasche mit
Waschpuffer IT. Gründlich mischen und Flasche stets dicht
verschlossen halten!
Waschpuffer MT
Geben Sie 144 ml 96 – 99,8%iges Ethanol zu jeder Flasche mit
Waschpuffer MT. Gründlich mischen und Flaschen stets dicht
verschlossen halten.
• Zugabe von ddH2O zur lyophilisierten Proteinase K.
Lösen Sie die Proteinase K jeweils durch Zugabe von 1,5 ml ddH2O.
Mischen Sie gut (mehrmaliges Auf- und Ab-pipettieren), Aliquotieren
Sie die Lösung und lagern Sie sie bei -20°C.
• Zugabe von RNase-freiem H2O zum lyophilisierten Carrier-Mix.
Lösen Sie den Carrier Mix durch Zugabe von 1,25 ml RNase-freiem
H2O zu jedem Tube. Gründlich mischen durch Auf- und Ab-
pipettieren. Aliquotieren Sie die Lösung und lagern Sie sie bei -20°C.
Hinweis: RNase-freies H2O nicht vorheizen!
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4Virus-RNA Isolation-Kit
Herstellung der Lysepuffer SM/ Carrier Mix-Mischung
1. Geben Sie 1,25 ml RNase-freies Wasser zu jedem Tube Carrier Mix
2. Gründlich mischen durch Auf- und Ab-pipettieren!
3. Lysepuffer SM/ Carrier Mix-Mischung gemäß nachfolgenden Tabellen
herstellen:
5 10 n
Komponente
Präparationen Präparationen Präparationen
540 µl pro
Lysepuffer SM 2,7 ml 5,4 ml
Präparation
12 µl pro
Carrier Mix 60 µl 120 µl
Präparation
552 µl pro
Endvolumen 2,76 ml 5,52 ml
Präparation
Wichtige Hinweise:
• Der Carrier Mix enthält Carrier-RNA sowie interne Kontroll-RNA.
• Gelösten Carrier Mix sofort zum Lysepuffer SM geben!
• Nicht benutzten Carrier Mix bei -20 °C einfrieren!
• Carrier Mix nicht häufiger als dreimal einfrieren und auftauen
(in Aliquots lagern)!
• Die Lysepuffer SM/ Carrier Mix-Mischung ist für einen Tag bei 4 °C
stabil.
Nicht im Kit enthaltene Komponenten
• ddH2O (RNAse frei) zum Lösen der Proteinase K
• 96 – 99,8% Ethanol
(nur reinen Ethanol verwenden, keinen methylierten/denaturierten)
• 1,5 ml Reaktionsgefäße; Optional: 2,0 ml Reaktionsgefäße
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5Virus-RNA Isolation-Kit
Wichtig vor Arbeitsbeginn
• Heizen Sie einen Thermomixer oder ein Wasserbad auf 70 °C vor
• Temperieren Sie RNase-freies Wasser auf 70 °C
(Achtung: nicht zum Lösen des Carrier Mix verwenden!)
• Stellen Sie sicher, dass Waschpuffer IT, Waschpuffer MT, Proteinase
K und der Carrier Mix gemäß den Instruktionen vorbereitet sind
• Alle Zentrifugationsschritte sollten bei Raumtemperatur durchgeführt
werden
• Vermeiden Sie wiederholtes Einfrieren und Auftauen des
Ausgangsmaterials
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6Virus-RNA Isolation-Kit
Sicherheitsanweisungen
Bitte gehen Sie mit allen Materialien und Reagenzien, die im Kit enthalten sind, vorsichtig
um. Es sollten immer Handschuhe getragen und Hautkontakt vermieden werden!
Bei Kontakt mit Augen oder Haut sofort mit viel Wasser abspülen!
Lesen Sie sich bitte jeden Abschnitt sorgfältig durch, um Ihre eigene Sicherheit und eine
reibungslose Durchführung zu garantieren. Folgen Sie allen Sicherheitshinweisen wie in
dieser Broschüre erklärt, sowie auch Hinweisen und Informationen.
Für den einmaligen Gebrauch Verwenden Sie keine Komponente ein zweites Mal!
Vorsicht!
• Trinken oder Essen der Kit-Komponenten sind strikt untersagt!
• Wenn die Pufferflaschen beschädigt oder undicht sind, tragen Sie bei der
Entsorgung der Flaschen Handschuhe und eine Schutzbrille, um Verletzungen zu
vermeiden. Dieses Kit kann mit potentiell infektiösen Proben verwendet werden.
Daher müssen alle flüssigen Abfälle als potentiell infektiös betrachtet werden und
müssen entsprechend der örtlichen Sicherheitsvorschriften behandelt und
verworfen werden.
• Bitte beachten Sie die Bundes-, Landes- und örtlichen Sicherheits- und Umwelt-
vorschriften. Befolgen Sie die üblichen Vorsichtsmaßnahmen für die Arbeiten mit
extrahierten Nukleinsäuren. Alle Materialien und Reagenzien, die für die RNA-
Isolierung verwendet werden, sollten frei von RNasen sein.
Vorsicht!
Fügen Sie nach der Probenvorbereitung dem Abfall keine Bleiche oder sauren
Bestandteile hinzu.
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7Virus-RNA Isolation-Kit
Hinweis:
Notfallmedizinische Informationen in englischer und deutscher Sprache können 24
Stunden am Tag erhalten werden:
Telefonnummern der Vergiftungs - Informations- Zentralen:
München +49 (0)89 19240
Wien 01/406 43 43
Zürich + 41 44 251 51 51 (für die Schweiz: 145)
Für weitere Informationen fragen Sie bitte das Sicherheitsdatenblatt an.
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8Virus-RNA Isolation-Kit
GHS-Klassifikation
Komponente Gefährdender GHS H-Sätze P-Sätze EUH
Inhalt Symbol
101, 102, 103, 032
Guanidinium- 260,
302, 314,
Lysepuffer SM thiocyanat 303 + 361 + 353,
412
25-50% 305 + 351 + 338,
Gefahr
310, 405, 501
032
Guanidinium-
101, 102, 103,
thiocyanat 302, 312,
260,
25-50% 314, 315,
Bindepuffer WM 303 + 361 + 353,
Polyethylenglykol- 318, 332,
305 + 351 + 338,
oktylphenolether 411, 412
310, 405, 501
25-50%
Gefahr
101, 102, 103, 032
Guanidinium- 302+ 312, 260,
Waschpuffer IT thiocyanat 314, 332, 303 + 361 + 353,
50-100% 412 305 + 351 + 338,
Gefahr
405, 501
H-Sätze
302 Gesundheitsschädlich bei Verschlucken.
312 Gesundheitsschädlich bei Hautkontakt.
314 Verursacht schwere Verätzungen der Haut und schwere
Augenschäden.
315 Verursacht Hautreizungen.
318 Verursacht schwere Augenschäden.
332 Gesundheitsschädlich beim Einatmen.
411 Giftig für Wasserorganismen, mit langfristiger Wirkung.
412 Schädlich für Wasserorganismen, mit langfristiger Wirkung.
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9Virus-RNA Isolation-Kit
P-Sätze
101 Ist ärztlicher Rat erforderlich, Verpackung oder
Kennzeichnungsetikett bereithalten.
102 Darf nicht in die Hände von Kindern gelangen.
103 Vor Gebrauch Kennzeichnungsetikett lesen.
260 Staub/Rauch/Gas/Nebel/Dampf/Aerosol nicht einatmen.
303 + 361 + 353 BEI BERÜHRUNG MIT DER HAUT (oder dem Haar): Alle
kontaminierten Kleidungsstücke sofort ausziehen.
Haut mit Wasser abwaschen [oder duschen].
305 + 351 + 338 BEI KONTAKT MIT DEN AUGEN: Einige Minuten lang
behutsam mit Wasser spülen. Eventuell vorhandene
Kontaktlinsen nach Möglichkeit entfernen. Weiter spülen.
310 Sofort GIFTINFORMATIONSZENTRUM/Arzt/… anrufen.
Vorschriften der Entsorgung zuführen.
405 Unter Verschluss aufbewahren.
501 Inhalt/Behälter gemäß der lokalen/nationalen/internationalen
Vorschriften der Entsorgung zuführen.
EUH-Sätze
032 Entwickelt bei Berührung mit Säure sehr giftige Gase.
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10Virus-RNA Isolation-Kit
Allgemeine Bemerkungen und Sicherheitshinweise zum Umgang mit
RNA
RNA ist deutlich instabiler als DNA. Sie ist äußerst anfällig für Degradierung durch
endogene RNasen im Ausgangsmaterial und durch im Labor allgegenwärtige exogene
RNasen. Um bei der RNA-Präparation zufrieden stellende Ergebnisse bezüglich
Qualität und Ausbeuten zu erhalten, müssen Verunreinigungen durch exogene RNasen
auf ein Minimum reduziert werden. Beachten Sie hierzu die folgenden Empfehlungen:
• Während der gesamten Präparation stets Latex- oder Vinylhandschuhe tragen,
um RNase-Kontaminationen insbesondere von der Hautoberfläche zu
vermeiden.
• Handschuhe häufig wechseln und alle Gefäße geschlossen halten.
• Isolierte RNA stets kühlen.
• Die Präparationsdauer möglichst gering halten.
• Während der gesamten Präparation nur sterile Einmal-Polypropylengefäße
benutzen (diese sind gewöhnlich RNase-frei).
• Nicht-Einweg-Plastikartikel vor Gebrauch mit 0,1 M NaOH, 1 mM EDTA und
nachfolgend mit RNase-freiem Wasser spülen, um RNase-Freiheit
sicherzustellen. Chloroform-resistente Plastik-artikel können alternativ mit
Chloroform gespült werden.
• Alle Glaswaren sollten vor Gebrauch mit Detergenzien gereinigt, sorgfältig
gespült und für mindestens 4 Stunden bei 240°C im Ofen gebacken werden.
Autoklavieren allein ist nicht ausreichend zur vollständigen Inaktivierung vieler
RNasen. Das Backen im Ofen hingegen stellt zusätzlich zur Inaktivierung der
RNasen sicher, dass sich keine anderen Nukleinsäuren (wie z.B. Plasmid-DNA)
an der Oberfläche befinden. Alternativ können Glaswaren durch vollständiges
Bedecken mit 0,1% DEPC (Diethyl-Pyrocarbonat) für 12 Stunden bei 37°C und
nachfolgendes Autoklavieren oder Erhitzen auf 100°C für 15 Minuten zur
Entfernung des restlichen DEPC gereinigt werden.
• Elektrophorese-Kammern mit Detergenzien (z.B. 0,5% SDS) reinigen und
anschließend sorgfältig mit RNase-freiem Wasser und nachfolgend mit Ethanol
spülen. Trocknen lassen!
• Alle Puffer und Lösungen mit DEPC-behandeltem RNase-freiem ddH2O
ansetzen.
• Den Umgang mit Bakterienkulturen, Zellkulturen oder anderen biologischen
Quellen von RNasen im gleichen Labor vermeiden, in dem die RNA-Präparation
durchgeführt wird.
• Getrennte Apparate, Glas- und Plastikwaren für die RNA-Isolierung und für
Applikationen, bei denen RNasen freigesetzt werden können verwenden.
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11Virus-RNA Isolation-Kit
Lyse des Ausgangsmaterials
Binden der viralen Nukleinsäuren an
den Zentrifugationsfilter
2x Waschen der gebundenen
Nukleinsäuren
Elution der viralen Nukleinsäuren
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12Virus-RNA Isolation-Kit
Protokoll 1:
Isolierung von viraler RNA aus Serum, Plasma, Zellkulturüberständen/
Medien und anderen zellfreien Körperflüssigkeiten (bis 150 µl)
Wichtiger Hinweis: Füllen Sie vor Arbeitsbeginn die benötigte Menge RNase-freies
Wasser in ein 1,5 ml Reaktionstube ab und inkubieren Sie dieses bei 70 °C bis zum
Elutionsschritt!
Stellen Sie die Lysepuffer SM/ Carrier Mix-Mischung wie oben beschrieben (S.5) her!
1. 1,5 oder 2,0 ml Reaktionsgefäß öffnen und 450 µl Lysepuffer SM/Carrier Mix zu-
geben. 150 µl der Probe sowie 20 µl Proteinase K zugeben. Durch mehrmaliges
Vortexen für insgesamt 10 Sekunden gründlich mischen und für 10 Minuten bei
Raumtemperatur inkubieren, möglichst unter Schütteln (z.B. in einem
Thermomixer).
Falls ein kontinuierliches Schütteln nicht möglich ist, die Probe während der
Inkubation 3 - 4mal vortexen. Nach der Lyse das Reaktionsgefäß kurz
zentrifugieren, um das Kondensat vom Deckel zu entfernen.
2. 600 µl Bindepuffer WM zu der lysierten Probe geben und durch Vortexen oder
mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gründlich mischen, bis eine homogene Lösung
entsteht.
Hinweis: Der Bindepuffer ist sehr viskös, daher vorsichtig pipettieren.
3. Eine Zentrifugationssäule in ein 2,0 ml Sammeltube stellen. 650 µl der Probe
auf die Säule (lila) geben. Den Deckel verschließen und bei 10.000 x g (12.000
rpm) für 1 Minute zentrifugieren.
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13Virus-RNA Isolation-Kit
Hinweis: Falls der Überstand nicht komplett durch die Membran zentrifugiert wurde,
nochmals bei höherer Geschwindigkeit zentrifugieren oder die Zentri-
fugationszeit verlängern.
Das Sammeltube mit dem Durchfluss verwerfen.
4. Zentrifugationssäule in ein neues 2,0 ml Sammeltube stellen und die restliche
Probe auf die Zentrifugationssäule geben. Deckel verschließen und bei 10.000 x g
(12.000 rpm) für 1 Minute zentrifugieren.
Hinweis: Falls der Überstand nicht komplett durch die Membran zentrifugiert wurde,
nochmals bei höherer Geschwindigkeit zentrifugieren oder die Zentri-
fugationszeit verlängern.
Das Sammeltube mit dem Durchfluss verwerfen.
5. Zentrifugationssäule in ein neues 2,0 ml Sammeltube stellen. Zentrifugationssäule
öffnen und 500 µl Waschpuffer IT zugeben. Den Deckel verschließen und bei
10.000 x g (12.000 rpm) für 1 Minute zentrifugieren. Das Sammeltube mit dem
Durchfluss verwerfen. Zentrifugationssäule in ein neues 2,0 ml Sammeltube
stellen.
6. Zentrifugationssäule öffnen und 650 µl Waschpuffer MT zugeben. Den Deckel ver-
schließen und bei 10.000 x g (12.000 rpm) für 1 Minute zentrifugieren. Das
Sammeltube mit dem Durchfluss verwerfen.
Zentrifugationssäule in ein neues 2,0 ml Sammeltube stellen.
7. Bei 10.000 x g (12.000 rpm) für 3 Minuten zentrifugieren, um alle Ethanol-Reste
vollständig zu entfernen. Das Sammeltube mit dem Durchfluss verwerfen.
Zentrifugationssäule in ein 1,5 ml Elutionstube stellen.
8. Zentrifugationssäule vorsichtig öffnen und 60 µl – 100 µl RNase-freies Wasser
zugeben. Bei Raumtemperatur für 2 Minuten inkubieren, dann bei 8.000 x g (10.000
rpm) für 1 Minute zentrifugieren. Für eine max. Ausbeute an RNA können zwei
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14Virus-RNA Isolation-Kit
Elutionsschritte mit gleichen Volumina Puffer (z.B. 30 µl + 30 µl) durchgeführt werden.
Hinweis:
Die RNA kann auch mit geringeren oder mit höheren Volumina an
Elutionspuffer eluiert werden als oben angegeben. Bei geringeren Volumina
an Elutionspuffer erhöht sich die Endkonzentration der RNA. Die extrahierte
RNA sollte bei 4 °C – 8 °C aufbewahrt werden. Für Langzeitlagerung wird eine
Temperatur von – 22 °C bis – 18 °C empfohlen.
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15Virus-RNA Isolation-Kit
Protokoll 2:
Isolierung von viraler RNA aus Serum, Plasma, Zellkulturüberständen/
Medien und anderen zellfreien Körperflüssigkeiten (bis 300 µl)
Wichtiger Hinweis:
Füllen Sie vor Arbeitsbeginn die benötigte Menge RNase-freies Wasser in ein 1,5 ml
Reaktionstube ab und inkubieren Sie dieses bei 70 °C bis zum Elutionsschritt!
Stellen Sie die Lysepuffer SM/ Carrier Mix-Mischung wie oben beschrieben (S.5) her!
1. 2,0 ml Reaktionsgefäß öffnen und 400 µl Lysepuffer SM/ Carrier Mix zugeben.
300 µl der Probe sowie 20 µl Proteinase K zugeben. Durch mehrmaliges Vortexen
für insgesamt 10 Sekunden gründlich mischen und für 10 Minuten bei Raumtempe-
ratur inkubieren, möglichst unter Schütteln (z.B. in einem Thermomixer).
Falls ein kontinuierliches Schütteln nicht möglich ist, die Probe während der
Inkubation 3 - 4mal vortexen. Nach der Lyse das Reaktionsgefäß kurz
zentrifugieren, um das Kondensat vom Deckel zu entfernen.
2. 700 µl Bindepuffer WM zu der lysierten Probe geben und durch Vortexen oder
mehrmaliges Auf- und Ab-pipettieren gründlich mischen, bis eine homogene Lösung
entsteht.
Hinweis: Der Bindepuffer ist sehr viskös, daher vorsichtig pipettieren.
3. Eine Zentrifugationssäule in ein 2,0 ml Sammeltube stellen. 650 µl der Probe
auf die Säule (lila) geben. Den Deckel verschließen und bei 10.000 x g (12.000
rpm) für 1 Minute zentrifugieren.
Hinweis: Falls der Überstand nicht komplett durch die Membran zentrifugiert
wurde, nochmals bei höherer Geschwindigkeit zentrifugieren oder die
Zentrifugationszeit verlängern.
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16Virus-RNA Isolation-Kit
Das Sammeltube mit dem Durchfluss verwerfen. Zentrifugationssäule in ein neues
2,0 ml Sammeltube stellen.
4. Restliche Probe auf die Säule (lila) geben. Den Deckel verschließen und bei 10.000
x g (12.000 rpm) für 1 Minute zentrifugieren.
Hinweis: Falls der Überstand nicht komplett durch die Membran zentrifugiert
wurde, nochmals bei höherer Geschwindigkeit zentrifugieren oder die
Zentrifugationszeit verlängern.
Das Sammeltube mit dem Durchfluss verwerfen.
5. Zentrifugationssäule in ein neues 2,0 ml Sammeltube stellen. Zentrifugationssäule
öffnen und 500 µl Waschpuffer IT zugeben. Den Deckel verschließen und bei
10.000 x g (12.000 rpm) für 1 Minute zentrifugieren. Das Sammeltube mit dem
Durchfluss verwerfen. Zentrifugationssäule in ein neues 2,0 ml Sammeltube
stellen.
6. Zentrifugationssäule öffnen und 650 µl Waschpuffer MT zugeben. Den Deckel
verschließen und bei 10.000 x g (12.000 rpm) für 1 Minute zentrifugieren. Das
Sammeltube mit dem Durchfluss verwerfen. Zentrifugationssäule in ein neues
2,0 ml Sammeltube stellen.
7. Bei 10.000 x g (12.000 rpm) für 3 Minuten zentrifugieren, um alle Ethanol-Reste
vollständig zu entfernen. Das Sammeltube mit dem Durchfluss verwerfen.
Zentrifugationssäule in ein 1,5 ml Elutionstube stellen.
8. Zentrifugationssäule vorsichtig öffnen und 60 µl – 100 µl RNase-freies Wasser
zugeben. Bei Raumtemperatur für 2 Minuten inkubieren, dann bei 8.000 x g (10.000
rpm) für 1 Minute zentrifugieren. Für eine max. Ausbeute an RNA können zwei
Elutionsschritte mit gleichen Volumina Puffer (z.B. 30 µl + 30 µl) durchgeführt
werden.
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17Virus-RNA Isolation-Kit
Hinweis: Die RNA kann auch mit geringeren oder mit höheren Volumina
an Elutionspuffer eluiert werden als oben angegeben. Bei geringeren
Volumina an Elutionspuffer erhöht sich die Endkonzentration der
RNA. Die extrahierte RNA sollte bei 4 °C – 8 °C aufbewahrt werden.
Für Langzeitlagerung wird eine Temperatur von – 22 °C bis – 18 °C
empfohlen.
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18Virus-RNA Isolation-Kit
Protokoll 3:
Isolierung von viraler RNA aus Gewebeproben und Biopsien
(bis 20 mg)
Wichtiger Hinweis:
Füllen Sie vor Arbeitsbeginn die benötigte Menge RNase-freies Wasser in ein 1,5 ml
Reaktionstube ab und inkubieren Sie dieses bei 70 °C bis zum Elutionsschritt!
Stellen Sie die Lysepuffer SM/ Carrier Mix-Mischung wie oben beschrieben (S.5) her!
1. Bis zu 20 mg Gewebeprobe in kleine Stücke schneiden und in ein 1,5 oder 2,0 ml
Reaktionsgefäß geben. Eine 10%ige (w/v) Gewebe-Puffer-Suspension herstellen,
indem das zerschnittene Gewebe mit Hilfe kommerzieller Homogenisatoren (Bead-
basiert oder andere Methoden) in RNase-freiem Wasser oder PBS homogenisiert
wird.
2. Das Reaktionsgefäß bei maximaler Geschwindigkeit für 2 Minuten zentrifugieren,
um große Partikel zu entfernen. Den klaren, partikelfreien Überstand
weiterverwenden.
3. Ein neues 1,5 ml Reaktionsgefäß öffnen und 450 µl Lysepuffer SM/ Carrier Mix
zugeben. 150 µl der Probe sowie 20 µl Proteinase K zugeben. Durch
mehrmaliges Vortexen für insgesamt 10 Sekunden gründlich mischen und für 10
Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, möglichst unter Schütteln (z.B. in einem
Thermomixer). Falls ein kontinuierliches Schütteln nicht möglich ist, die Probe
während der Inkubation 3 - 4mal vortexen. Nach der Lyse das Reaktionsgefäß kurz
zentrifugieren, um das Kondensat vom Deckel zu entfernen.
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19Virus-RNA Isolation-Kit
4. 450 µl Bindepuffer WM zu der lysierten Probe geben und durch Vortexen oder
mehrmaliges Auf- und Ab-pipettieren gründlich mischen, bis eine homogene Lösung
entsteht.
Hinweis: Der Bindepuffer ist sehr viskös, daher vorsichtig pipettieren.
5. Eine Zentrifugationssäule in ein 2,0 ml Sammeltube stellen. 650 µl der Probe
auf die Säule (lila) geben. Den Deckel verschließen und bei 10.000 x g (12.000
rpm) für 1 Minute zentrifugieren.
Hinweis: Falls der Überstand nicht komplett durch die Membran zentrifugiert
wurde, nochmals bei höherer Geschwindigkeit zentrifugieren oder die
Zentrifugationszeit verlängern.
Das Sammeltube mit dem Durchfluss verwerfen.
6. Zentrifugationssäule in ein neues 2,0 ml Sammeltube stellen und die restliche
Probe auf die Säule geben. Deckel verschließen und bei 10.000 x g (12.000 rpm)
für 1 Minute zentrifugieren.
Hinweis: Falls der Überstand nicht komplett durch die Membran zentrifugiert wurde,
nochmals bei höherer Geschwindigkeit zentrifugieren oder die Zentri-
fugationszeit verlängern
Das Sammeltube mit dem Durchfluss verwerfen.
Zentrifugationssäule in ein neues 2,0 ml Sammeltube stellen.
7. Zentrifugationssäule öffnen und 500 µl Waschpuffer IT zugeben. Den Deckel ver-
schließen und bei 10.000 x g (12.000 rpm) für 1 Minute zentrifugieren. Das
Sammeltube mit dem Durchfluss verwerfen.
Zentrifugationssäule in ein neues 2,0 ml Sammeltube stellen.
8. Zentrifugationssäule öffnen und 650 µl Waschpuffer MT zugeben. Den Deckel ver-
schließen und bei 10.000 x g (12.000 rpm) für 1 Minute zentrifugieren. Das
Sammeltube mit dem Durchfluss verwerfen.
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20Virus-RNA Isolation-Kit
Zentrifugationssäule in ein neues 2,0 ml Sammeltube stellen.
9. Bei 10.000 x g (12.000 rpm) für 3 Minuten zentrifugieren, um alle Ethanol-Reste
vollständig zu entfernen. Das Sammeltube mit dem Durchfluss verwerfen.
Zentrifugationssäule in ein 1,5 ml Elutionstube stellen.
10. Zentrifugationssäule vorsichtig öffnen und 60 µl – 100 µl RNase-freies Wasser
zugeben. Bei Raumtemperatur für 2 Minuten inkubieren, dann bei 8.000 x g (10.000
rpm) für 1 Minute zentrifugieren. Für eine max. Ausbeute an RNA können zwei
Elutionsschritte mit gleichen Volumina Puffer (z.B. 30 µl + 30 µl) durchgeführt
werden
Hinweis: Die RNA kann auch mit geringeren oder mit höheren Volumina
an Elutionspuffer eluiert werden als oben angegeben. Bei geringeren
Volumina an Elutionspuffer erhöht sich die Endkonzentration der
RNA. Die extrahierte RNA sollte bei 4 °C – 8 °C aufbewahrt werden.
Für Langzeitlagerung wird eine Temperatur von – 22 °C bis – 18 °C
empfohlen.
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21Virus-RNA Isolation-Kit
Protokoll 4:
Isolierung von viraler RNA aus Wangenabstrichen
Wichtiger Hinweis:
Füllen Sie vor Arbeitsbeginn die benötigte Menge RNase-freies Wasser in ein 1,5 ml
Reaktionstube ab und inkubieren Sie dieses bei 70 °C bis zum Elutionsschritt!
Stellen Sie die Lysepuffer SM/ Carrier Mix-Mischung wie oben beschrieben (S.5) her!
1. Den Wangenabstrichtupfer in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß mit physiologischer Koch-
salzlösung (0,9% NaCl) geben. Für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Den Tupfer gründlich schütteln, ausdrücken und aus dem Gefäß entfernen.
Mit 150 µl der partikelfreien Probe weiterarbeiten.
2. Ein 1,5 ml Reaktionsgefäß öffnen und 450 µl Lysepuffer SM/ Carrier Mix
zugeben. 150 µl der Probe sowie 20 µl Proteinase K zugeben. Durch
mehrmaliges Vortexen für insgesamt 10 Sekunden gründlich mischen und für 15
Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, möglichst unter Schütteln (z.B. in einem
Thermomixer).
Falls ein kontinuierliches Schütteln nicht möglich ist, die Probe während der
Inkubation 3 - 4mal vortexen. Nach der Lyse das Reaktionsgefäß kurz
zentrifugieren, um das Kondensat vom Deckel zu entfernen.
3. 450 µl Bindepuffer WM zu der lysierten Probe geben und durch Vortexen oder
mehrmaliges Auf- und Ab-pipettieren gründlich mischen, bis eine homogene Lösung
entsteht.
Hinweis: Der Bindepuffer ist sehr viskös, daher vorsichtig pipettieren.
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22Virus-RNA Isolation-Kit
4. Eine Zentrifugationssäule in ein 2,0 ml Sammeltube stellen. 650 µl der Probe
auf die Säule (lila) geben. Den Deckel verschließen und bei 10.000 x g (12.000
rpm) für 1 Minute zentrifugieren.
Hinweis: Falls der Überstand nicht komplett durch die Membran zentrifugiert
wurde, nochmals bei höherer Geschwindigkeit zentrifugieren oder die
Zentrifugationszeit verlängern.
Das Sammeltube mit dem Durchfluss verwerfen.
5. Zentrifugationssäule in ein neues 2,0 ml Sammeltube stellen Zentrifugationssäule
öffnen und 500 µl Waschpuffer IT zugeben. Den Deckel verschließen und bei
10.000 x g (12.000 rpm) für 1 Minute zentrifugieren. Das Sammeltube mit dem
Durchfluss verwerfen.
Zentrifugationssäule in ein neues 2,0 ml Sammeltube stellen.
6. Zentrifugationssäule öffnen und 650 µl Waschpuffer MT zugeben. Den Deckel ver-
schließen und bei 10.000 x g (12.000 rpm) für 1 Minute zentrifugieren. Das
Sammeltube mit dem Durchfluss verwerfen.
Zentrifugationssäule in ein neues 2,0 ml Sammeltube stellen.
7. Bei 10.000 x g (12.000 rpm) für 3 Minuten zentrifugieren, um alle Ethanol-Reste
vollständig zu entfernen. Das Sammeltube mit dem Durchfluss verwerfen.
Zentrifugationssäule in ein 1,5 ml Elutionstube stellen.
8. Zentrifugationssäule vorsichtig öffnen und 60 µl – 100 µl RNase-freies Wasser
zugeben. Bei Raumtemperatur für 2 Minuten inkubieren, dann bei 8.000 x g (10.000
rpm) für 1 Minute zentrifugieren. Für eine max. Ausbeute an RNA können zwei
Elutionsschritte mit gleichen Volumina Puffer (z.B. 30 µl + 30 µl) durchgeführt
werden
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Hinweis: Die RNA kann auch mit geringeren oder mit höheren Volumina
an Elutionspuffer eluiert werden als oben angegeben. Bei geringeren
Volumina an Elutionspuffer erhöht sich die Endkonzentration der
RNA. Die extrahierte RNA sollte bei 4 °C – 8 °C aufbewahrt werden.
Für Langzeitlagerung wird eine Temperatur von – 22 °C bis – 18 °C
empfohlen.
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Troubleshooting
Problem / mögliche Ursache Bemerkungen und Vorschläge
Verstopfte Zentrifugationssäule
Ungenügende Lyse und/oder zu viel Lysezeit verlängern.
Ausgangsmaterial
Zentrifugationsgeschwindigkeit erhöhen.
Nach der Lyse zusätzlich Zentrifugieren,
um unlysiertes Material zu entfernen.
Weniger Ausgangsmaterial einsetzen.
Niedrige Ausbeute
Ungenügende Lyse Lysezeit verlängern.
Weniger Ausgangsmaterial einsetzen.
Säule nicht überladen!
Unvollständige Elution Inkubationszeit mit RNase-freiem Wasser
verlängern oder Elutionsschritt
wiederholen.
Elution mit höherem Volumen RNase-
freiem Wasser durchführen.
Unzureichendes Mischen mit Auf gründliches Mischen der Probe mit
Bindepuffer WM Bindepuffer WM achten
Niedrige Konzentration der
extrahierten viralen RNA
Zu viel Elutionspuffer Elution mit niedrigerem Volumen RNase-
freiem Wasser durchführen.
Keine Carrier RNA zugegeben Carrier Mix wie im Protokoll beschrieben
zur Probe zugeben.
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Technische Daten
______________________________________________________________________
Versand: bei Raumtemperatur
Lagerung: Das Bio&SELL Virus RNA Kit sollte trocken und bei Raumtemperatur (14°
– 25°C) gelagert werden. Unter diesen Bedingungen ist es mindestens 12
Monate stabil. Vor jeder Nutzung sollten alle Komponenten
Raumtemperatur haben. Kristalle, die sich eventuell während der
Lieferung bzw. Lagerung gebildet haben, können durch vorsichtiges
Erwärmen gelöst werden.
Beachten Sie bitte die weiteren Informationen zur Lagerung (S.2).
Sicherheitshinweis: Dieses Produkt sollte nur von Personen verwendet werden,
die Routine in Laboranwendungen haben. Es sollte laborübliche Schutzkleidung wie
Kittel, Handschuhe und Schutzbrillen getragen werden. Bei Kontakt mit Haut und Augen
sollten die betroffenen Stellen umgehend mit Wasser gewaschen bzw. ausgespült
werden.
Anwendungshinweis: In bestimmten Ländern sind einige Anwendungen, für die
dieses Produkt eingesetzt werden kann, patentrechtlich geschützt. Da durch den Kauf
keine Lizenzen erworben werden, kann abhängig vom Anwendungsland und der
Anwendung der Erwerb entsprechender Lizenzrechte erforderlich sein.
Qualitätskontrolle und technische Unterstützung
Alle Produkte von Bio&SELL GmbH werden umfassenden Qualitätskontrollen
unterzogen. Dadurch wird gewährleistet, dass sie bei vorschriftsmäßiger Anwendung
einwandfrei funktionieren. Wir behalten uns das Recht vor, Änderungen zur
Verbesserung der Durchführung und am Design vorzunehmen.
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26Virus-RNA Isolation-Kit
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