Neue gentechnische Verfahren - Dr. Eva Gelinsky Interessengemeinschaft für gentechnikfreie Saatgutarbeit (IG Saatgut)

Neue
gentechnische
Verfahren
Dr. Eva Gelinsky
Interessengemeinschaft für gentechnikfreie
Saatgutarbeit (IG Saatgut)

Technik

           Verschiedene Verfahren
           CRISRP-Cas
           Funktionsweise
           SDN1, SND2, SDN3
           Mögliche Veränderungen
           Potential

Neue gentechnische Verfahren
Verschiedene Verfahren
besonders im Fokus „Genome Editing“

  • Zink-Finger-Nuklease-Technologie (ZFN-1/2/3) *
  • Oligonukleotid-gesteuerte Mutagenese (OgM) **
  • TALEN ***
  • CRISPR-Cas ****!!

CRISPR-Cas

• Das CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic
  Repeats)/Cas (CRISPR-associated)-System wurde in Bakterien
  entdeckt und dient dort der Immunabwehr gegen eindringende
  Viren.
• System kann auch als molekularbiologische Methode genutzt &
  in verschiedenen Organismen angewandt werden.
• Labor: zielgerichtet Veränderungen am Erbgut eines Organismus
  vornehmen.

Gentechnik?
        Was war das noch mal?

Wie funktioniert CRISPR-Cas?

Wenn der Doppelstrangbruch erfolgt ist...

kommt es zur...

   → 3 Möglichkeiten: SDN-1, SDN-2, SDN-3

Site-Directed Nuclease-1 (SDN-1)

                               Herstellung des ursprünglichen
                               Zustands oder fehlerhafte
                               Reparatur der DNA durch NHEJ
                               = „Knock-out“ -Pflanzen

                               NHEJ = Non-homologous end joining

➢ 90% der Anwendungen im Pflanzenbereich

Site-Directed Nuclease-2 (SDN-2)

                         Eine kürzere DNA-Vorlage wird
                         mit in die Zelle eingebracht.
                         Ist bis auf die gewünschte
                         Veränderung (orange) dem
                         Bereich der Zielsequenz
                         identisch.
                         Durch die HDR-Reparatur soll sie
                         ins Erbgut eingebaut werden.

                         HDR: Homology directed repair

Site-Directed Nuclease-3 (SDN-3)
                        Eine längere DNA-Vorlage wird
                        mit in die Zelle eingebracht.
                        Ist bis auf die gewünschte
                        Veränderung (orange) dem
                        Bereich der Zielsequenz
                        identisch.
                        Durch die HDR-Reparatur soll
                        sie ins Erbgut eingebaut
                        werden.

                        HDR: Homology directed repair

Mögliche Veränderungen durch CRISPR-Cas
Gene können...

        ... an- oder ausgeschaltet...
        ... in ihrer Wirkung verändert...
        ... entfernt...
        ... anders abgelesen...
        ... neu ins Erbgut eingefügt...

                                            werden.

Potential von CRISPR-Cas

→ Mehr und neue Möglichkeiten, präzisere
Veränderungen am Erbgut vorzunehmen.

→ In sehr kurzer Zeit & mit wenig Aufwand können
Organismen entwickelt werden, die eine neue
Kombination von Veränderungen im Erbgut tragen.

Potential von CRISPR-Cas?

"Crispr’s cut-and-paste function doesn’t really work yet in
plants. Cutting works. But inserting a new strand of DNA, not
so much.”

Quelle: https://www.wired.com/story/gene-editing-food-climate-change/

Potential von CRISPR-Cas?

„So einfach das beliebte Gen-Editing-Tool CRISPR-Cas9 das
Genom verändert, es ist immer noch etwas klobig und
anfällig für Fehler und unbeabsichtigte Effekte. (...) Prime
Editing* verbessert die Chancen der Forscher, nur die
gewünschten Bearbeitungen zu erhalten, anstatt eine
Mischung aus Änderungen, die sie nicht vorhersagen
können.“
Quelle: https://www.nature.com/articles/d41586-019-03164-5 (eigene Übersetzung)

* Prime Editing: Verfahren bei dem nur noch ein Strang der DNA „geschnitten“ wird. Zelleigene
Reparaturmechanismen sollen umgangen werden → zu fehleranfällig!

Rechtliche Lage

                   EuGH Urteil
                   Rechtliche Situation
                    global?

→ Genome Editing erfordert klassisches gentechnisches Verfahren!

Quelle: Testbiotech 2019: Am I regulated? S. 9

Urteil des Europäischen Gerichtshofes

1. Mit neuen gentechnischen Verfahren erzeugte Organismen sind
   gentechnisch veränderte Organismen (GVO) und fallen in den
   Anwendungsbereich des EU-Gentechnikrechts.

2. EuGH-Richter: NUR solche Mutagenese-Verfahren sind vom
   Gentechnikrecht ausgenommen, die „herkömmlich bei einer Reihe
   von Anwendungen angewandt wurden und seit langem als sicher
   gelten“.

→ Regulierung von ALLEN neuen Gentechnik-Verfahren
gemäß Freisetzungsrichtlinie 2001/18.

Die rechtliche Situation global?
USA, Argentinien, Brasilien, Japan
    → Keine spezielle Zulassung, Risikoprüfung, Kennzeichnung für genom-editierte
    Pflanzen!
Australien
    Seit November 2019 von der Regulierung ausgenommen:
    → SDN-1, RNAi, Pflanzen, in denen, nach einer gentechnischen Veränderung, keine
    „Fremd“-DNA mehr nachweisbar ist.
China → Regulierungsfrage noch offen!
    Chinesische Bevölkerung gilt als gentechnikkritisch
    Aber: Chinesische Regierung investiert Milliarden in Biotech
    Syngenta/ChemChina setzen auf Gentechnik und erwarten – im grossen, weiter
    wachsenden chinesischen Markt – entsprechende Gewinne

Risiken und Nebeneffekte

                            Risiken CRISPR-Cas
                            Off-target Effekte
                            On-target Effekte
                            Wissenslücken
                            Vorsorgeprinzip

Risiken von CRISPR-Cas
Ungewollte Auswirkungen auf 3 Ebenen möglich:

  • Folgen des Eingriffs in die Zelle?
  • Folgen des Eingriffs auf den Gesamtorganismus?
  • Wie verhält sich der neuartige Organismus in der
    Umwelt, mit der er interagiert?

Welche Nebeneffekte sind u. a. bekannt?
• Off-target Effekte
• On-target Effekte
• Bildung veränderter Proteine
• Weitreichende Umgestaltung des Erbguts

Welche Nebeneffekte sind u. a. bekannt?
• Off-target Effekte
CRISPR-Cas kann (zusätzlich) an falschen Stellen des
Erbguts schneiden.

• On-target Effekte
• Bildung veränderter Proteine
• Weitreichende Umgestaltung des Erbguts

                      Anderson, K. R. (2018). 15(7), 512-514. doi: 10.1038/s41592-018-0011-5

Zu wenig Daten!

→ Zu wenig Daten!

Welche Nebeneffekte sind u. a. bekannt?
• Off-target Effekte
• On-target Effekte
Es können ungewollte DNA-Fragmente in der Zielsequenz
eingebaut werden (z. B. Fragmente der DNA der
Genschere oder des Vektors).

• Bildung veränderter Proteine
• Weitreichende Umgestaltung des Erbguts

             Carlson et al. (2016). Nature Biotechnology, 34, 479–481. https://doi.org/10.1038/nbt.3560

On-target Effekte – Hornlose Kühe
• University of Minnesota & Recombinetics (Patent)
• Via TALENs POLLED Gen in Milchkühe eingefügt (Hornlosigkeit)
• Aushängeschild für Genom Editierte Tiere:
     ➢ Erfolgreiche Editierung
     ➢ Natürliche Eigenschaft
       in Kühen
     ➢ Vermeiden von Enthornung

     Weshalb regulieren?
 Carlson et al. (2016). Nature Biotechnology, 34, 479–481. https://doi.org/10.1038/nbt.3560

On-target Effekte – Hornlose Kühe
• 2019 hat die US Behörde für Lebens- und Arzneimittel (FDA) per Zufall
  herausgefunden, dass sich bakterielle DNA (Plasmidvektor) in die
  Zielregion der beiden Rinder eingeschleust hatte.
• Die bakterielle DNA wurde auch an einige Nachkommen weitervererbt.
• Die unerwünschte DNA enthielt Antibiotikaresistenz-Gene!
   → Auswirkung auf Darmbakterien der Rinder?
Genome Editing ≠ schnellere Variante der traditionellen Züchtung
   → Prozess (nicht nur Produkt) muss reguliert werden!

Welche Nebeneffekte sind u. a. bekannt?
• Off-target Effekte
• On-target Effekte
• Bildung veränderter Proteine
Durch die gewünschte Veränderung am Erbgut können
Proteine entstehen, die in ihrer Struktur ungewollt
verändert sind.

• Weitreichende Umgestaltung des Erbguts

Quellen: Kapahnke et al. (2016). RandoCells, 5(4), 45. https://doi.org/10.3390/cells5040045
Lalonde et al. (2017). PLOS ONE, 12(6), e0178700. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0178700

Welche Nebeneffekte sind u. a. bekannt?
 • Off-target Effekte
 • On-target Effekte
 • Bildung veränderter Proteine
 • Weitreichende Umgestaltung des Erbguts
 Grosse Deletionen (Löschungen) und Umkehrungen im
 Bereich der Zielsequenz wurden in Mauszellen und
 humanen Zellen nachgewiesen.

Quelle: Kosicki et al. (2018). Nature Biotechnology, 36(8), 765–771. https://doi.org/10.1038/nbt.4192

Und wenn alles „nach Plan“ läuft?
Non-target effects from on-target alteration (Beispiele):
• Beim Menschen
• Bei Pflanzen
• Bei Tieren

Und wenn alles „nach Plan“ läuft?
Non-target effects from on-target alteration (Beispiele):
• Beim Menschen
   ➢ CCR5 gene: AIDS Resistenz und kürzere
     Lebenserwartung?

• Bei Pflanzen
• Bei Tieren

 Quelle: Wei & Nielsen(2019). Nature Medicine, 25(6), 909–910. https://doi.org/10.1038/s41591-019-0459-6

Und wenn alles „nach Plan“ läuft?
Non-target effects from on-target alteration (Beispiele):
• Beim Menschen
• Bei Pflanzen
➢ Veränderter Nährstoffgehalt → höhere Attraktivität
  für Schädlinge?
• Bei Tieren

Und wenn alles „nach Plan“ läuft?
Non-target effects from on-target alteration (Beispiele):
• Beim Menschen
• Bei Pflanzen
• Bei Tieren
   ➢ Mstn KO (Doppelmuskeltiere) bringt verschiedene
     Gesundheitsprobleme mit sich

Zur Frage der Nachweisbarkeit

                                ➢ ENGL Bericht

                                ➢ Gesetzgebung & Verantwortung
                                  Hersteller

                                ➢ Matrix-Ansatz

                                ➢ Dokumentationssysteme

                                ➢ Big-Data etc.

Europäisches Netzwerk der GVO Laboratorien
   (ENGL)
  Nachweis z. Z. nur möglich wenn:
  1. vorgängig Informationen über die veränderte Genom-Sequenz,
  2. ein validiertes Nachweisverfahren und
  3. zertifiziertes Referenzmaterial ... vorhanden sind.
  Verfahren zum Nachweis unbekannter genomeditierter Produkte –
  müssen teilweise noch (weiter-)entwickelt werden – benötigen
  mehr Zeit und Ressourcen der GVO-Labore und könnten die
  Markteinführung verzögern.
  → Politischer Entscheid!

Quelle: ENGL (2019). Detection of food and feed plant products obtained by new mutagenesis techniques

Verantwortung der Hersteller
Nach dem EU Gentechnikgesetz Verantwortung der Hersteller
Referenzmaterial und Nachweisverfahren zu liefern.

Nach dem Gentechnikgesetz (D) zudem:
• Wahlfreiheit darf nicht beeinträchtigt werden
• Trennung Warenfluss muss gewährleistet werden
• Inverkehrbringer muss GVOs kennzeichnen

       → Regulierung als GVO zentral!

Was ist mit illegalen Importen?

Grössere, spezifische Veränderungen (InDels*) können mit
herkömmlichen Sequenzierungsverfahren nachgewiesen werden.

→ Was ist mit Punktmutationen und kleinen InDels (SND-1)?

Können nachgewiesen werden!
→ Frage ist: Herkunft der Punktmutation?

*Insertion oder Deletion

Matrix-Ansatz
  • Nachweis der gewünschten Veränderung
  • Art, Häufigkeit und Ort der Mutation(en)
  • Narben und Signaturen im Genom → in-vitro Mutagenese
  • Rückstände der Gentransfersysteme → Gentechnik
  • Off-Target Effekte/Muster → Genome Editing
  • Gewünschte Änderung Nähe PAM Sequenz → CRISPR/Cas

  → Durchsetzung dieses Ansatzes erfordert politischen Willen

Quelle: Yves Bertheau (2019). New Breeding Techniques: Detection and Identification of the Techniques and
Derived Products

Weitere Ansätze...

• Dokumentationssysteme / Trennung der Warenflüsse (wie bei Labels,
  z. B. Bio üblich).
• Informationen aus Patenten.
• Big Data-Ansätze, Data-Mining, künstliche Intelligenz, Deep-Learning-
  Algorithmen, künstliche neuronale Netzwerke,
  „Entscheidungsunterstützungswerkzeuge“ (Decision Support
  Systems) etc.
• Auf nationaler Ebene arbeiten verschiedene Labore an
  Nachweisverfahren.

Forschung und Entwicklung

                            ➢ Pflanzen
                            ➢ Anbau
                            ➢ Entwicklung

Erzeugte Pflanzeneigenschaften
Alte Gentechnik:
99% der kommerziell angebauten GV-Pflanzen sind
herbizid- und/oder insektenresistent
→ zunehmend beides

Erzeugte Pflanzeneigenschaften
Neu/Genome Editing
  • Herbizidresistenzen bleiben aktuell.
  • Veränderter Stoffwechsel/Nährstoffzusammensetzung (z. B.
    Öle, Stärke, Gluten).
  • Industrielle Anwendungen (z.B. Biotreibstoffe,
    Lagerung/Verarbeitung).
  • Resistenzen gegen diverse Krankheiten (Bakterien, Viren,
    Pilze).
  • Toleranzen gegen abiotische Stressfaktoren (z. B.
    Trockenheit).

Pflanzen im Anbau
• RAPS, Herbizid-tolerant (OgM) / CIBUS

   Seit 2015 im Anbau (USA, seit 2018 Kanada). Öl wird
   seit 2016 vermarktet.

• SOJA mit veränderter Fettsäurezusammensetzung
  (TALEN) / CALYXT

   Seit 2018 im Anbau (USA). Öl wird seit Anfang 2019
   vermarktet.

Die gv-Sojabohnen wurden
2019 auf ca. 14.500ha
angebaut (USA).

Das Öl wird über Sysco
gehandelt.

Sysco = einer der weltweit
grössten Lieferanten für
Lebensmittel.

Sysco beliefert Restaurants,
Krankenhäuser, Schulen,
Universitäten, Hotels und Fast-
Food Ketten.

Pflanzen in Entwicklung u. a.

• MAIS, Wachsmais (CRISPR) / DuPont Pioneer

   Seit 2016 im Freisetzungsversuch (USA)
   Kommerzialisierung geplant ab 2021

• Weizen, erhöhter Ballaststoffgehalt (TALEN) / CALYXT

   Im Freisetzungsversuch (USA)
   Kommerzialisierung geplant ab 2022       usw. usw.

Erzeugte Pflanzeneigenschaften
• Probleme der alten Gentechnik werden nicht adressiert:
  Entwicklung von Resistenzen, Pestizideinsatz etc.
• Alte Versprechen: z. B. Trockenheitstoleranz. Aber: Komplexe
  Eigenschaften lassen sich auch mittels Genome Editing
  (derzeit) nicht erzeugen.
• Verschiedene Eigenschaften lassen sich mit konventionellen
  Methoden züchten (z. B. High-oleic Sonnenblumen – s. GZPK).
• Pflanzen mit verändertem Nährstoffgehalt: Auswirkungen auf
  die menschliche Gesundheit?

Ausblick

            Welche Landwirtschaft
             brauchen wir?
            Welche Züchtung brauchen
             wir?
            Was fordern wir?

CRISPR = Lösung?

CRISPR = Lösung?

Sorte Topaz (im Bioanbau sehr beliebt): Seit 2007 Durchbruch der
monogenen Schorfresistenz

Statt einseitiger Fokussierung auf einzelne
Techniken...
... sollte die Frage diskutiert werden: Welche Landwirtschaft
brauchen wir, um den zukünftigen Herausforderungen zu
begegnen?
Erst dann kann geklärt werden: Welche Züchtung benötigen wir?
➢ DIE Lösung gibt es nicht!
➢ Wir benötigen eine Vielfalt der Ansätze und Strategien. Diese
kann es aber nur geben, wenn die Alternativen nicht massiv
behindert werden – z. B. durch:
       • Kontaminationsrisiken
       • Patentverletzungsklagen
       • einen weiteren Verlust der Agrobiodiversität.

Was ist – aus unserer Sicht – zu tun?
• Risikobewertung, Regulierung & Kennzeichnung der neuen
  Verfahren → Wahlfreiheit sicherstellen!
• Alternativen ausbauen: Es braucht mehr unabhängige,
  gemeinnützige Pflanzen- und Tierzüchtung.
   → Finanzierungsfrage klären!
• Agrarökologische Forschung ausbauen.
• Patentrecht ändern: Verbot der Patentierung konventionell
  gezüchteter Pflanzen/Tiere endlich durchsetzen.
• Über das Thema aufklären und die weitere Entwicklung kritisch
  begleiten.

CRISPR auch
   für Bio?

Quelle: Lebensmittelzeitung 6/2018

CRISPR = Gentechnik ≠ Bio!

Quelle: https://www.ifoam.bio/en/news/2018/01/11/organic-food-and-farming-movement-calls-regulation-new-genetic-engineering