Ressourceneffiziente Produktionsverfahren für PHB-Biokunststoffe - BayBiotech
←
→
Transkription von Seiteninhalten
Wenn Ihr Browser die Seite nicht korrekt rendert, bitte, lesen Sie den Inhalt der Seite unten
Projektverbund Ressourcenschonende Biotechnologie in Bayern Abschlusspräsentation 22. November 2018 Ressourceneffiziente Produktionsverfahren für PHB-Biokunststoffe Prof. Dr. Thomas Brück Dr. Norbert Mehlmer Technische Universität München Fakultät für Chemie/ Werner Siemens-Lehrstuhl für Synthetische Biotechnologie
Einleitung
Hintergrund: Poly-(R)-3 hydroxybutyrat (PHB)
Vorteile:
Biologischer Ursprung
Biologisch abbaubar
Weit verbreitet in Bakterien
Hohe Produktausbeute Chirales Zentrum
(60 - 90 % / TM)
Alternative zu auf Erdöl basierenden Kunststoffen
Nachteile:
Hohe Kristallinität
Spröde und steif
Hoher Schmelzpunkt (170°C)
Aufwändige und technisch schwierige Produktion
2
Zielsetzung
Ressourceneffiziente Produktionsverfahren für PHB-Biokunststoffe
Produktion von ataktischem Poly-(R/S)-3-hydroxybutyrat (P-R/S-3HB) mit ähnlichen
Eigenschaften wie konventionelle Kunststoffe
Verwendung von erneuerbaren Ressourcen (Kleie)
Stamm- und Prozessoptimierung zur Herstellung des neuen PHB-Kunststoffs
Weizenkleie
Hydrolyse Stammentwicklung
Verwendung von: Optimierter
Freisetzung von: E. coli-Stamm:
Bioprozess: Glucose
Glucose Produktion PHB
Xylose
Xylose
Reststoff Neues PHB
3
Ziele
Verwendung von Kleie
Warum Kleie als Rohstoff ?
Aus erneuerbaren Ressourcen (Kleie-Hydrolysat)
Nicht auf Erdöl-Basis
Kostengünstiges Nebenprodukt
E. coli
Wachstumsmedium
Kleie-Hydrolysat
Kleie
Enzymatische Hydrolyse
Reststoff
4
Vorgehensweise
Nachhaltige Fermentationsgrundlage
Enzymatische Hydrolyse:
Cellulasen
Pectinasen
Hemi-Cellulasen
Kleie (Weizen)
Zusammensetzung:
Glucose (Hexose)
Xylose (Pentose)
Arabinose (Pentose)
…
Problem:
Zuckerzusammensetzung des
Hydrolysats Gleichzeitige Fermentation
5
Vorgehensweise
Parallele Fermentation von Hexosen und Pentosen
Wachstum (OD=optische Dichte, schwarz) von E. coli in einem Wachstums-
medium, das drei Zucker beinhaltet: Xylose (blau), Arabinose (lila), und Glucose
(grün). Links: wild-typ E. coli. Rechts: ptsG Knockout.
ptsG Knockout Gleichzeitige Verwertung von Glucose und Xylose
Abb.: Xia et al., 2012 6
Vorgehensweise
Verstärkter Xylose Metabolismus zur gesteigerten 3HB Produktion
Pentose-Phosphate-Weg „Dahm”-Weg
Üblicher Weg Abkürzung
Xylose Xylose
D-Xylose Isomerase D-Xylose
Dehydrogenase
Xylulose Xylonate
D-Xylulokinase Xylonate
Dehydratase
Xylulose-5-Phosphate 2-keto-3-deoxy-
Xylonate
Transketolase Aldolase
Transaldolase Eingang zur Glycolyse Glycolaldeyd
Glyceraldehyde-3-Phosphat Pyruvat
+Fructose-6-Phosphat
Pyruvat Dehydratase Komplex
Glycolyse
Acetyl-CoA
Pyruvat
Pyruvat Dehydratase
Komplex
Acetyl-CoA
7
Ergebnisse
Assemblierung des kompletten Dahm-Wegs
Xylose
D-Xylose
Dehydrogenase
Xylonate
Xylonate Dehydratase
2-keto-3-deoxy- Hat keine positiven Klone
Xylonate Klonierung
Aldolase
Gylcolaldeyd ergeben
Pyruvat
Pyruvate Dehydratase Komplex
Acetyl-CoA
Herausforderung: Optimierung der Expressionsstärke: RBS
8
Ergebnisse
Assemblierung des kompletten Dahm-Wegs
lacI Promoter P 1
RBS 1
lacI XylC
Xylose
D-Xylose CDS 4
Dehydrogenase
Terminator 2
Xylonate
Promoter P 1
Xylonate Dehydratase
RBS 1
2-keto-3-deoxy-
Xylonate
Klonierung pET28c XylC Xdh Xdh1
Aldolase
Gylcolaldeyd
XylC/Xdh1
Pyruvat
rop Terminator 2
Pyruvate Dehydratase Komplex
Acetyl-CoA
Rep Origin 1
Rep Origin 2
aph(3')-Ia
IPTG-induzierte starke Expression: T7 RNA Polymerase
9
Neue Strategie zur Synthese von PHB
Stoffwechselweg zu PHB
Endogene Synthese von PHB (taktisch)
phbA: β-ketoacy-CoA Thiolase
phbB: Acetoacetyl-CoA Dehydrogenase
phbC: PHB Polymerase
Synthese des Designer PHB
3HB Ziel: 3HB
+ CoASH
thioesterase II
Neue Synthesestrategie Partiell
ataktisches
Abb. Ausschnitt: Madison und Huisman, 1999 PHB 10Ergebnisse: Produktion von 3HB
3HB Produktionsstamm
E. coli
Produktionsstamm
Plasmid
Abgeschlossen: Nächsten Schritte:
Plasmid mit phbA und phbB Ko-Expression mit dem Dahm-Plasmid
Fermentation in E. coli und Expressions-Optimierung
Erste Fermentationen ~ 0.14 g/L 3HB im Genomische Integration
synthetischen Medium
3HB-Nachweismethode
11Ergebnisse: Produktion von 3HB
3HB Produktionsstamm
E. coli
Produktionsstamm
Plasmid
Nach Stamm- und
Prozessoptimierung:
12 g/L 3HB
14
12
3HB Titer (g/L)
Abgeschlossen: 10
Plasmid mit phbA und phbB 8
Fermentation in E. coli 6
Erste Fermentationen ~ 0.14 g/L 3HB im 4
synthetischen Medium 2
3HB-Nachweismethode 0
In dieser Arbeit Martinez et al. 2015
12Ergebnisse: Produktion von 3HB
3HB Produktionsstamm: Kombination 3HB und Dahm-Weg
lacI T7
trc RBS 1
lacI XylC
CDS 4
Terminator 2
T71
Plasmid Plasmid RBS 1
pJBGT3RX pET28c XylC Xdh Xdh1
rop Terminator 2
Rep Origin 1
Cm
Rep Origin 2
aph(3')-Ia
3HB Produktion: Verbesserte Xylose-Verwertung
13Ergebnisse: Produktion von 3HB
3HB Produktionsstamm: Kombination 3HB und Dahm-Weg
Fermentation:
- Stamm: AF1000
- Messung: 3HB und OD600
14Ergebnisse: Produktion von 3HB
3HB Produktionsstamm: Kombination 3HB und Dahm-Weg
Fermentation:
- Stamm: AF1000
- Messung: 3HB und OD600
15Vorgehensweise
Neue synthetische Strategie zur Polymerisierung
Übersicht:
Lactonisierung
Ring-Öffnungspolymerisation
Ziel: R isotaktisch angereichert PHB
16Vorgehensweise: Lactonisierung
Biokatalytische Lactonisierung von 3-HB
Natives
Substrate
PL CD6 PL HS6
Substrat
(Funktionelle
Gruppe)
Ziel-
substrate
17Ergebnisse: Mutagenese
Strukturbasierte Mutagenese von PlaO1
C-Terminale Region
Substratspezifische
Bindung
Hauptansatzpunkt
zur gezielten
Mutagenese
Doppelsträngige ß-Helix Konserviertes Eisen-Bindemotiv
Abb.: Peer Lukat, 2011 18Ergebnisse: Mutagenese
Klonierung und Mutagenese von PlaO1
Ausschnitt Strukturmodell: Expressionsplasmid
PCR-basierte Mutagenese/Klonierung
PLaO1 Mutantenbibliothek
Identifizierte Ziele (rot) His-Tag Proteinreinigung
Arg251, Arg247 and Thr128 In vivo Nachweis
Aktivitätsnachweis mittels 3HB
Schnelle Durchmusterungsmethode
Abb.: Peer Lukat, 2011 19Ergebnisse: Mutagenese
Klonierung und Mutagenese von PlaO1
Hochdurchsatz-Nachweis
Ausschnitt Strukturmodell: (Schweppes assay)
• Ein Stamm mit möglicher
Identifizierte Ziele (rot) g-Butyrolactone Produktion
Arg251, Arg247 and Thr128 • Bestätigung mittels HPLC/NMR
• Evaluierung der P4HB
Polymereigenschaften
Abb.: Peer Lukat, 2011 20Vorgehensweise
Lipase-basierende Ringöffnungs-Polymerisation
Lipase
Lipase AP6
ß-Lactone Designer PHB
21Vorgehensweise
Optimierung der Produktausbeute
Wie lässt sich die
Ausbeute von
3HB steigern ?
Abb: Guevara-Martínez et al., 2015 22Vorgehensweise
Metabolische Flussanalyse und Optimierung der Produktivität
Metabolite,
Intermediat- Zellulärer
Proteine,
Fluss Phänotyp
Transkripte
13C 50
Abundance
12C Feed Messung
0
M1 M2 M3 M4 M5
Markierte Substrate Zellkultur Metabolische Markierung Analyse
Abb. Links: Yup Lee et al., 2004 23Zusammenfassung
PHB ist ein natürliches Biopolymer, das sich fermentativ einfach herstellen lässt
Biologisch schnell abbaubar
Nachhaltige Fermentationsgrundlage basierend auf Kleiehydrolysat
Verbesserte Verwertung von Xylose (Dahm-Weg)
Produktion von partiell ataktischem PHB durch eine neue Synthesestrategie durch
Biokatalytische Lactonisierung von 3HB zu g-Butyrolacton
Lipase-katalysierte Ringöffnungs-Polymerisation des Lactons
Metabolische Optimierung der Produktausbeute
Steigerung der 3HB Produktion
24Danksagung
Prof. Dr. Thomas Brück
Werner Siemens-Lehrstuhl für
Synthetische Biotechnologie
Technische Universität München
Fakultät für Chemie
Dr. Norbert Mehlmer
Dr. Daniel Garbe
Dr. Monika Fuchs
Dr. Farah Qoura
Dania Awad
Samer Younes
Prof. Dr. Rainer Buchholz
Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik
FAU Erlangen-Nürnberg
Koordinator: Projektverbund
Ressourcenschonende
Biotechnologie in BayernSie können auch lesen
