Remissionsspektrofotometrische Untersuchungen am Schweineherz mit dem EMPHO II SSK
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Aus dem Institut für Physiologie & Kardiologie
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Remissionsspektrofotometrische
Untersuchungen am Schweineherz
mit dem EMPHO II SSK
I NAUGURA L – D ISS ER TA TION
zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
Vorgelegt 2005
von Michael Thomas Hiller
geboren in Hechingen
2 _____________________________________________________________________________________________ Dekan: Prof. Dr. med. Josef Zentner 1. Gutacher: PD Dr. hum. biol. Michael Mück-Weymann MA 2. Gutachter: PD Dr. med. Leonhard Mohr Jahr der Promotion: 2005
3
_____________________________________________________________________________________________
....meinen Eltern Manfred und Irene Hiller
...meiner Schwester Stefanie Yvonne Hiller
4
_____________________________________________________________________________________________
„Quidquid agis, prudenter agas et respice finem.“
Was du tust, tue es klug und bedenke das Ende.
aus den „Gesta Romanorum“
5 INHALTSVERZEICHNIS
_____________________________________________________________________________________________
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG .......................................................................................................................7
1.1 Optische Verfahren in der medizinischen Diagnostik.....................................................7
1.2 Gewebefotometrie: ..........................................................................................................8
1.2.1 Optische Eigenschaften des Gewebes .........................................................................8
1.2.2 Bestimmung der Myoglobin-Oxygenierung im Gewebe ............................................9
1.2.3 Ausbreitung von Licht im Gewebe ...........................................................................10
1.2.4 Remissionsspektren:..................................................................................................12
1.3 Zielsetzung der Arbeit ...................................................................................................13
2 METHODIK ........................................................................................................................14
2.1 EMPHO II SSK.............................................................................................................14
2.1.1 Aufbau und Funktion ................................................................................................14
2.1.2 3D-Scanner System ...................................................................................................17
2.1.3 Auswertung ...............................................................................................................18
2.2 Perfusionsmodell...........................................................................................................21
2.2.1 Perfusionssystem .......................................................................................................21
2.2.2 Entnahme und Präparation der Herzen......................................................................23
2.2.3 Reperfusion ...............................................................................................................24
2.3 Versuchsablauf ..............................................................................................................25
2.4 Versuche zur Erhöhung der Auflösung.........................................................................26
2.5 Präparationstechnik und Etablierung des endgültigen Versuchsaufbaus......................27
2.5.1 Weiterentwicklung der Präparationstechnik .............................................................27
2.5.2 Weiterentwicklung der Lichtleiterhalterung .............................................................27
2.5.3 Verhinderung der Volumenzunahme des Organs durch die Füllung der Venae Thebesi.29
2.5.4 Besonderheiten bei der Verwendung von hämoglobinfreiem Perfusat.....................29
3 ERGEBNIS ..........................................................................................................................30
3.1 Verlaufsmessungen an einem fixen Punkt ....................................................................30
3.2 Beginn der Haupt-Studie und Versuchsablauf ..............................................................32
3.2.1 Versuchsumfang........................................................................................................32
3.2.2 Die Reperfusion der Organe im Labor ......................................................................32
6 INHALTSVERZEICHNIS
_____________________________________________________________________________________________
3.3 Auswirkungen veränderter Oxygenierungszustände auf funktionelle Strukturen im
Herzmuskelgewebe ...............................................................................................................33
3.3.1 Darstellung eines kompletten Versuchs ....................................................................33
3.3.2 Erkenntnisse über die Bedeutung der Lichtintensität bei den
Remissionsspektrofotometrischen Untersuchungen am Schweineherz ....................41
3.3.3 Die Myoglobinoxygenierung der Organe bei unterschiedlicher FIO2......................43
3.3.4 Ausgewählte 3D-Bilder aller Versuche.....................................................................45
3.4 Weitere Versuche unter modifizierten Bedingungen mit dem Ziel einer verbesserten
Auflösung ..............................................................................................................................55
4 DISKUSSION ......................................................................................................................60
4.1 Die Mikro-Lichtleiter-Remissions-Spektrofotometrie..................................................60
4.1.1 Reproduzierbarkeit ....................................................................................................60
4.2 Diskussion der Methodik: .............................................................................................61
4.2.1 Erhöhung der räumlichen Auflösung ........................................................................61
4.2.2 Detektionstiefe für versch. Lichtleiter-Anordnungen mit dem EMPHO ..................62
4.2.3 Bedeutung der Remissionsspektren ..........................................................................63
4.2.4 Diskussion des Versuchsaufbaus ..............................................................................64
4.2.5 Simultane Registrierung von Lichtintensität und Oxygenierung..............................64
4.2.6 Begrenzende Faktoren der Messgeschwindigkeit .....................................................64
4.2.7 „Reperfusion Injury“ .................................................................................................65
4.2.8 Unterschiede der Anatomie von Schweineherz und menschlichem Herz.................67
4.3 Schlussfolgerung und Ausblicke...................................................................................68
5 ZUSAMMENFASSUNG ....................................................................................................70
5.1 Hintergrund und Ziele: ..................................................................................................70
5.2 Methoden:......................................................................................................................70
5.3 Ergebnisse: ....................................................................................................................70
5.4 Schlussfolgerungen: ......................................................................................................70
6 LITERATURVERZEICHNIS ...........................................................................................71
7 ABBILDUNGSVERZEICHNIS ........................................................................................75
8 TABELLENVERZEICHNIS .............................................................................................77
9 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS.......................................................................................78
10 LEBENSLAUF ....................................................................................................................80
7 EINLEITUNG
_____________________________________________________________________________________________
1 EINLEITUNG
1.1 Optische Verfahren in der medizinischen Diagnostik
Für die medizinische Diagnostik sind Bildgebende Verfahren sehr hilfreich. Sie nutzen
physikalische Eigenschaften um Aussagen über die Morphologie oder Funktion der untersuchten
Gewebe zu machen. Bei den Bildgebenden Verfahren wie z.B. dem Ultraschall, werden die
verschiedenen Eigenschaften wie die Echogenität der unterschiedlichen Gewebe genutzt um aus
den reflektierten Ultraschallwellen ein Bild zu generieren, das dem Untersucher einen Eindruck
über die Verhältnisse im Inneren des menschlichen Körpers ermöglicht. Auch die
Remissionsspektrofotometrie kann Informationen über Zustände und Vorgänge im Körper
beziehungsweise im Gewebe in Bildern darstellen und somit dem Menschen zugänglich machen.
Sie nutzt die Absorption oder Streuung des in das Gewebe eingestrahlten Lichts, um aus dem
detektierten Licht nach entsprechender Bildverarbeitung zu einer aussagekräftigen Darstellung
zu kommen (2).
Klassische fotometrische Untersuchungen werden als Transmission in Küvetten durchgeführt.
Das Lambert-Beer’sche Gesetz beschreibt den Zusammenhang zwischen Absorption,
Konzentration und durchstrahlter Schichtdicke einer Lösung (37):
E = ε ×c×d
Die Extinktion (E) einer Lösung ist proportional zur Konzentration (c) der darin gelösten
lichtabsorbierenden Substanz, der Schichtdicke (d) der Lösung und dem molaren
Extinktionskoeffizienten ( ). Dies gilt nur unter der Voraussetzung, dass streng
monochromatisches Licht verwendet wird, d.h. das zur Messung der Absorption in der Probe
verwendete Licht darf nur eine Wellenlänge haben (37).
8 EINLEITUNG _____________________________________________________________________________________________ 1.2 Gewebefotometrie: 1.2.1 Optische Eigenschaften des Gewebes Die optischen Eigenschaften des Gewebes bilden die Grundlage für quantitative fotometrische Messungen. In lebendes Gewebe eingestrahltes Licht wird dort in Abhängigkeit von der Wellenlänge absorbiert und gestreut. Im Gewebe gilt das Lambert-Beer’sche Gesetz in dieser Form jedoch nur eingeschränkt, da durch das parallele Auftreten von Streu- und Absorptionsprozessen die tatsächliche Wegstrecke der einzelnen Fotonen nicht bestimmt werden kann. Aus diesem Grund wurde von Dümmler ein Auswertverfahren entwickelt, welches Lichtstreuung und Lichtabsorption klar voneinander trennt (4). Über eine Messung der remittierten Lichtintensitäten können somit Gewebefarbstoffkonzentrationen bestimmt werden. Das Verfahren basiert auf der 1931 veröffentlichten Kubelka-Munk Theorie (26), mit welcher sich die Lichtausbreitung in streuenden und absorbierenden Medien beschreiben lässt, die aber ursprünglich für die Berechnung von Farbanstrichrezepturen entwickelt wurde. Die Kompartimentierung der Zelle durch die Vielzahl an Membranen ist eine Voraussetzung für ihre einwandfreie Funktion. Diese Membranen und die Mitochondrien, die in einer Zelle vorkommen, stellen neben der Vielzahl an anderen Makromolekülen in unterschiedlicher Form und Größe die Hauptursache für die Absorption und die Streuung im Gewebe dar. Dafür ist vor allem die hoch geordnete räumliche Strukturierung der Phospholipid-Doppelmembran verantwortlich (5). Daher weisen diese Strukturen ein eher charakteristisches Streu- und Absorptionsverhalten auf. Man kann also sagen, dass Hämoglobin beziehungsweise Myoglobin, die dominanten Absorber im Gewebe, räumlich getrennt von den bedeutendsten Streuern, den Mitochondrien, sind (5). Ein weiteres Problem bei einer Beschreibung des Gewebes als optisches System ist die Vielzahl unterschiedlicher Messgrößen, die sich nicht in zeitlich stationärem Zustand befinden. Sie sind z.B. von äußeren Einflüssen wie Temperatur, Sauerstoffversorgung und ionaler Zusammensetzung ihrer Umgebung abhängig. Außerdem verändern subzelluläre Partikel in lebendem Gewebe, abhängig von ihrer Funktion und Aktivität, ständig ihre Form und Position, wodurch sich ihre Streueigenschaften verändern. Es sollte daher möglich sein, von den gemessenen Lichtspektren auf den Funktionszustand subzellulärer Partikel zu schließen (5).
9 EINLEITUNG _____________________________________________________________________________________________ 1.2.2 Bestimmung der Myoglobin-Oxygenierung im Gewebe Am Beispiel von Myoglobin, dem bedeutendsten Gewebefarbstoff im Muskelgewebe, soll der Kurvenverlauf des Absorptionsspektrums dargestellt werden. Trägt man gemäß dem Lambert- Beer’schen Gesetz die Extinktion gegen die Wellenlänge auf, so weist oxygeniertes Myoglobin zwei charakteristische Absorptionsbanden auf. Die Maxima dieser Banden liegen bei den Wellenlängen 544 nm und 580 nm. Bei der Untersuchung von desoxygeniertem Myoglobin beobachtet man eine einzige Absorptionsbande mit ihrem Maximum bei 558 nm (4). Diesen Sachverhalt zeigt Abbildung 1 am Beispiel der Extremwerte von Remissionsspektren am Schweinemyokard. Das Absorptionsverhalten des Myoglobins unterscheidet sich also je nach Oxygenierungszustand stark. Diese Tatsache kann man sich zunutze machen, um Aussagen über den Grad der Myoglobinoxygenierung zu treffen. Abb. 1 Extremwertspektren von oxygeniertem (rot) und desoxygeniertem (blau) Myoglobin Es sind die Extremwertspektren von oxygeniertem (rot) und desoxygeniertem (blau) Myoglobin einer remissionsspektrofotometrischen Oberflächenmessung am Schweineherz dargestellt. Deutlich sind die Maxima bei 544nm und bei 580nm der roten Kurve und bei 558nm der blauen Kurve zu erkennen.
10 EINLEITUNG _____________________________________________________________________________________________ Die im Gewebe auftretenden Oxygenierungszustände entsprechen jedoch selten den oben genannten Extremspektren, viel mehr resultiert ein Mischspektrum, das sich aus den beiden Extremspektren zusammensetzt. Es sollte also möglich sein, aus der Zusammensetzung der Spektren den Oxygenierungsgrad zu berechnen (4). Weitere Beispiele für stark absorbierende Farbstoffe im Gewebe sind Hämoglobin, Zytochrome oder NAD/NADH+. 1.2.3 Ausbreitung von Licht im Gewebe Nützlich wäre eine geschlossene Theorie für die Remissionsspektrofotometrie, die sowohl die Absorptions- als auch die Streu- und Reflektionsvorgänge an den verschiedenen subzellulären Strukturen im Gewebe beschreibt. Leider beschäftigen sich die nachfolgend aufgeführten Theorien nur mit Spezialfällen, für die sie Streuvorgänge erklären. Welche Theorie wann gilt, hängt davon ab, wie groß das streuende Teilchen im Verhältnis zur eintreffenden Wellenlänge ist. Abbildung 2 zeigt das Verhalten der unterschiedlichen Partikel bei der Streuung, in Abhängigkeit von der Teilchengröße. 1. Rayleigh - Streuung: (Durchmesser der Teilchen kleiner als 0,1 nm) Diese Theorie gilt für Teilchen, die viel kleiner als die Lichtwellenlänge sind (6). Sie beschreibt die Abstrahlungsrichtung von Licht nach einem Streuungsereignis an einem Teilchen und besagt: Licht wird nach dem Streuungsereignis in Richtung des einfallenden Strahls und entgegengesetzt in gleichen Teilen gestreut. Kurzwelliges Licht (blau) wird hierbei viel stärker gebrochen als langwelliges Licht (rot). Im Fall der Rayleigh Streuung erfolgt die winkelabhängige Verteilung des gestreuten Lichtes laut (31) nach der Beziehung: wobei den Winkel zwischen der Einfallsrichtung und der Emissionsrichtung des Lichtes angibt.
11 EINLEITUNG
_____________________________________________________________________________________________
2. Mie - Streuung: (Durchmesser der Teilchen im Bereich 10 bis 1000 nm)
Beschreibt die Vorgänge an Kugeln in der Größenordnung der Lichtwellenlänge (8, 11 - 13, 38,
39, 42).
Licht, das auf Teilchen im Bereich der Größenordnung von Lichtwellenlängen trifft, wird
hauptsächlich in Richtung des einfallenden Strahls gestreut.
Die üblicherweise verwendete Phasenfunktion zur Angabe der richtungsabhängigen Verteilung
des gestreuten Lichtes im Falle der Mie Streuung ist die Henvey-Greenstein Funktion:
bezeichnet hierbei einen Asymmetriefaktor, der den Grad der Abweichung von der Rayleigh
Streuung unter Berücksichtigung des Verhältnisses zwischen der Wellenlänge des einfallenden
Lichtes und der Partikelgröße angibt.
Abb. 2 Vergleich des Streuverhaltens von Partikeln in Abhängigkeit von der Teilchengröße
Die Abbildung zeigt das verschiedene Verhalten der Partikel bei der Streuung in Abhängigkeit von der
Teilchengröße in nm.
3. Geometrische Optik: (Durchmesser der Teilchen größer als 1000 nm)
Gilt für Teilchen, die viel größer als die Lichtwellenlänge sind.
Bei größeren Partikeln gilt die von Mie entwickelte Theorie zwar auch noch, es ist aber
einfacher, die Streuung durch die Theorie der geometrischen Optik, d. h. durch Brechung und12 EINLEITUNG _____________________________________________________________________________________________ Reflexion zu beschreiben. Sie besagt, dass Licht, welches auf eine Grenzschicht zwischen zwei Medien trifft, an dieser entweder reflektiert oder gebrochen wird. In Abbildung 3 sind diese verschiedenen Streuungsvorgänge dargestellt. Abb. 3 Streuungsverhalten von Teilchen mit einem Durchmesser größer als 1000 nm Die Abbildung zeigt Streuungsvorgänge für Teilchen, deren Durchmesser sehr viel größer als die Wellenlänge des einfallenden Lichts ist. „Jedoch ist all diesen Theorien gemeinsam, dass sie die Intensitätsverteilung des gestreuten Lichts in Abhängigkeit vom Beobachtungswinkel betrachten. Daraus wird das optische Verhalten der Teilchen bei verschiedenen Wellenlängen und bei unterschiedlichen Polarisationen des eingestrahlten Lichts bestimmt“ (5). 1.2.4 Remissionsspektren: Wird Licht ins Gewebe geschickt, so legt es häufig einen langen Weg zurück, bevor es wieder im Bereich der Eintrittsstelle heraustritt und vom Lichtleiter aufgenommen wird. Nur ein kleiner Teil wird direkt unter der Oberfläche rückgestreut und trifft so mit unveränderter spektraler Zusammensetzung wieder auf den Lichtleiter. Der größte Teil erfährt eine Vielzahl von Streuvorgängen bevor er wieder das Gewebe verlässt oder wird von Chromophoren absorbiert. So ist es auch zu verstehen, dass nur etwa 0,1% der eingestrahlten Lichtintensität zum Aufnahmesystem zurückgelangen. Die spektrale Zusammensetzung des rückgestreuten Lichts wird Remissions-Spektrum genannt (5). Die verschiedenen Möglichkeiten der Streuung und Absorption im Gewebe sind in Abbildung 4 dargestellt.
13 EINLEITUNG _____________________________________________________________________________________________ Abb. 4 Streuungsvorgänge im Gewebe Die Abbildung zeigt die verschiedenen Möglichkeiten, wie ein Foton im Gewebe gestreut beziehungsweise absorbiert werden kann. Für die Remissionsspektrofotometrie sind lediglich zwei der vier gezeigten Varianten relevant, denn nur Fotonen, die in Richtung auf den detektierenden Lichtleiter gestreut werden (hier rot und blau dargestellt) tragen zum Remissionsspektrum bei. Nach multipler Multipolstreuung (7) gelangt ein kleiner Teil der eingestrahlten Lichtintensität zur Oberfläche zurück. Diese Rückwärtsabstrahlung aller Streuzentren summiert sich zur Rückwärtsstreuung. Die Remissionsspektrofotometrie macht sich diesen Umstand zu nutze, denn mit dem Lichtleiter auf der Organoberfläche kann nur Licht, das rückgestreut und auf seinem Weg zur Oberfläche nicht absorbiert wurde, aufgefangen werden. 1.3 Zielsetzung der Arbeit In der vorliegenden Arbeit wurden die mit Hilfe eines Spektrofotometers festzustellenden Veränderungen des Herzmuskelgewebes unter verschiedenen Oxygenierungszuständen untersucht. Abhängig vom Oxygenierungsgrad des Gewebes zeigt sich eine Veränderung der rückgestreuten Lichtintensitäten. Es sollte also möglich sein, die funktionellen Strukturen zu identifizieren, welche hauptsächlich für die veränderten Streuungseigenschaften verantwortlich sind. Dadurch könnte man Rückschlüsse über deren Aktivitätszustände ziehen. Außerdem sollte die Myoglobinoxygenierung kleinster Oberflächenareale, in Abhängigkeit vom Sauerstoffgehalt der Perfusionslösung, nicht-invasiv simultan mit dem Spektrofotometer erfasst werden. Dazu wurde ein Modell gesucht, mit Hilfe dessen funktionsfähiges Herzgewebe untersucht und die durch funktionelle Strukturen ausgelösten Veränderungen dargestellt werden können. Diese sollten anschließend in dreidimensionalen Oberflächenbildern veranschaulicht werden.
14 METHODIK
_____________________________________________________________________________________________
2 METHODIK
2.1 EMPHO II SSK
2.1.1 Aufbau und Funktion
Das EMPHO II SSK besteht aus 4 funktionellen Bauteilen: einer Lichtquelle, einem
Mikrolichtleiter, einem Fotomultiplier als Lichtdetektor und einem datenverarbeitenden Bauteil
(9). Eine schematische Darstellung ist in Abbildung 5 gezeigt. Das Licht einer Xenon-
Hochdruck-Lampe wird von einem Linsensystem auf das Ende eines Lichtleiters fokussiert
(Abbildung 6 und 7). Über den Lichtleiter gelangt es ins Gewebe. Dort finden unterschiedliche
Streu- und Absorptionsvorgänge statt. Ein kleiner Teil des Lichts wird gerade so gestreut, dass er
am Eintrittspunkt wieder austritt und so vom detektierenden Lichtleiter aufgefangen werden
kann. Der detektierende Lichtleiter leitet das Licht über einen Flüssigkeitslichtleiter zu einer
rotierenden Interferenz-Filterscheibe mit einem Spektrum von 502nm bis 628nm im sichtbaren
Licht und einer Auflösung von 2nm. Durch die Filterscheibe wird das erfasste Licht in seine
Anteile aus den einzelnen Wellenlängen zerlegt. Je nach Winkelstellung hat die Filterscheibe ein
Bandpassverhalten für eine Wellenlänge beziehungsweise für ein schmales Wellenlängenband.
Durch die Rotation der Filterscheibe lässt sich somit sequentiell das gesamte Spektrum
aufnehmen (23). Eine Inkrementalgeberscheibe, welche auf derselben Achse montiert ist
ermöglicht die Decodierung der aktuellen Winkelstellung der Filterscheibe und damit auch die
Dekodierung der Wellenlänge. Das nun monochromatische Licht wird von einem Fotomultiplier
erfasst, dessen Signal durch einen Analog-Digital-Konverter umgewandelt und anschließend im
Computer verarbeitet und gespeichert wird. Die Umdrehungsgeschwindigkeit der Filterscheibe
bestimmt dabei die Aufnahmerate der Datenerfassung. In der vorliegenden Arbeit lag sie
zwischen 70 und 80 Spektren pro Sekunde.15 METHODIK _____________________________________________________________________________________________ Abb. 5 Schematische Darstellung des EMPHO II SSK XHL: Xenon-Hochdruck-Lampe FL: Flüssigkeits-Lichtleiter LS: Linsensystem M: Motor BL: Beleuchtender Lichtleiter PD: Positions Detektor DL: Detektierender Lichtleiter PM: Fotomultiplier IFS: Interferenz Filterscheibe TE: Triggereinheit 2.1.1.1 Lichtleiter Drei verschiedene Lichtleitertypen kamen zur Anwendung. Sie unterscheiden sich sowohl im Material, dem Faserdurchmesser als auch der Zahl der Fasern. Die Details der verwendeten Lichtleitertypen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Der erste Typ besteht aus einer beleuchtenden Faser und einer detektierenden Faser mit einem Durchmesser von jeweils 250µm. Ein Typ besitzt sieben Fasern mit einem Durchmesser von jeweils 250µm, wobei sechs beleuchtende Fasern um eine zentrale detektierende Faser angeordnet sind. Der dritte Typ besitzt ebenfalls sieben Fasern, allerdings mit einem kleineren Durchmesser von 70µm, was eine höhere Auflösung ermöglicht. Während die 250µm Fasern aus Kunststoff bestehen, was ihnen eine höhere Stabilität verleiht, sind die 70µm Fasern aus Glas, wodurch diese zwar leichter brechen können, aber durch deren geringen Durchmesser auch eine höhere räumliche Auflösung erreicht werden kann. Daher kann mit den Glaslichtleitern die Schrittweite noch weiter verringert werden (30).
16 METHODIK _____________________________________________________________________________________________ Abb. 6 Schematische Darstellung des zweifaserigen Lichtleiters Es ist ein zweifaseriger Lichtleiter gezeigt, bei dem die eine Faser als beleuchtende und die andere als detektierende Faser benutzt wird. Abb. 7 Schematische Darstellung des siebenfaserigen Lichtleiters Es ist ein siebenfaseriger Lichtleiter gezeigt, wobei die sechs umgebenden Fasern als beleuchtende und die zentrale Faser als detektierende benutzt wird. 2.1.1.2 Kalibrierung Zur Kalibrierung des Systems müssen ein Hell- und ein Dunkel-Standard festgelegt werden. Dabei entspricht der Dunkel-Standard der Lichtintensität 0, es fällt also kein Licht in den Lichtleiter. Der Hell-Standard wird als die Lichtintensität gewählt, die in einer 1%-Intralipid™- Suspension (Baxter, München) gemessen wird.
17 METHODIK
_____________________________________________________________________________________________
Tab. 1 Verwendete Lichtleitertypen
Der entscheidende Unterschied besteht im Faserdurchmesser. Zusätzlich unterscheiden sich die
verschiedenen Lichtleitertypen noch in der Anzahl der beleuchtenden Fasern und dem Material.
Lichtleitertyp 1 Lichtleitertyp 2 Lichtleitertyp 3
Faserquerschnitt 250 µm 250µm 70µm
Anzahl detektierender Fasern 1 1 1
Anzahl beleuchtender Fasern 1 6 6
Material Kunststoff Kunststoff Glas
2.1.2 3D-Scanner System
Über eine elastische Silikon-Membran, welche an einen Führungsarm gekoppelt wird, (Abb. 8)
ist die Spitze des Lichtleiters mit dem 3D-Scanner verbunden. Sie sorgt dafür, dass die
Lichtleiterspitze ständig Kontakt zur Organoberfläche hat, Reflexion an der Oberfläche
vermindert und Artefakte durch Fremdlicht verhindert werden. Dadurch wird das Licht direkt ins
Gewebe eingestrahlt. Über den Scanner wird der Lichtleiter meanderförmig über die Oberfläche
des Organs geführt. Der Scanner besitzt 3 Mikromotoren, einen für jede Raumrichtung, wobei
für diese Versuche nur in der x-, y-Ebene gemessen wurde. Für die Messungen bewegt sich der
Haltearm des Scanners, abhängig von der Schrittweite, meanderförmig zu allen Punkten der
vorgegebenen Matrix. Die Schrittweite ist dabei der Abstand zwischen zwei benachbarten
Messpunkten. Dabei wird das Herz hier entsprechend einer Schrittweite von 50µm und einer
Matrix von 31 mal 31 Punkten meanderförmig abgerastert. So erhält man eine Fläche von
1500µm auf 1500µm. An jedem Punkt dieser Matrix wird die rückgestreute Lichtintensität aus
30 Einzelspektren gemittelt und gespeichert. So erhält man eine Matrix, in der für jeden der
insgesamt 961 Messpunkte die zugehörige rückgestreute Lichtintensität abgelesen werden kann.
Der 3D-Scanner wird von der Software auf dem Computer des EMPHO II SSK kontrolliert und
gesteuert.18 METHODIK _____________________________________________________________________________________________ Abb. 8 Schematische Darstellung des Halteapparates für die Lichtleiterspitze Der Arm des 3D-Scanners ist über zwei Querstücke mit der Silikonmembran verbunden. 2.1.3 Auswertung 2.1.3.1 Rückgestreute Lichtintensität: In der Remissions-Fotometrie erhält man die ungeschwächte Rückstreuintensität I0 dann, wenn die Absorberkonzentration im Gewebe gleich Null ist, sich im Gewebe also ausschließlich Streuer befinden (25). In Anlehnung an das Transmissionsverhalten des Lichts in der Küvettenfotometrie könnte man folgern, dass auch die rückgestreute Lichtmenge ein Maß für die Stärke der Absorption im Gewebe ist. Daher sollte es möglich sein, die gesamte rückgestreute Lichtmenge als Integralwert zu berechnen. Für die Berechnung des Gesamtintegrals im sichtbaren Bereich (VIS) werden die rückgestreuten Lichtintensitäten aller Wellenlängen von 502nm bis 628nm in Intervallen von 2nm aufsummiert und durch die Gesamtzahl der
19 METHODIK
_____________________________________________________________________________________________
Wellenlängen, in diesem Fall 64, dividiert. Mathematisch formal ausgedrückt führt das zu
folgender Gleichung für die Berechnung des integralen Lichtintensitätswertes im sichtbaren
Wellenlängenbereich (25):
628nm
I(IU) = i =502+ 2
( I (λi ) / 64)
2.1.3.2 Myoglobin-Oxygenierung:
Die Berechnung der Myoglobinoxygenierung erfolgte analog zur Berechnung der Hämoglobin-
Oxygenierung mit dem Algorithmus nach Dümmler, dessen Anwendbarkeit in Experimenten
bestätigt wurde (4). Dabei werden zwei Referenzspektren erstellt, die dem Zustand bei 0%
Oxygenierung und 100% Oxygenierung entsprechen, wie in Abbildung 9 gezeigt. Alle anderen
Oxygenierungsgrade liegen zwischen diesen beiden Spektren und können daraus interpoliert
werden. Es kann also für jedes beliebige dieser so genannten Mischspektren aus den beiden
Extremspektren der Oxygenierungsgrad berechnet werden. In Abbildung 10 sind dafür
beispielhaft verschiedene Remissionsspektren während des Übergangs vom oxygenierten zum
desoxygenierten Zustand dargestellt. Man erkennt wie sich das Spektrum des vorangegangenen
Zustandes immer mehr dem desoxygenierten Zustand annähert. Der Algorithmus lässt sich auch
auf die Myoglobinoxygenierung anwenden. Hier muss man jedoch einen geringen
systematischen Fehler berücksichtigen.
Wellenlänge (nm)
502 542 582 622
Extinktion
mb oxy mb deoxy
Abb. 9 Extremwertspektren von oxygeniertem bzw. desoxygeniertem Myoglobin
Es sind die Extremwertspektren von oxygeniertem (rote Kurve) beziehungsweise desoxygeniertem (blaue
Kurve) Myoglobin dargestellt. Deutlich sind die Maxima bei 544nm und bei 580nm der roten Kurve und
bei 558nm der blauen Kurve zu erkennen.20 METHODIK
_____________________________________________________________________________________________
Wellenlänge (nm)
502 542 582 622
Extinktion
Abb. 10 Veränderung der Spektren vom oxygenierten zum desoxygenierten Zustand
Es ist die Veränderung der Remissionsspektren vom oxygenierten zum desoxygenierten Zustand gezeigt.
Die beiden zu Beginn deutlich erkennbaren Maxima bei 544nm und bei 580nm verschwinden immer mehr
und das Maximum bei 558nm tritt immer weiter in den Vordergrund. Eine jede dieser Kurven setzt sich
aus einem Mischspektrum der beiden Extremspektren aus Abb. 9 zusammen.
Zur Auswertung der Messungen wurde eine speziell für das EMPHO geschriebene Software
(Auswert 2.4) verwendet. Dieses Programm berechnet rückgestreute Lichtintensität und
Myoglobin-Oxygenierung nach oben angeführten Verfahren. Auswert 2.4 erlaubt es außerdem,
aus den gemessenen Datenmatrizen funktionelle 3D-Bilder zu erstellen, welche die komplexen
Vorgänge im Gewebe veranschaulichen. Diese Matrizen werden als dreidimensionale Bilder mit
Matlab R12 (The MathWorks Inc., Natick, Massachusetts, USA) dargestellt und können in allen
3 Raumrichtungen gedreht und so von allen Seiten betrachtet werden.21 METHODIK
_____________________________________________________________________________________________
2.2 Perfusionsmodell
2.2.1 Perfusionssystem
Das Perfusionssystem (Abb. 11) besteht im Wesentlichen aus Teilen der CAPS („Computer
Aided Perfusion System“) Herz-Lungen-Maschine (Stöckert Instrumente GmbH, München,
Deutschland). Im Einzelnen sind dies:
• Ein Oxygenator (Monolyth, Sorin Biomedica, Saluggia, Italien), der gleichzeitig als
Wärmetauscher dient.
• Zwei Rollerpumpen (Stöckert Instrumente GmbH, München, Deutschland), die das
Perfusat antreiben und für den optimalen Perfusionsdruck sorgen.
• Zwei Speicherbehälter (D 740, Dideco, Mirandola, Italien), wovon einer als arterieller
und der andere als venöser Zwischenspeicher dient.
• Ein Kühl- und Wärmeaggregat (Stöckert Heater-Cooler-System, Stöckert Instrumente
GmbH, München).
• Ein Auffanggefäß, über welches das Perfusat aus dem Herz zurück in den Kreislauf
fließt.
Abb. 11 Schematische Darstellung des Perfusionssystems
Das Herz befindet sich auf einer perforierten Silikonmembran über einem Auffanggefäß. In den linken
Ventrikel wird über die Mitralklappe eine dünne Kanüle (V122-18, Stöckert Instrumente GmbH, München,
Deutschland) eingebracht um die Füllung des Ventrikels durch die Venae Thebesi zu verhindern. Über
diese Kanüle kann das Perfusat direkt in den Behälter unter dem Herzen fließen. Gemeinsam mit der
Kanüle wird noch eine Temperatursonde zur kontinuierlichen Messung der Organtemperatur eingeführt.22 METHODIK
_____________________________________________________________________________________________
Die Rollerpumpe 1 treibt das Perfusat vom venösen Behälter zum arteriellen Behälter. Dadurch
wird der Druck im arteriellen Behälter erhöht und das Perfusat fließt einerseits über die
dicklumige Kanüle in der Aorta ins Herz und andererseits über den Oxygenator zurück in den
venösen Behälter. Über eine direkte Verbindung zwischen arteriellem Behälter und einem
Druckmessgerät wird der aktuelle Perfusionsdruck in mmHg angezeigt. Dieser Druck kann über
die Geschwindigkeit der Rollerpumpe 1 reguliert werden. Aus den nicht verschlossenen
Öffnungen des Herzens tropft das Perfusat ständig durch Löcher in der Silikonmembran in das
Auffang-Gefäß darunter. Das Perfusat wird von dort, gemeinsam mit dem Teil, der über die
dünne Kanüle aus dem linken Ventrikel abfließt, mit Hilfe der Rollerpumpe 2 zurück ins venöse
Behältnis gepumpt. Bei dieser Art der Herzperfusion wird die Aorta zwar retrograd perfundiert,
der Fluss in den Koronararterien ist aber antegrad. Das System wird mit 2,5 Litern des Perfusats
(Tabelle 2) betrieben.
Tab. 2 Zusammensetzung des Perfusats
Lösung Zusammensetzung pro Liter Aqua destillata
Na+ 149,50 mmol
Herzperfusat K+ 4,10 mmol
++
Ca 1,25 mmol
++
Mg 0,50 mmol
Cl- 119,00 mmol
H2PO4- 0,60 mmol
HCO3- 37,50 mmol
Glucose 4,40 mmol
HAES 6%
Der Oxygenator wird mit einer variablen Mischung aus Sauerstoff, Stickstoff und Kohlendioxyd
betrieben. Der Kohlendioxyd-Anteil wird konstant bei 5% gehalten, was dem physiologischen
Zustand in einer Alveole entspricht. Durch Veränderung der Mischungsverhältnisse von
Sauerstoff und Stickstoff wird der Oxygenierungsgrad geregelt. So kann sowohl absolute
Oxygenierung als auch vollständige Desoxygenierung des Myokards erreicht werden.23 METHODIK _____________________________________________________________________________________________ Zur Temperaturregulation des gesamten Perfusionssystems dient der Oxygenator zusätzlich noch als Wärmetauscher. Somit kann über das regelbare Kühl-Heiz-System, das an den Oxygenator angeschlossen ist, die Temperatur verändert werden. 2.2.2 Entnahme und Präparation der Herzen Die Versuche wurden an Herzen von Hausschweinen durchgeführt. In dieser Arbeit wurde speziell auf teure Tierversuche verzichtet, stattdessen wurden Organe von Schlachthoftieren verwendet, die am jeweiligen Tag eines Versuchs im Erlanger Schlachthof entnommen wurden. Die Zeit von der Entnahme bis zum Beginn der Reperfusion betrug etwa eine Stunde. Durch einen Elektroschock wurden die Schweine betäubt und anschließend mittels Durchtrennung der Halsgefäße getötet. Bei den Schweinen, die für die Versuche ausgewählt waren, wurde bewusst auf die Herzelektrode verzichtet um eine Beschädigung der Herzen zu verhindern. Der Thorax wurde direkt nach Inzision der Halsgefäße eröffnet. Das Herz wurde zusammen mit den Lungen, dem Ösophagus und dem umgebenden Bindegewebe entnommen um eine Traumatisierung des Organs zu verhindern, und für die Präparation in ein Gefäß mit 2 Liter eiskalter (4°C), isotoner Natriumchlorid-Lösung (0,9% NaCl mit 500 I.E. / l Heparin) gegeben. Dieses Vorgehen, bei dem die warme Ischämie-Zeit des Organs so kurz wie möglich gehalten wird, hat sich für spektrofotometrische Messungen als besonders gut geeignet herausgestellt. Anschließend wurde die Aorta bis zu ihrem Ursprung frei präpariert und die beiden aus dem Aortenbogen abgehenden Arteriae brachiocephalicae ligiert, um die Aorta abzudichten. Es wurde eine Kanüle (V122-36, Stöckert Instrumente GmbH, München, Deutschland) retrograd in die Aorta eingeführt und vollständig entlüftet. Die Kanüle wurde mit Hilfe von Kabelbindern in der Aorta fixiert. Danach wurde das Herz zur Vorbereitung für den Transport mit 3 Litern modifizierter Bretschneider-Lösung (siehe Tabelle 3) bei einem Perfusionsdruck von 100 cmH2O perfundiert, um die Koronargefäße freizuspülen und den Sauerstoffbedarf zu minimieren. Während der Perfusion mit der modifizierten Bretschneider- Lösung wurden die Lungen, der Ösophagus und das überflüssige Bindegewebe entfernt. Anschließend wurde das Organ in einem Gefäß mit 2 Litern modifizierter Bretschneider-Lösung bei einer Temperatur von 4ºC ins Labor gebracht.
24 METHODIK
_____________________________________________________________________________________________
Tab. 3 Zusammensetzung der modifizierten Bretschneider-Lösung
Lösung Zusammensetzung in mmol pro Liter Aqua destillata
Na+ 147,1
+
Modifizierte Bretschneider-Lösung K 20,0
++
Ca 2,6
Mg++ 34,2
-
Cl 240,7
Heparin 500 I.E.
2.2.3 Reperfusion
Im Labor wird das Herz über die dicklumige Kanüle in der Aorta an das Perfusionssystem
angeschlossen und auf der Silikonmembran über dem Auffanggefäß gelagert. Es ist dabei
besonders darauf zu achten, dass keine Luft ins System gelangt, was zu einer Luftembolie führen
würde. Um dies zu verhindern, muss die Kanüle beim Anschließen komplett mit Perfusat gefüllt
sein. Die Reperfusion mit dem hämoglobinfreien Perfusat wird unter desoxygenierten
Bedingungen durchgeführt, wobei der Perfusionsdruck zu Beginn 30mmHg und die Temperatur
12ºC beträgt. Während den folgenden 15 Minuten wird die Temperatur im Perfusat schrittweise
bis auf maximal 18ºC angehoben und die Raumtemperatur konstant bei 21ºC gehalten. Sobald
das Herz zu schlagen beginnt, was etwa 15 Minuten nach Beginn der Reperfusion eintritt, wird
der Sauerstoffgehalt von 0% auf 95% erhöht und die Temperatur im Perfusat weiterhin konstant
auf 18ºC gehalten. Die Zeit von der Reperfusion, bis zur Erhöhung der Inspiratorischen
Sauerstofffraktion [FIO2] auf 95% hängt allein davon ab, wie lange es dauert, bis das Herz von
selbst zu schlagen beginnt und war nicht vorgegeben.
Die spontanen Eigenkontraktionen bestätigen die Vitalität des Herzens, sind aber für die
Messungen mit dem 3D-Scanner eher unvorteilhaft. Da sich der Sauerstofftransport in
hämoglobinfreiem Perfusat lediglich durch den im Perfusat gelösten Sauerstoff abspielt, für die
Kontraktionen aber sehr viel Energie nötig ist, wurden die Kontraktionen für die Messungen
unterdrückt. In den Versuchen wurden dem Perfusat 6g 2,3-ButanDionMonoxym (BDM)
beigemengt um eine Kardioplegie zu erreichen. BDM unterdrückt lediglich die Kontraktionen,
indem es die Myosin-ATPase inhibiert. Es verursacht jedoch keine irreversiblen Veränderungen25 METHODIK _____________________________________________________________________________________________ der elektromechanischen Koppelung oder der Gewebsorganellen und bleibt deshalb über 48 Stunden lang antagonisierbar. Das Organ kann sogar während der gesamten Zeit wieder zu Kontraktionen angeregt werden. Nach den bisherigen Erfahrungen hat sich die Kardioplegie mit BDM bei spektrofotometrischen Untersuchungen am besten bewährt (1, 41). Mit BDM behandelte Herzen zeigten auch nach 48 Stunden keine Anzeichen von Kontrakturen oder erhöhter Steifheit. BDM wird auch in vielen Fluoreszensmessungen verwendet. Es wird davon ausgegangen, dass BDM die Aktin-Myosin-Interaktion verhindert, indem es die Myosin-ATPase reversibel inhibiert, so dass ein intrazellulärer Calciumanstieg keine Kontraktionen mehr nach sich zieht (1). BDM löst einen Zustand aus, in dem es nicht zu einem Verharren in einer bestimmten Position der Vernetzung von Aktin und Myosin kommt, sondern macht eine solche geradezu unmöglich. Somit verbleiben die Aktin- und Myosinfilamente während der gesamten Behandlung mit BDM in einem unvernetzten, völlig entspannten Zustand. Diese Tatsache ist besonders wichtig, da BDM im Vergleich zu Interventionen, die zu einer Hyperkontraktur führen um Kontraktionen zu unterdrücken, eine viel bessere Erholung des Muskelgewebes erlaubt und es nicht zu Zellschädigungen und myokardialem Ödem durch die Hyperkontraktur kommt. BDM wirkt negativ inotrop, verhindert einen Rigor bei niedrigen Mg-gebundenen-ATP- Konzentrationen und stimuliert die Hydrolyse von freiem ATP. Außerdem verhindert BDM im Gegensatz zu anderen kardioplegen Lösungen ein myokardiales Ödem und kann ein solches sogar wieder verbessern. BDM, das sich als kardioprotektiv erwiesen hat, wird deshalb auch bei Operationen am offenen Herzen verwendet (22, 40). 2.3 Versuchsablauf Während der Äquilibrierung des Perfusats mit Sauerstoff, wird das Gewebespektrum an einem Punkt kontinuierlich registriert und somit der Oxygenierungsgrad des Gewebes fortlaufend überwacht. Im Gegensatz dazu werden bei den Oberflächenmessungen die Umstände konstant gehalten und in einem bestimmten Bereich alle Punkte einer Matrix gemessen. Etwa 45 Minuten nachdem das Herz an die Versuchsapparatur angeschlossen wurde und 30 Minuten nach Erhöhung des Sauerstoffgehalts auf 95%, wird die erste Oberflächenmessung am mit BDM behandelten Herz gestartet. Diese Wartezeit muss eingehalten werden um konstante Verhältnisse im Perfusat zu gewährleisten. Nach Beendigung des etwa 30 Minuten dauernden Messvorgangs wird die Inspiratorische Sauerstofffraktion im Perfusat auf 0% gesenkt und wiederum 30 Minuten gewartet, bis stabile
26 METHODIK
_____________________________________________________________________________________________
Verhältnisse eingetreten sind. Dann wird die zweite Messung gestartet. Nach Abschluss dieser
Messung wird die Inspiratorische Sauerstofffraktion wieder auf 95% angehoben und 30 Minuten
später die Reoxygenierungs-Messung durchgeführt. Tabelle 4 zeigt noch einmal einen Überblick
über die verschiedenen Lösungen, die in den Versuchen eingesetzt wurden und Ihren
Verwendungszweck.
Tab. 4 Verwendungszweck und Lösungsmenge pro Herzversuch
Menge Lösung Verwendungszweck
4 Liter Isotone Kochsalzlösung (0,9%) Kühlung des Herzens während der
Präparation im Schlachthof.
5 Liter Modifizierte Bretschneider-Lösung Perfusion des Herzens im Schlachthof und
Kühlung während des Transports.
2,5 Liter Perfusat Perfusion des Herzens über die Herz-
Lungen-Maschine während der Messung.
2.4 Versuche zur Erhöhung der Auflösung
Nach Beendigung der Versuchsreihe wurde das System modifiziert um die Auflösung zu
erhöhen. Dazu wurde einerseits ein Lichtleiter mit einem geringeren Faserdurchmesser
verwendet und andererseits die Schrittweite verringert. Das Ziel dieser Messungen lag darin, die
Hypothesen aus der Hauptversuchsreihe zu erhärten und noch kleinere Strukturen darzustellen.
Es kamen Glas-Lichtleiter mit einem Durchmesser von 70µm pro Faser in der 7-faserigen
Ausführung zur Anwendung. Dadurch konnte die Schrittweite bis auf 10µm reduziert werden.
Mit reduzierten Schrittweiten wiederum wird der überlappende Anteil größer und die Auflösung
nimmt weiter zu.27 METHODIK
_____________________________________________________________________________________________
2.5 Präparationstechnik und Etablierung des endgültigen
Versuchsaufbaus.
2.5.1 Weiterentwicklung der Präparationstechnik
In den Vorversuchen wurde die Präparationstechnik an 24 Herzen erlernt, der Versuchsaufbau
perfektioniert und die idealen Werte für Perfusionsdruck und Änderung der Inspiratorischen
Sauerstofffraktion ermittelt. Dabei stellten sich verschiedene Probleme heraus. Um zu
verhindern, dass die noch schlagenden Herzen, welche direkt nach der Entnahme präpariert
wurden, eine Kontraktur erleiden, noch bevor sie sich in der 4°C kalten Lösung befinden,
wurden die Herzen gemeinsam mit der Lunge, dem Ösophagus und dem umgebenden
Bindegewebe entnommen und komplett in die 4°C kalte isotone NaCl-Lösung gegeben, dadurch
wurden die Kontraktionen gestoppt und eine Kontraktur verhindert. Anschließend wurde die
Kanüle (V122-36, Stöckert Instrumente GmbH, München, Deutschland) in die Aorta eingeführt
und mit einer Ligatur befestigt. Ein häufiges Problem dabei war jedoch, dass die Kanüle öfters
herausrutschte. Deshalb wurden die Ligaturen durch Kabelbinder ersetzt, die mit einer speziellen
Kabelbinderzange (MK 10, HellermannTyton, Tornesch) angezogen wurden. Diese Art der
Befestigung war sehr zuverlässig und nahm weniger Zeit in Anspruch. Um das System
abzudichten wurden die Arteriae brachiocephalicae ligiert, die beim Schwein beide direkt vom
Aortenbogen abgehen. Erst dann wurde das Herz mit der modifizierten Bretschneider-Lösung
perfundiert und währenddessen das umgebende Bindegewebe, der Ösophagus und die Lungen
entfernt. Nach Abschluss der Hauptversuchsreihe wurde das Verfahren an 6 weiteren Herzen
angewendet, bei denen die Methode modifiziert und somit eine höhere Auflösung erreicht
werden konnte.
2.5.2 Weiterentwicklung der Lichtleiterhalterung
Die ursprüngliche Lichtleiterhalterung des 3D-Scanners, bei der sich die Lichtleiterspitze in
einer starren Gleithülse befand, war für die Abrasterung der Herzoberfläche ungeeignet. Es
konnten damit zwar gewisse Unebenheiten ausgeglichen werden, es kam aber öfters dazu, dass
die Hülse sich verhakte oder das Herzvolumen so stark zunahm, dass das Gewebe direkt auf den
Hülsenhalter drückte. So wurde eine spezielle Halterung (Abbildung 12) entwickelt, bei der sich
die Lichtleiterspitze in einer Silikonmembran befindet, die der Herzoberfläche direkt aufliegt.28 METHODIK _____________________________________________________________________________________________ Diese Halterung ist so flexibel, dass sie jede Bewegung des Herzens mitmachen, Oberflächenunebenheiten ausgleichen und die Volumenzunahme kompensieren kann. Zusätzlich wurde durch die Membran der Auflagedruck auf der Organoberfläche vermindert, wodurch eine eventuelle Kompression der darunter liegenden Strukturen von vorneherein ausgeschlossen wurde. Abb. 12 Weiterentwicklung der Lichtleiterhalterung Auf dem Bild ist die neu entwickelte Halterung des Lichtleiters zu sehen. In die Silikonmembran (a) ist eine Hülse (b) eingearbeitet, in der der Lichtleiter (c) präzise befestigt werden kann. Die Spannung in der Membran wird gerade so gewählt, dass die Lichtleiterspitze den Bewegungen des Mikromotors exakt folgt und andererseits der Anpressdruck auf das Gewebe so gering wie möglich gehalten wird. Die Silikonmembran, das so genannte Patch, wird vom Mikromotor über den Haltearm (d) gesteuert. Auch Streustrahlung im detektierenden Lichtleiter, die von der Raumbeleuchtung herrühren könnte, wurde mit der Membran vorgebeugt, da sie die Lichtleiterspitze großflächig umschließt. Adhäsionskräfte zwischen der Silikonmembran und der feuchten Oberfläche des Organs sorgen zusätzlich dafür, dass die Lichtleiterspitze stets direkt aufliegt und so in einer konstanten Tiefe gemessen wird.
29 METHODIK
_____________________________________________________________________________________________
2.5.3 Verhinderung der Volumenzunahme des Organs durch die Füllung der
Venae Thebesi
Da die Perfusion der Herzkranzgefäße für die Vitalität des Organs den entscheidenden Faktor
darstellt, wird das Herz in diesem Modell retrograd über die Aorta perfundiert. Ein Problem bei
dieser Art der Perfusion stellt die enorme Volumenzunahme des linken Ventrikels über die
Venae Thebesi im Laufe der Perfusion dar. Deshalb wurde der Ventrikel durch eine dünne
Kanüle (V122-18, Stöckert Instrumente GmbH, München, Deutschland) entlastet, die über eine
Vena pulmonalis, den linken Vorhof und die Mitralklappe bis in die linke Kammer
vorgeschoben wurde, so dass das Perfusat direkt in das Auffanggefäß fließen konnte.
2.5.4 Besonderheiten bei der Verwendung von hämoglobinfreiem Perfusat
Da die Perfusion mit Eigenblut bzw. Hämoglobin-haltigem Perfusat wegen den ausgeprägten
Absorptionseigenschaften des Hämoglobins einen zu großen Störfaktor im Spektrum zur Folge
gehabt hätte, wurde bei den Versuchen auf Hämoglobin verzichtet. Auch die großen
Interferenzen mit dem Spektrum des Myoglobins waren ein Grund für eine hämoglobinfreie
Perfusion.
Zu Beginn der Vorversuche wurde noch mit oxygeniertem Perfusat begonnen und die
Temperatur über 20°C erhöht, dabei kam es jedoch regelmäßig schon nach kurzer Perfusionszeit
zu Kontrakturen. Dieses Problem konnte behoben werden, indem die Reperfusion mit
desoxygeniertem Perfusat bei einer Temperatur von 12°C durchgeführt wurde. Nur langsam
wurde die Temperatur anschließend erhöht und eine Höchsttemperatur von 18°C nicht
überschritten. Erst nach Beginn der Kontraktionen wurde die Inspiratorische Sauerstofffraktion
auf 95% angehoben.30 ERGEBNIS
_____________________________________________________________________________________________
3 ERGEBNIS
3.1 Verlaufsmessungen an einem fixen Punkt
In den Abbildungen 13 und 14 sind die Ergebnisse einer Verlaufsmessung dargestellt. Diese
Messungen wurden stichprobenhaft durchgeführt um die Auswirkungen im Gewebe nach der
Veränderung der Inspiratorischen Sauerstofffraktion zu verfolgen. Zum Ausgangszeitpunkt
dieser Messung an dem die Inspiratorische Sauerstofffraktion von 95% auf 0% gesenkt wurde,
zeigt sich kein Unterschied zu Werten unter Oxygenation. Das erste Schaubild (Abbildung 13)
zeigt dabei eine Myoglobinoxygenierung von über 80% und die rote Kurve in Abbildung 14 das
Spektrum von oxygeniertem Myoglobin. Doch nach und nach sinkt die Myoglobinoxygenierung
in Abbildung 13 immer mehr ab, da kein Sauerstoff mehr nachgeliefert wurde und der Anteil im
Perfusat immer weiter abgesunken ist. Ungewöhnlich ist jedoch, dass die Werte nicht
gleichmäßig ab dem Zeitpunkt der Sauerstoffreduktion bis zu ihrem Minimum abnehmen,
sondern dass die Werte zu Beginn sehr konstant bleiben und nach ungefähr 4 Minuten ein
enormer Abfall der Werte auf unter 10% stattfindet. Erst allmählich nähern sich die Werte dann
der 0% Marke. Die blaue Kurve in Abbildung 14 beschreibt den Zustand 10 Minuten nach
Beginn dieser Verlaufsmessung. Diese Kurve zeigt das Absorptionsspektrum von
desoxygeniertem Myoglobin, wie es aus der Abbildung 13 zu erwarten war. Da die vollständige
Desoxygenierung des Perfusats mit Hilfe des Oxygenators eine gewisse Zeit in Anspruch nimmt,
resultiert daraus eine Latenz vom Zeitpunkt der Erniedrigung des Oxygenierungsgrades am
Oxygenator bis sich der neue Zustand im gesamten Perfusat eingestellt hat. Deshalb musste sehr
genau darauf geachtet werden, dass genügend Zeit vergangen war, bevor eine
Oberflächenmessung nach Veränderung der Inspiratorischen Sauerstofffraktion gestartet wurde.
Denn nur so konnte gewährleistet werden, dass die Voraussetzungen im gesamten Messareal
dieselben waren. Durch derartige Zwischenmessungen konnte sichergestellt werden, dass nach
der für die Versuche gewählten Latenz von 30 Minuten der gewünschte Oxygenierungsgrad im
Herzmuskelgewebe eingetreten war. Dies und die homogene Verteilung des
Oxygenierungsgrades wurde über die Messung der Myoglobinoxygenierung, die bei jeder
Oberflächenmessung zeitgleich durchgeführt wurde, noch bestätigt.31 ERGEBNIS
_____________________________________________________________________________________________
Myoglobin Oxygenierung (%) 100
80
60
40
20
0
1 105 209
Anzahl der Spektren
(26 Spektren/min)
Abb. 13 Oxygenierungsverlauf
Nachdem die Inspiratorische Sauerstofffraktion von 95% auf 0% gesenkt wurde, verringerte sich die
Myoglobinoxygenierung von über 80% auf unter 5%. Die Messung wurde zu dem Zeitpunkt gestartet, an
dem die Inspiratorische Sauerstofffraktion auf 0% gesenkt wurde. Die Latenzzeit kommt dadurch
zustande, dass sich noch genügend Sauerstoff im Perfusat befand, bevor dieser verbraucht wurde.
Wellenlänge (nm)
502 542 582 622
Extinktion
mb oxy mb deoxy
Abb. 14 Absorptionsspektrum
Die rote Kurve zeigt ein oxygeniertes Spektrum, das bei der Verlaufsmessung zu Beginn aufgenommen
wurde. Die blaue Kurve dagegen zeigt ein desoxygeniertes Spektrum, das 10 Minuten nach Reduktion
der Inspiratorischen Sauerstofffraktion auf 0% gemessen wurde.Sie können auch lesen
