Wie schützt sich unsere DNS vor UV-Strahlung?
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Wie schützt sich unsere DNS vor UV-Strahlung?
Neue Erkenntnisse der Ultrakurzzeitspektroskopie über die
Wasserstoffbrückenbindungen der DNS-Doppelhelix
F. Temps
Institut für Physikalische Chemie
Christian-Albrechts-Universität zu Kiel
“Night of the Profs”
Lange Vorlesungsnacht der CAU, 23. November 2007
1
Übersicht
I. Einleitung, Motivation und aktuelle Forschungsziele
Vom Sonnenbrand zum Hautkrebs … oder vielleicht nicht ?
II. Spektroskopie mit ultrakurzen Laserpulsen
Moleküle auf frischer Tat ertappen
III. Ein Blick ins Laserlabor
Studentenleben im Dunkeln
IV. Ultraschnelle elektronische Relaxation isolierter DNA-Basen
und wasserstoffbrückengebundener Basenpaare
Ab durch den Trichter, den photochemischen …
Die Wasserstoffbrücke: Reich mir die Hand (und ich nehme Dir
Dein Elektron und Proton)
DNA in vivo – in vitro – in silico
V. Ausblick
Vom Spielen mit Bauklötzen und Basteln von Kettchen
ipc kiel 2
Einleitung, Motivation und Forschungsziele
Die vier Nukleinsäurebasen A, T, G und C bilden die Buchstaben des
genetischen Codes, der in der DNS verschlüsselt ist.
UV-Strahlung führt zu Mutationen und gefährlicher Schädigung des Erbguts!
Die Evolution hat hocheffiziente intrinsische Schutzstrategien gegen UV-
Strahlung und zudem eine ausgeklügelte aktive Reparaturmaschinerie
entwickelt. Viele der zugrundeliegenden Mechanismen sind bislang jedoch
wenig erforscht und kaum verstanden.
Und warum verwendet die Natur nur die vier Buchstaben A, T, G, C?
Andere, natürliche und künstliche Basen würden den Zweck auch erfüllen.
O Thymin
H H
Adenin N N N
H
N
N O H
O N
N H
O P O N
O N N
O O
N H
N O
O
N H
O P O N N
O O H
Cytosin
O
O P O Guanin
O
ipc kiel 3
UV-induzierte und oxidative DNS-Schädigungen (Läsionen)
O O
O O
O N N
O
N 6
O N O
O CH3 H CH3
O
P O
O P O
O O O
CH3
O O H CH3
N 4 O N O
O N N
O
O O
...dTdT... dT-dT Cyclobutan-Dimer
O
O
dR
N N O N
H N 6
O
N N O O H
H3C CH
H P 4 OH 3
N
O N
O
O H O N
N O
HN
O
N O
H2N N dT(6-4)dT Photoprodukt
dR
8-Oxoguanin
Hogsteen-Paar mit Ade
ipc kiel 4
Was wissen wir über DNS und UV-Strahlung?
Photochemische Dynamik einzelner, freier DNS-Basen:
Die freien Nukleinsäurebasen absorbieren UV-Licht hoch-
effektiv, aber erst bei relativ kurzen Wellenlängen im UV !
Aber erstaunlicherweise zeigen sie (fast) keine Fluoreszenz:
Die Fluoreszenzquantenausbeuten sind ΦFl ≤ 10-4 !
Dies zeigt, dass die elektronisch angeregten Moleküle sehr
schnell zum Grundzustand zurück relaxieren, bevor chemi-
sche Reaktionen zu Schäden führen (τ ≤ 1 ps) !
Ohne diese schnellen Relaxationsprozesse lägen die
Mutationsraten der DNS 10 000 – 100 000 mal höher !
Photochemische Dynamik von DNS-Molekülen:
Welchen Einfluss hat die Struktur der DNS ??
→ Basenpaarung durch Wasserstoffbrückenbindungen ?
→ Kopplungen zwischen den Strängen der Doppelhelix ?
→ π-Stapelwechselwirkungen innerhalb eines Strangs ?
Die Fluoreszenz von DNS ist rotverschoben, die elektron.
Lebensdauer ist größer als die der freien Basen !
Energietransfer, Excitonzustände, elektron. Leitfähigkeit ?
ipc kiel 5
Zeitskalen makroskopischer und molekularer Ereignisse
Molekulare Makroskopische Kosmische
Ereignisse Ereignisse Zeitskala
Hochgeschwindig-
keitsfotografie
Elektronen-
bewegung
Menschenleben
Herzschlag
Molekül- Molekül- Enzym- Alter des
schwingung rotation reaktionen Universums
Fußball-
spiel
10-18 10-15 10-12 10-9 10-6 10-3 100 103 106 109 1017
Zeit / s
ipc kiel 6
Zeitskalen makroskopischer und molekularer Ereignisse
Molekulare Makroskopische Kosmische
Ereignisse Ereignisse Zeitskala
Hochgeschwindig-
keitsfotografie
Elektronen-
bewegung
Menschenleben
Herzschlag
Molekül- Molekül- Enzym- Alter des
schwingung rotation reaktionen Universums
Fußball-
DinA4-Blatt Erde-Mond spiel Strecke, die ein Lichtstrahl
1000 Atome Bis zur Mensa
in der Zeit zurücklegt
Haardicke Kiel-Hannover
10-18 10-15 10-12 10-9 10-6 10-3 100 103 106 109 1017
Zeit / s
ipc kiel 7
Erzeugung ultrakurzer Laserpulse
Aufbau eines Ti:Sa-Femtosekundenlasers
Apertur
Auskoppel-
spiegel Spiegel
Prismenkompressor
Pump-Laser
(Nd:YAG) Faltungsspiegel
Ti:Sa-Kristall
Wellenlänge:
Wellenlänge: ≈≈800
800nm nm
Pulsdauer: ≈≈10
10- -100
100fsfs
Optischer Kerr-Effekt: n( I ) = n0 + n2 I Pulsdauer:
Wiederholrate:
Wiederholrate: ≈≈40
40MHz
MHz
Pulsenergie:
Pulsenergie: ≈≈55nJ
nJ
Pulsverstärkung: ≈≈1-10
Pulsverstärkung: 1-10mJ
mJ@@1kHz
1kHz
Spitzenleistungen: ≈≈10
Spitzenleistungen: 10GW
GW––11TW
TW
Selbstfokussierung durch Kerr-Linse
Niedrige Verluste für intensive Pulse
ipc kiel 8
Spektroskopie mit ultrakurzen Laserpulsen
Femtosekundenspektroskopie
Anregepuls ertappt !
Abfragepuls Detektor
1 fs = 10−15 s
ipc kiel 9
Experimenteller Aufbau: Fluoreszenz-Upconversion
50 fs pump pulse
(230 nm ≤ λ ≤ 280 nm)
time dependent
NOPA fluorescence signal
SHG 150 fs gate pulse
(BBO) (λ = 775 nm)
BS
Ti:Sa CPA 2001
(λ = 775 nm)
λ/2 f = 300
delay stage
f = 200
f = -100
PC
beam
1 mm
stop flow cell
photon counter
f = 150 f = 150
UG filter
preamplifier
c = 10-5 … 10-3 mol/l
T = 298 … 400 K WG filter λ
solv. = H2O, dioxane, … BBO DMC
(SFG) PMT
ipc kiel 10Experimenteller Aufbau: Fluoreszenz-Upconversion
50 fs pump pulse
(230 nm ≤ λ ≤ 280 nm)
NOPA
SHG 150 fs gate pulse
(BBO) (λ = 775 nm)
BS
Ti:Sa CPA 2001
(λ = 775 nm)
λ/2 f = 300
delay stage
f = 200
f = -100
PC
beam
1 mm
stop flow cell
photon counter
f = 150 f = 150
UG filter
preamplifier
c = 10-5 … 10-3 mol/l
T = 298 … 400 K WG filter λ
solv. = H2O, dioxane, … BBO DMC
(SFG) PMT
ipc kiel 11Blick ins Laserlabor: Studentenleben im Dunkeln
Blick insSpectroscopy: Ultrafast Laserlabor: Molecular Motion in the Femtosecond Domain ipc kiel 13
Femtosekundenspektroskopie von DNS-Bausteinen
NH2 NH2 H OH N H3C CH3
6 O NH2 N
5 N7 N N
1N N 6
8 N
2 N N
4 N 9 N N
N N HO OH
3
H N N
9H-Adenin (9H-Ade) 7H-Adenin (7H-Ade) Adenosin (Ado) H
6N-Dimethylamino-
9H-Adenin (DMAde)
H
N O H N
G G G 2AP
N N H N
dR C C C
N N
N H O dR
H selbstkomplementäre
G-C Watson-Crick kurze DNA-Schlaufen
ipc kiel 16Photophysical & Photochemical Properties of Adenine: Aims
Previous Work: 9HA
ππ∗
1. Gas phase near origin: LIF & REMPI
spectra showing sharp vibronic bands;
est‘d excited state lifetime of τ ≈ 30 ps
9HA 7HA
2. Gas phase spectra well above origin: nπ∗ ππ∗
Excited state lifetime of τ ≤ 1 ps
3. Solution (H2O): ΦFl ≤ 10−4, τ ≤ 1 ps
well above the origin; but no measure-
ments at origin
Fischer, Kim, Kleinermanns, Nir et al.
4. Non-radiative electronic decay mecha-
nisms not well understood (several ππ* nπ*
states, different theoretical predictions)
Our Strategy:
Energy
πσ*
fs fluorescence up-conversion to study
selected Ade derivatives in different
solvents over a range of excitation
energies (⇒ varying excess energy !) S0
R(9N-H)
ipc kiel 17Excited Electronic State Dynamics of Free Bases: fs Decay
fs Fluorescence Decay Profiles of Ade: Non-Radiative Relaxation Pathways in Ade:
La/πσ*
1.0 274 nm 1.0
norm. Fluorescence Intensity
269 nm
265 nm
260 nm ππ* La πσ*
253 nm nπ∗
0.5
245 nm
ππ* Lb
0.5 ππ* Lb
0.0
gs/πσ*
0 1 2 3
Lb/nπ* nπ*TS
0.0 Lb,min
Energy
0 10 20
gs/nπ*
Delay Time / (ps) nπ*min
hν
0.8 9H-Ade
gs/La
τ / (ps)
0.6 Qb
9H-Ade origin
0.4
gsmin Qi (MEP)
0.2
240 250 260 270 280
λ / (nm)
Domcke; Marian; Serrano-Andrés (2002 - 2006)
Pancur, Schwalb, Renth, Temps (2005)
ipc kiel 19Her damit und in den (photochemischen) Trichter ….
Photochemische Trichter zwischen elektronischen Potentialflächen:
S1 S1
S0 S0
trans Qb trans Qb
Qa Qa
cis cis
Diabatische Potentialhyperfläche Adiabatische Potentialhyperfläche
Mehratomige Moleküle (s = 3N-6): V± (Qa , Qb ) = Σ(Qa , Qb ) ± ( Δ(Qa , Qb ))2 + (W(Qa , Qb ))2
ipc kiel 20Excited State Dynamics of H-Bonded Base Pairs: G−C
e−
700
C(TBDMSi)2 1 mM
Excited ππ* state of G···C decays much
600 G(TBDMSi)3 1 mM
GC(TBDMSi)5 1 mM
faster than G or C, indicating ultrafast
free NH stretch
500 of dimers
εeff / (l mol-1 cm-1)
electronic relaxation to an optically dark
doorway state. 400
NH (s) stretch
of monomers
Results are consistent with transition to a
NH (a) stretch
300 of monomers
1CT (G
HOMO→CLUMO ) state followed by
H bonds
of G-C
200
charge-driven proton transfer from G to C
H bonds
of G-G
and e−/proton back transfer through conical 100
intersection of the CT state with S0 .
H bonds
of C-C
0
Schwalb & Temps (2007) 3600 3500 3400 3300 3200 3100
wavenumber / (cm-1)
ipc kiel 21Excited State Dynamics of H-Bonded Base Pairs and DNA
Photochemical dynamics of DNA chains:
Measurements on short DNA strands gave
lifetimes of several 100 ps, for example:
e− 15 , (dA)18 ⋅(dT)18 , ...
(dA)18 , d(AT)9 , (dC)
Fluorescence shows sizable red-shift!
Long-lived exciton states by intrastrand
π-stacking interactions, dipolar coupling, or
charge transfer processes (CT)?
fs transient absorption data on (dA·dT)18:
Excited ππ* state of G···C decays much
faster than G or C, indicating ultrafast
electronic relaxation to an optically dark
doorway state.
Results are consistent with transition to a
1CT (G
HOMO→CLUMO ) state followed by
charge-driven proton transfer from G to C
and e−/proton back transfer through conical
intersection of the CT state with S0 .
Schwalb & Temps (2007) Kohler & co-workers (2005)
ipc kiel 22Consequences of G-C Deactivation via 1CT State ?
Groenhof et al. (2007) H
H
H N
H2N N O N
N N N dR
N H
N
N
8-Oxoguanine
dR O Hoogsteen pair with Ade
8-Oxoguanine is produced via (G –H●) radical !
Watanabe et al. (2007)
Deactivation of G-C via CT State, H Atom
Back Transfer + Breaking of one H Bond
Groenhof et al. (2007)
Intra- and Inter-Strand Electron Transfer in DNA
demonstrated by Photo-Reaction at Br-Uracil
Deactivation of G-C via CT State + Double
Proton Exchange to non-WC Structure
ipc kiel 23Ausblick: Spielen mit Bauklötzchen und Basteln von Kettchen
single-stranded C and G
oligonucleotides (with
2AP probe on the right)
self-complementary (dA)4---(dT)4
oligonucleotide (& DMAde probe)
self-complementary (dC)3---(dG)3
oligonucleotide (with 2AP probe)
ipc kiel 24J. Dammeier S. Dziarzytski C. Fehling G. Friedrichs J. Gripp
R. Herges, Th. Lindhorst (CAU Kiel)
Th. Elsaesser, E. Nibbering (MBI Berlin)
W. Domcke (TU München)
E. Hentrop U. v.d. Heydt T. Michalak J. Moll Denis Mulliner
A. Sobolewski (Warsaw)
K. Weisz (U Greifswald)
K. Schwarz (CAU Kiel)
Bing Zhang (Wuhan, China)
N. Hansen (Livermore, USA)
E. Jalviste (Tartu)
H. Nicken F. Renth N.K. Schwalb R. Siewertsen H. Studzinski
Deutsche Forschungsgemeinschaft
SFB 677 „Funktion durch Schalten“
Fonds der Chemischen Industrie
Alexander-von-Humboldt-Stiftung
DAAD (PPP China)
M. Stuhldreier F. Temps Y. Wang K. Warns S. ZhangSie können auch lesen
