Abschlußbericht des Projektes B 71-I
←
→
Transkription von Seiteninhalten
Wenn Ihr Browser die Seite nicht korrekt rendert, bitte, lesen Sie den Inhalt der Seite unten
Abschlußbericht des Projektes B 71-I
(Herr Weiß, Prof. Dr. T. Hofmann)
Sensorische und analytische Charakterisierung nicht- flüchtiger
Geschmacksstoffe in hellem und dunklem Bier und Erarbeitung
technologischer Möglichkeiten zur Verbesserung des Biergeschmacks (B 71-I)
1 Zielstellung
2 Ergebnisse und Diskussion
2.1 Probenvorbereitung und Auftrennung von Geschmacksstoffen in Bier
2.1.1 Mehrstufige Ultrafiltration und Geschmacksprofilanalysen
2.1.2 Geschmacksprofile der Ultrafiltrationsfraktionen
2.1.3 Gelchromatographische Trennung der Ethylacetat-löslichen Bitterstoffe
2.1.4 Isolierung von Iso-alpha-Säuren und Bestimmung von
Geschmacksschwellenwerten
2.1.5 Isolierung von Polyphenolen und Bestimmung von
Geschmacksschwellenwerten
2.2 Quantifizierung potentieller Geschmacksstoffe in hellem bzw. dunklem Vollbier
2.2.1 Adstringierende und bittere Polyphenole
2.2.2 Bitter schmeckende Verbindungen
2.2.3 Süß schmeckende Verbindungen
2.2.4 Sauer schmeckende Verbindungen
2.2.5 Salzig/adstringierend schmeckende Verbindungen
2.2.6 Umami-artig schmeckende Verbindungen
2.3 Rekombinations-Experimente
2.4 Omissions-Experimente
3. Zusammenfassung
4. Materialien und Methoden1 Zielstellung Zielsetzung des Projektes war es unter Nutzung aktivitätsorientierter Fraktionierungsmethoden, quantitativer Analysen und humansensorischer Studien die nicht-flüchtigen Schlüsselgeschmacksstoffe von hellem bzw. dunklem Bier zu identifizieren und deren Geschmacksbeitrag anhand von Rekombinations- sowie Omissionsexperimenten zu belegen. 2 Ergebnisse und Diskussion 2.1 Probenvorbereitung und Auftrennung von Geschmacksstoffen in Bier Die Untersuchungen von geschmacksgebenden Verbindungen in Bieren wurden zunächst an handelsüblichem Vollbier durchgeführt. Hierzu wurden die Biere durch Filtration entschäumt und anschließend gefriergetrocknet. Um erste Einblicke in die Molekülgröße der Geschmacksstoffe zu erhalten wurden diese Lyophilisate in Wasser gelöst und anschließend mittels mehrstufiger Ultrafiltration nach Molekulargewicht aufgetrennt. 2.1.1 Mehrstufige Ultrafiltration und Geschmacksprofilanalysen Die Trennung der Bierinhaltsstoffe mittels Ultrafiltration erfolgte durch sequentiellen Einsatz von fünf Membranen mit Ausschlußgrößen von 100kDa, 30kDa, 10kDa, 3kDa und 1kDa. Nach Gefriertrocknung wurden die sechs Fraktionen UF1-UF6 erhalten, gewogen und zu sensorischen sowie analytischen Experimenten eingesetzt. Zu sensorischen Charakterisierung der Ultrafiltrationsfraktionen wurden diese in deren „natürlichen“ Konzentrationen in Wasser gelöst und anschließend mittels Geschmacksprofilanalyse unter Nutzung eines 12-köpfigen, geschulten Sensorikpanels und einer Intensitätsskala von 0 (nicht wahrnehmbar) bis 3 (stark wahrnehmbar) untersucht. Hierzu wurde zunächst ein Gesamtrekombinat (GR) aus allen Ultrafiltrationsfraktionen (UF1-6) hergestellt und dessen Geschmacksprofil mit dem einer wässrigen Lösung des lyophilisierten Ausgangsbieres (BL) verglichen. Dabei zeigte sich, dass sich die beiden Geschmacksprofile nicht signifikant unterschieden (Daten nicht dargestellt). Damit konnte gezeigt werden, dass bei der Ultrafiltration weder Substanzverluste auftraten, noch sensorisch aktive Artefakte
gebildet wurden. Die in Abb. 1 dargestellten Ergebnisse machten deutlich, dass in den Fraktionen UF1-UF5, die Verbindungen mit Molekulargewichten >1000 Da beinhalteten, keine oder nur in sehr geringen Maß geschmacksaktive Verbindungen enthalten waren. Hingegen wurden insbesondere in der niedermolekularen Fraktion UF6 (MW
Im Vergleich zur Bitterintensität des gesamten Bieres wird deutlich, dass der
Hauptteil der Bitterstoffe des Bieres sich somit mittels Ethylacetat extrahieren ließen.
3
2,5
2
Intensität
1,5
1
0,5
0
Ethylacetatfraktion Wasserfraktion Bier
Abb. 2. Vergleich der Bitterintensität von Bier, der Wasserfraktion sowie der
Ethylacetat-löslichen Verbindungen
Aus der Ausbeute der bitteren Ethylacetatfraktion sowie dessen mittels Triangeltest
bestimmten Geschmacksschwellenwert (in 5% ethanolischer Lösung) wurde
anschließend der Geschmackswert der Ethylacetat-löslichen Bestandteile von hellem
bzw. dunklem Vollbier als Quotient der Ausbeute und der
Geschmacksschwellenwertskonzentration einer Fraktion bestimmt (Tab. 1). Dabei
zeigte sich, dass in beiden Bieren die Ethylacetat-löslichen Bestandteile mit
Geschmackswerten >1 vorlagen. Mit diesen Geschmackswerten lagen diese
Fraktionen um den Faktor 4,5 bzw. 5,6 oberhalb des Schwellenwertes in hellem bzw.
dunklem Bier vor.Tabelle 1. Konzentration, Geschmacksschwelle und Geschmackswert der
Ethylacetatfraktion von Bier
Konzentration in Geschmacksschwelle
Substanz Geschmackswert
Bier [mgl/l] [mg/l]
Ethylacetatfraktion
306,0 68,2 4,5
(Vollbier Hell)
Ethylacetatfraktion
380,0 68,2 5,6
(Vollbier Dunkel)
Um die in der Ethylacetatfraktion erhaltenen Bitterstoffe weiter zu charakterisieren,
sollten diese zunächst mittel Gelpermeationschromatographie nach
Molekulargewichten getrennt werden.
2.1.3 Gelchromatographische Trennung der Ethylacetat-löslichen Bitterstoffe
Mittels Gelpermeationschromatographie an Sephadex LH-20 (Abb. 3) wurden mittels
Ethylacetat aus 0,5 L Bier isolierten Verbindungen aufgetrennt, aufgefangen und
gefriergetrocknet.
1 2 3 4 567 8 9 10 11 12
Abb. 3. GPC- Chromatogramm des Ethylacetatextraktes von 0,5l Vollbier HellDie erhaltenen Fraktionen wurden dann in „natürlichen“ Verhältnissen in Wasser
aufgenommen und anschließend zur Verdünnungsprofilanalyse eingesetzt. Hierzu
wurden die einzelnen Fraktionen schrittweise 1:1 mit Wasser verdünnt, bis ein
Geschmackseindruck im Vergleich zu einem Blindwert (Wasser) gerade noch
festgestellt werden kann. Die Größe dieser Verdünnungsfaktoren, sog. TD (Taste
Dilution)- Faktoren, stellt ein relatives Maß für die Geschmacksintensität der
einzelnen Fraktionen dar. Mit den in Abb. 4 dargestellten Geschmacks-
verdünnungsprofil ist somit ein Vergleich der relativen Geschmacksintensitäten der
einzelnen Fraktionen möglich. Die Ergebnisse machen deutlich, dass die Ethylacetat-
löslichen Geschmacksstoffe bittere und adstringierende Geschmacksqualitäten
aufwiesen. Mit dem höchsten TD-Faktor von 32 wurde der adstringierende
Geschmack der Fraktion EL2 sowie der Bittergeschmack der Fraktion EL3 bewertet,
gefolgt von den Fraktionen EL4-EL6 mit geringeren Geschmacksaktivitäten.
EL12
EL11
EL10
EL9
EL8
Fraktionen
EL7 bitter
EL6 adstringierend
EL5
EL4
EL3
EL2
EL1
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
TD- Faktoren
Abbildung 4. Geschmacksverdünnungsanalyse der 12 GPC Fraktionen
HPLC/DAD- sowie HPLC/MS-Analysen ergaben, dass in der intensiv bitter
schmeckenden Fraktion EL3 verschiedene Iso-α-Säuren enthalten waren. Um den
Beitrag dieser Verbindungen zum Bittergeschmack von Bier zu evaluieren, sollten
diese Verbindungen im Folgenden in Bier bestimmt werden.2.1.4 Isolierung von Iso-α-Säuren und Bestimmung von Geschmacks-
schwellenwerten
Zur Evaluierung des Geschmacksbeitrages der Iso-α-Säuren in Bier wurden die
Einzelkomponenten mittels HPLC aus den DCHA-Iso-α-Säure-Standards des Labors
Veritas, Zürich, isoliert (Abb. 5).
3.000.000
2.800.000 O O
21,58
16,60
2.600.000
H
2.400.000
HO OH
2.200.000
O O
2.000.000
1.800.000
H
1.600.000
HO OH
1.400.000
1.200.000
O O
1.000.000
23,32
800.000 H
SMH 100000,00
600.000
HO OH
1 2
400.000
3
11,55
200.000
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Abb. 5. Chromatogramm des DCHA- Iso- Standards mit co- Isohumulon (1), n-
Isohumulon (2) und ad- Isohumulon (3); Methode V
Die erhaltenen Isolate der Iso-α-Säuren wurden schonend vom Lösungsmittel befreit,
in 5 Vol. % iger ethanolischer Lösung aufgenommen und zur Bestimmung der
Geschmacksschwellenwerte mittels Triangeltest untersucht. Für das isolierte co-
Isohumulon wurde ein Schwellenwert von 9,2mg/l, für n-Isohumulon ein
Schwellenwert von 7,5mg/l und für ad-Isohumulon ein Schwellenwert von 8,8mg/l
bestimmt. Für den gesamten DCHA-Iso-Standard wurde ein Schwellenwert von 8,6
mg/l ermittelt.
Als weitere potentielle bittere Geschmacksstoffe in Bier sollten die folgenden
Arbeiten auf Polyphenole fokussiert werden.2.1.5 Isolierung von Polyphenolen und Bestimmung von
Geschmacksschwellenwerten
Isolierung von Polyphenolen aus Bier
Zur Isolierung von Polyphenolen aus Bier wurde gefriergetrocknetes helles Vollbier in
Wasser gelöst und mittels Chromatographie an Polyamid aufgetrennt. Nach Aufgabe
der Probe auf die Säule wurde zunächst mit Wasser gewaschen und anschließend
mit Methanol bzw. Methanol / Ameisensäure eluiert. Wie in Tab. 2 dargestellt, wurde
das Eluat in denn neun Fraktionen PA0 - PA9 aufgefangen und nach Entfernung des
Lösungsmittels im Vakuum einer Geschmacksverdünnungsanalyse unterzogen.
Dabei zeigte sich, dass saure und süße Verbindungen überwiegend in der Fraktion
PA0 enthalten waren, während die adstringierenden und bitteren
Geschmacksqualitäten insbesondere in den Fraktionen PA2-3 lokalisiert werden
konnten.
Tabelle 2. Geschmacksverdünnungsanalyse der Polyamidfraktionen
TD- Faktor (Geschmacksintensität bei TD 1)
Eluent Fraktion adstringierend bitter sauer süß
Wasser PA0 32 (1) - 512 (2) 256 (1,5)
PA1 8 (1) - 8 (0,5) -
PA2 32 (1) 8 (1) 16 (1,5) -
PA3 8 (1) 8 (1,5) 8 (1) -
MeOH
PA4 - - - -
PA5 4 (0,5) - - -
PA6 - - - -
PA7 16 (1) - - -
MeOH/
PA8 - 4 (1) 32 (1) -
Ameisensre.
PA9 - 16 (1,5) 64 (2) -
Die bitteren und adstringierenden Fraktionen PA2+3 wurden daher zur
anschließenden HPLC/Geschmacksverdünnungsanalyse eingesetzt (Abb. 6). Durch
Cochromatographie mit Referenzsubstanzen sowie LC/MS-Analysen konnten in der
Fraktion PA2+3 die Verbindungen Procyanidin B2, Epicatechin, Catechin und
Procyanidin B5 identifiziert werden. Hierzu wurden im Folgenden diese
Referenzsubstanzen aus Malz isoliert.280.000
260.000
240.000 Epicatechin
Epicatechin- (4β→8)
220.000
200.000 Epicatechin
180.000 (Procyanidin B2)
160.000
140.000
120.000
100.000
Catechin Epicatechin- (4β-6) Epicatechin
80.000
60.000
(Procyanidin B5)
40.000
20.000
0 12 34 5 6 7 89 10
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Abbildung 6. HPLC-Analyse der Fraktion PA2+3 aus hellem Bier
Isolierung und Fraktionierung von Polyphenolen von Malz
Zur Isolierung geschmacksaktiver Polyphenole wurde helles Gerstenmalz nach dem
in Abb. 7 dargestellten Fließschema fraktioniert.
100g Malz mahlen
5x mit 150ml Pentan extrahieren
Unlöslicher Rückstand
3x mit Aceton/Wasser (70:30) extrahieren
Entfernung des Acetons
5x mit je 200ml Ethylacetat extrahierenEthylacetatfraktion Wasserfraktion
Lösungsmittel entfernen,
in 50% Methanol
GPC / GVA
Abb. 7. Fraktionierung von hellem Gerstenmalz
Zur weiteren Trennung der Polyphenole wurde die nach Abb. 7 gewonnene
Ethylacetatfraktion mittels Gelpermeationschromatographie an Sephadex LH-20
getrennt. Wie in Abb. 8 dargestellt, wurde das Eluat in die sechs Fraktionen M1- M6
aufgetrennt.
1 2 3 4 5 6
Abb. 8. GPC-Chromatogramm des Ethylacetatextraktes von 100g Gerstenmalz mit
Einteilung der 6 Fraktionen M1- M6; Säulenmaterial Sephadex LH 20, Methode MZur Lokalisierung der geschmacksaktiven Fraktionen wurden die sechs Fraktionen
mittels Geschmacksverdünnungsanalyse untersucht. Wie in Abb. 9
zusammengestellt, wurde in den GPC-Fraktionen M4 und M5 ein intensiver
Bittergeschmack mit TD-Faktoren von 16 bzw. 8 festgestellt. Daneben wurde auch
ein adstringierendes Mundgefühl bei den Fraktionen M4 (TD-Faktor von 32) und M5
(TD-Faktor von 16) wahrgenommen. Die weiteren Identifizierungsarbeiten wurden
daher auf die sehr bittere und adstringierende Fraktion M4 konzentriert. Wie in Abb.
10 dargestellt, wurde diese Fraktion zunächst mittels HPLC untersucht.
6
5
adstringierend
4
Fraktion
bitter
süß
3
sauer
2
1
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56 60 64
T D - F akt o r en
Abb. 9. Geschmacksverdünnungsanalyse der 6 Fraktionen des Ethylacetat- extraktes
von 100g Gerstenmalz; Säulenmaterial Sephadex LH 20750.000
700.000
650.000
600.000
550.000
1 2 3 45 6
500.000
450.000
400.000
350.000
300.000
250.000
200.000
150.000
100.000
50.000
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55
Abbildung 10. HPLC-Chromatogramm der bitteren und adstringierenden Fraktion M4
aus Gerstenmalz
Die Anwendung der Geschmacksverdünnungsanalyse auf die aus Fraktion M4
erhaltenen HPLC-Subfraktionen ergab, dass diese durchweg bittere und
adstringierende Geschmacksqualitäten aufwiesen (Abb. 11).
6
5
Fraktionen
4
adstringierend
bitter
3
2
1
0 1 2 3 4 5 6 7 8
TD-Faktoren
Abb. 11. Geschmacksverdünnungsanalyse der HPLC-Fraktionierung der Fraktion M4
aus GerstenmalzMittels LC/MS-Experimenten konnte in der bitteren und adstringierenden HPLC-
Fraktion 2 das Catechin als dominante Verbindung identifiziert werden (I in Abb. 12).
In der ebenfalls bitter und adstringierend schmeckenden Fraktion 4 konnte das
Epicatechin nachgewiesen werden (II in Abb. 12). In HPLC-Fraktion 3 konnten das
Epicatechin (4β→8)-Epicatechin (Procyanidin B2; III in Abb. 12) und das
[Epicatechin (4β→8)]2-Epicatechin (Procyanidin C1; IV in Abb. 12) identifiziert
werden. In der bitteren und adstringierenden HPLC-Fraktion 5 wurde das Epicatechin
(4β→6)- Epicatechin (Procyanidin B5; V in Abb. 12) detektiert.
OH OH
HO O HO O
OH OH
OH OH
OH OH
I II
OH
OH HO
OH O
HO O OH
HO O
OH
OH OH
OH HO
OH OH
HO HO OH HO OH
O HO HO
OH O
OH
OH
OH OH O
HO HO
OH O
HO OH
HO
OH
OH
III IV V
Abb. 12. Strukturen der isolierten und identifizierten Polyphenole
Die Bestimmung der adstringierenden (ad) bzw. bitteren (bi)
Geschmacksschwellenwerte dieser Polyphenole im Triangeltest ergab, 170 (ad) bzw.
300 mg/L für Catechin, 250 (ad, bi) für Epicatechin, 120 (ad) bzw. 310 (bi) mg/L für
Procyanidin B2 und 230 (ad) bzw. 520 (bi) mg/L für Procyanidin B5.2.2 Quantifizierung potentieller Geschmacksstoffe in hellem und dunklem
Bier
Zur Bestimmung des Beitrages der einzelnen Verbindungen zum Gesamtgeschmack
von Bier, wurden diese im Folgenden quantitativ in hellem bzw. dunklem Vollbier
bestimmt und deren sog. Geschmackswert als Quotient der Konzentration und des
Gescxhmacksschwellenwertes berechnet.
2.2.1 Adstringierende und bittere Polyphenole
Die Polyphenole Catechin, Epicatechin, Epicatechin-(4β-8)-Epicatechin (Procyanidin
B2) und Epicatechin- (4β-6)-Epicatechin (Procyanidin B5) wurden in hellem und
dunklem Vollbier mittels LC-MS (TSQ Quantum Discovery, Thermo Electron)
quantifiziert.
Die folgende Abb. 13 zeigt beispielhaft ein LC/MS- Chromatogramm der
Bestimmung in hellem Vollbier.
R T: 1 7 .2 5 - 2 9 .1 2 S M: 7 B
2 3 .8 3 2 6 .4 2 N L : 5 .8 1 E -2
1 8 .2 1 1 9 .4 5 1 9 .9 9 2 0 .8 4 2 1 .4 2 2 1 .7 6 2 3 .0 9 2 5 .0 8 2 6 .1 4 2 7 .4 3 2 7 .8 5 2 8 .4 3 U V An a lo g An a lo g
0 4 0 3 1 0 -0 1
0 .0 4
Intensity
0 .0 2
0 .0 0 N L : 8 .1 5 E 6
2 3 .8 6
100
B a s e P e a k F: + c E S I
Fu ll m s [
1 0 0 .0 0 -1 0 0 0 .0 0 ] MS
50 0 4 0 3 1 0 -0 1
2 6 .4 7
2 5 .1 1
1 8 .2 4 1 8 .9 0 1 9 .6 8 2 0 .0 4 2 1 .2 3 2 1 .8 1 2 2 .2 8 2 2 .9 5 2 4 .1 0 2 6 .0 9 2 7 .0 8 2 7 .5 9 2 8 .4 3
0 N L : 2 .2 2 E 6
2 6 .4 7
100
m /z= 2 9 0 .5 0 -2 9 1 .5 0
Epicatechin F: + c E S I Fu ll m s [
1 0 0 .0 0 -1 0 0 0 .0 0 ] MS
50 0 4 0 3 1 0 -0 1
1 8 .1 8 1 8 .9 2 1 9 .2 7 2 0 .3 7 2 0 .9 4 2 2 .0 6 2 3 .0 7 2 3 .2 0 2 4 .4 8 2 5 .1 1 2 5 .8 9 2 6 .9 3 2 7 .7 2 2 8 .6 1
0 N L : 8 .1 5 E 6
2 3 .8 6
100
m /z= 5 7 8 .5 0 -5 7 9 .5 0
Epicatechin- (4β→8) Epicatechin F: + c E S I Fu ll m s [
1 0 0 .0 0 -1 0 0 0 .0 0 ] MS
50
(Procyanidin B2) 0 4 0 3 1 0 -0 1
1 7 .7 7 1 9 .0 2 1 9 .4 3 2 0 .6 9 2 1 .1 5 2 2 .4 1 2 3 .0 2 2 5 .0 3 2 5 .6 1 2 6 .4 3 2 7 .0 0 2 8 .3 0 2 8 .7 1
0 N L : 1 .4 1 E 6
2 5 .1 1
100
m /z= 8 6 6 .5 0 -8 6 7 .5 0
[Epicatechin- (4β→8)]2 Epicatechin MS 0 4 0 3 1 0 -0 1
50
(Procyanidin C1)
1 7 .3 1 1 7 .9 8 1 9 .1 2 1 9 .8 3 2 0 .9 7 2 1 .8 3 2 2 .4 9 2 3 .8 3 2 3 .9 1 2 5 .6 4 2 6 .7 7 2 7 .2 6 2 7 .7 7 2 8 .8 9
0
18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
Tim e (m in )
Abb. 13. LC-MS-Chromatogramm zur Bestimmung der Polyphenole in BierDie höchsten Gehalte an löslichen Polyphenolen in hellem Bier wurden für Catechin
(60,5 mg/l) bestimmt, gefolgt von Epicatechin mit etwa 11,1 mg/l Bier (Tab. 3). Die
Procyanidin-Dimere waren vergleichsweise in geringen Konzentrationen enthalten.
Insgesamt lagen die Polyphenole im dunklen Vollbier in annähernd gleichen
Konzentrationen vor wie im hellen Vollbier.
Tabelle 3. Konzentrationen, Geschmacksschwellenwerte und Geschmackswerte (GW)
von Polyphenolen in hellem Vollbier (HV) und dunklem Vollbier (DV)
Schwellen- Konz. in HV Konz. in DV
Verbindung GW in HV GW in DV
wert [mg/l] [mg/l] [mg/l]
Catechin 300 (bi) 60,5 43,1 0,2 (bi) 0,1 (bi)
170 (ad) 0,37 (ad) 0,25 (ad)
Epicatechin 250 (bi) 11,1 6,23 0,04 (bi) 0,02 (bi)
250 (ad) 0,04 (ad) 0,02 (ad)
Epicatechin- 310 (bi) 0,12 0,22.2.2 Bitter schmeckende Verbindungen
In der Gruppe der rein bitter schmeckenden Verbindungen wurden die Iso-α-Säuren
mittels RP-HPLC/DAD sowie bittere Aminosäuren mittels Aminosäureanalysator
quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse in Tab. 4 zeigen, dass diese Bitterstoffe in
hellem Bier einen Gesamtgeschmackswert von 3,55 erreichen. Zu dieser
Bitteraktivität tragen die bitteren Aminosäuren einen Wert von 0,85 und die
Hopfenbitterstoffe einen Wert von 2,7 bei.
Der Gesamtgeschmackswert von bitteren Substanzen in dunklem Bier beträgt 4,0.
Die bitteren Aminosäuren erreichen zusammen einen Geschmackswert von 1,05, die
Hopfenbitterstoffe einen Wert von 3,0.
Tabelle 4. Konzentrationen, Geschmacksschwellen und Geschmackswerte (GW) von
bitteren Verbindungen in hellem Vollbier (HV) bzw. dunklem Vollbier (DV)
Schwellenwert Konz. in HV Konz. in HV GW in GW in
Substanz
[mmol/l] [mmol/l] [mmol/l] HV DV
co- Isohumulon 0,017 0,015 0,015 0,8 0,8
n- Isohumulon 0,014 0,020 0,022 1,5 1,6
ad- Isohumulon 0,02 0,006 0,009 0,4 0,6
Arginin 75,0 2,8 3,5 0,04 0,05
Histidin 48,0 1,5 2,3 0,03 0,05
Leucin 12,0 1,7 1,3 0,14 0,11
Isoleucin 11,0 1,0 1,2 0,1 0,11
Phenylalanin 58,0 2,4 2,9 0,04 0,05
Tyrosin 5,0 2,7 3,4 0,54 0,68
Summe 3,55 4,00
2.2.3 Süß schmeckende Verbindungen
In der Gruppe süß schmeckender Verbindungen wurden lösliche Kohlenhydrate
sowie Aminosäuren bestimmt. Der Gehalt der Zucker Glucose, Fructose, Maltose
und höherer Maltosederivate in Bier wurde mittels HPLC mit elektrochemischer
Detektion bestimmt. Ein Beispielchromatogramm der Bestimmung von
Maltosehomologen ist in Abb. 14 dargestellt.Abb. 14. Bestimmung von Maltose und Homologen mittels HPLC mit elektrochemischer Detektion Die in hellem Bier gefundenen Mengen an löslichen Kohlenhydraten entsprechen einem Geschmackswert von 1,68 und tragen damit in Summe deutlich zum Süßgeschmack bei. Hervorzuheben sind dabei die Maltose mit einem Geschmackswert von 0,24, die Maltopentaose mit einem Wert von 0,26 und die beiden Zucker Maltohexaose und Maltoheptaose mit Werten von 0,54 bzw. 0,40 (Tab. 5). Daneben weisen die süßschmeckenden Aminosäuren (vor allem Glycin und Alanin) und der dreiwertige Alkohol Glycerin in deren Summe noch einen Geschmackswert von 2,3 auf. Zusammen mit dem Ethanol, der einen Geschmackswert von 14 aufweist ergibt sich ein Geschmackswert der süßen Verbindungen von insgesamt 18.
Tabelle 5. Konzentrationen, Geschmacksschwellen und Geschmackswerte (GW) von
süß schmeckenden Verbindungen in hellem Vollbier (HV) bzw. dunklem Vollbier (DV)
Schwellenwert Konz. in HV Konz. in DV GW GW
Verbindung
[mmol/l] [mmol/l] [mmol/l] in HV in DV
Glucose 90 0,339 0,652.4.4 Sauer schmeckende Verbindungen
Die in Tab. 6 zusammengestellten, in hellem Bier quantifizierten, sauer
schmeckenden Verbindungen erreichen in deren Summe einen Geschmackswert
von 7. Die Fettsäuren Caprylsäure und Capronsäure mit Werten von 2,84 bzw. 1,01
sind in hellem Bier in höheren Konzentrationen enthalten als in dunklem Bier.
Daneben tragen noch Bernsteinsäure und Essigsäure hauptsächlich zum
Sauergeschmack bei.
Für die Gruppe der sauren Verbindungen errechnet sich in dunklem Bier ein
Geschmackswert von 7. Dies entspricht dem von hellem Bier, allerdings sind die
Gehalte der Carbonsäuren – vor allem Essigsäure, Citronensäure und Bersteinsäure
– in dunklem Bier erhöht. Im Gegensatz dazu sind die Fettsäuren in geringeren
Konzentrationen vorhanden.
Tabelle 6. Konzentrationen, Geschmacksschwellen und Geschmackswerte (GW) von
sauren Verbindungen in hellem Vollbier (HV) bzw. dunklem Vollbier (DV)
Schwellenwert Konz. in HV Konz. in DV GW GW
Verbindung
[mmol/l] [mmol/l] [mmol/l] in HV in DV
Essigsäure 2,0 1,50 1,90 0,75 0,95
Citronensäure 2,6 0,99 1,53 0,38 0,59
Äpfelsäure 3,7 0,63 0,88 0,17 0,24
Brenztraubensäure 5,0 3,4 3,50 0,68 0,7
Bernsteinsäure 0,9 0,80 1,10 0,89 1,22
Oxalsäure 5,6 0,11 0,05 0,012.2.5 Salzig/adstringierend schmeckende Verbindungen
In der Gruppe adstringierend/salziger Verbindungen wurde für die γ-
Aminobuttersäure (GABA) im hellen Vollbier ein sehr hoher Geschmackswert von
über 22,5 errechnet werden (Tab. 7). Diese Verbindung trägt mit ihrem
adstringierend- belegenden Geschmack somit entscheidend zur entsprechenden
Geschmacksnote des hellen Bieres bei. Salzig schmeckende Kationen und Anionen
erreichten einen Gesamtgeschmackswert von 2,8. Als Einzelsubstanz überschreitet
hingegen lediglich Magnesium mit seiner Konzentration dessen
Geschmacksschwelle.
Wie schon in hellem Bier, trägt die GABA auch in dunklem Bier wesentlich zum
adstringierend- belegenden Geschmack bei. Mit einem Geschmackswert von 18 ist
ihre Konzentration nicht ganz so hoch wie in hellem Bier (Tab. 7). Der Gehalt an
anorganischen Ionen ist im dunklen Bier vergleichbar hoch wie in hellem. Bei einem
Gesamtgeschmackswert von 2,9 für diese Gruppe erreicht Magnesium mit 0,86 den
höchsten Einzelwert.
Tabelle 7. Konzentrationen, Geschmacksschwellen und Geschmackswerte (GW) von
adstringierenden und salzigen Verbindungen in hellem Vollbier (HV) bzw. dunklem
Vollbier (DV)
Schwellenwert Konz. in HV Konz. in DV GW GW
Verbindung
[mmol/l] [mmol/l] [mmol/l] in HV in DV
GABA 0,02 0,45 0,36 22,5 18,0
Calcium 7,5a 1,79 2,12 0,2 0,28
Natrium 7,5a 0,24 0,20 0,03 0,03
Kalium 15,0a 8,25 9,13 0,55 0,61
Magnesium 4,0a 3,96 3,45 0,99 0,86
Chlorid 7,5b 4,97 4,38 0,66 0,58
Phosphat 7,5c 3,35 4,06 0,44 0,54
a b c
getestet als Chlorid; getestet als Natriumchlorid; getestet als Kaliumphosphat2.2.6 Umami-artig schmeckende Verbindungen
Von den in Tab. 8 zusammengestellten, umami-artig schmeckenden Substanzen
erreichte in hellem Bier keine Verbindung deren Geschmacksschwelle. Mit einem
Wert von 0,22 erreicht Guanosinmonophosphat (GMP) noch den höchsten
Geschmacksbeitrag.
Der gegenüber hellem Bier höhere Gehalt an Guanosinmonophosphat
(Geschmackswert 0,77) trägt wesentlich dazu bei, dass umamiartig schmeckende
Stoffe in dunklem Bier mit einem summarischen Geschmackswert von 0,99
annähernd die Geschmacksschwelle erreichen.
Tabelle 8. Konzentrationen, Geschmacksschwellen und Geschmackswerte (GW) von
umamiartig schmeckenden Verbindungen in hellem Vollbier (HV) bzw. dunklem
Vollbier (DB)
Schwellenwert Konz. in HV Konz. in DV GW GW
Verbindung
[mmol/l] [mmol/l] [mmol/l] in HV in DV
Glutaminsäure 3,0 0,08 0,52 0,03 0,17
Asparaginsäure 4,0 0,04 0,21 0,01 0,05
GMP 0,31 0,07 0,24 0,22 0,77
CMP 7,0 0,004 0,009Geschmacksqualitäten auf einer Skala von 0 (nicht detektierbar) bis 3 (stark
wahrnehmbar) bewertet werden. Die folgende Abb. 15 zeigt die Bewertung des
Rekombinates für helles Bier sowie der authentischen Referenzprobe. Das
Rekombinat für helles Bier zeigte für aller Geschmacksattribute weitgehende
Übereinstimmung mit dem Referenzprodukt, lediglich die bittere Note wurde
geringfügig weniger intensiv bewertet.
sauer
2,5
2
1,5
umami
salzig
1
0,5
Bier (hell)
0
Rekombinat
adstringierend
bitter
süß
Abb. 15. Geschmacksprofilanalyse des HV-Rekombinates und des authentischen,
hellen Vollbiers (HV)
Die Abb. 16 zeigt die Bewertung des Verkosterpanels für das Rekombinat des
dunklen Bieres (HD). Für die Geschmacksattribute süß, sauer, salzig und bitter
ergeben sich sehr gute Übereinstimmungen mit dem authehtischen dunklen Bier. Es
kann daher davon aufgegangen werden, dass alle Schlüsselgeschmacksstoffe des
dunklen Vollbiers identifiziert werden konnten.sauer
3
2,5
2
umami 1,5 salzig
1
0,5
Bier (dunkel)
0
Rekombinat
adstringierend bitter
süß
Abb. 16. Geschmacksprofilanalyse des DV-Rekombinates und des authentischen,
dunklen Vollbiers (DV)
Um in weiteren Studien den Beitrag einzelner Geschmacksstoffgruppen zum
Gesamtgeschmack von Vollbier abzuschätzen, wurden in Folgenden sog.
Omissionsexperimente durchgeführt.
2.4 Omissionsexperimente
Für die Durchführung der Omissionsexperiments wurde aus den Geschmacks-
Rekombinaten jeweils eine der folgenden, in Tab. 9 angegebenen Stoffgruppen
weggelassen und dieses Partialrekombinat sensorisch mit dem jeweiligen
Vollrekombinat verglichen.Tabelle 9. Einteilung der Gruppen für die Omissionsexperimente
Geschmacksqualität
Versuchs-
der weggelassenen weggelassene Substanzen
reihe
Gruppe
O1 süß Glucose, Fructose, Maltose, Maltotriose,
Maltotetraose, Maltopentaose, Maltohexaose,
Maltoheptaose, Glycin, Serin, Threonin, Lysin,
Alanin, Ethanol, Glycerin
O2 sauer Essigsäure, Citronensäure, Äpfelsäure,
Brenztraubensäure, Bernsteinsäure, Oxalsäure,
Milchsäure, 3-Methylbuttersäure, Capronsäure,
Caprylsäure
O3 Umami-artig Glutaminsäure, Asparaginsäure, GMP, CMP
O4 salzig Calcium, Natrium, Kalium, Magnesium, Chlorid,
Phosphat
O5 belegend, GABA
adstringierend
O6 bitter 1 co- Isohumulon, n- Isohumulon, ad- Isohumulon
O7 bitter 2 Arginin, Histidin, Leucin, Isoleucin,
Phenylalanin, Tyrosin
O8 adstringierend und Epicatechin- (4-8-)- Epicatechin, Epicatechin-
bitter (4-6-)- Epicatechin, Epicatechin, Catechin
Im Rahmen eines Triangeltests war dem Verkosterpanel die Aufgabe gestellt, das
jeweilige Partialrekombinat von dem Vollrekombinate (2-fach) zu unterscheiden und
die Unterschiede aif einer Skala von 0-3 in deren Intensität zu bewerten.
Versuchsreihe O1
In den folgenden Abbildungen 17 und 18 sind die Ergebnisse der Versuchsreihe O1
(ohne süße Stoffe) für helles und dunkles Bier dargestellt. In beiden Diagrammen
wird deutlich, dass das Weglassen der Alkohole, der süßen Aminosäuren sowie der
Kohlenhydrate zu einen fast vollständigen Verlust des süßen Geschmacks der Biere
zur Folge hat. Neben einer Reduzierung des Süßgeschmackes wurde zudem eine
geringfügige Intensivierung der Geschmackseindrücke bitter, adstringierend und
sauer beobachtet. In der Bewertung der Versuchreihe wurde die abweichende Probe
(O1) vom Verkosterpanel eindeutig identifiziert und als unangenehm sauer,
adstringierend und nicht balanciert beschrieben. Demnach trägt die Gruppe der
süßen Verbindungen (Alkohole, Aminosäuren, Zucker) signifikant zum Geschmack
des Bieres bei.sauer
3
2,5
2
umami
1,5 salzig
1
0,5
O1
0
Rekombinat Hell
adstringierend bitter
süß
Abb. 17. Sensorische Bewertung der Versuchsreihe O1 für helles Bier
3
sauer
2,5
2
umami 1,5 salzig
1
0,5 O1
0 Rekombinat Dunkel
adstringierend bitter
süß
Abb. 18. Sensorische Bewertung der Versuchsreihe O1 für dunkles BierVersuchsreihe O2
In der Versuchsreihe O2 wurden die sauren Geschmacksstoffe aus dem Rekombinat
weggelassen. Die Abb. 19 und 20 zeigen die Ergebnisse der Triangeltests. Das
Fehlen der sauren Verbindungen in den Rekombinaten wurde von allen Testern
signifikant erkannt. Der Geschmacksunterschied zum Vollrekombinat wurde
insbesondere mit der deutlichen Reduktion des sauren Geschmacks und einer
geringfügigen Reduktion der Bitterkeit beschrieben. Somit beeinflusst der
Sauergeschmack auch die Bittere der Biere. Vor allem beim dunklem Bier ging die
Reduktion des sauren Geschmackseindrucks mit einem als seifig beschriebenen
Eindruck einher.
3
sauer
2,5
2
umami 1,5 salzig
1
0,5
0 O2
Rekombinat Hell
adstringierend bitter
süß
Abb. 19. Sensorische Bewertung der Versuchsreihe O2 für helles Bier3
sauer
2,5
2
umami 1,5 salzig
1
0,5
0 O2
Rekombinat Dunkel
adstringierend bitter
süß
Abb. 20. Sensorische Bewertung der Versuchsreihe O2 für dunkles Bier
Versuchsreihe O3
In der Versuchsreihe O3 wurden die umamiartig schmeckenden Substanzen
Glutaminsäure, Asparaginsäure, GMP und CMP aus den Rekombinaten
weggelassen. Die Abb. 21 und 22 zeigen die Ergebnisse der
Geschmacksprofilanalysen.
Das Fehlen dieser Gruppe an Geschmacksstoffen führte unabhängig von der
Geschmacksqualität zu einer geringfügigen Reduktion der Intensität der einzelnen
Geschgmacksnoten. Zudem wurde von den Testern ein Verlust an Vollmundigkeit
sowie ein Rückgang der allgemeinen Geschmacksintensität vermerkt. Trotz der
geringen Geschmackswerte tragen die umamiartig schmeckenden Substanzen somit
zum Gesamteindruck der Biere (insb. des dunklen Bieres) bei.2,5
sauer
2
1,5
umami salzig
1
0,5
0
O3
Rekombinat Hell
adstringierend bitter
süß
Abb. 21. Sensorische Bewertung der Versuchsreihe O3 für helles Bier
sauer
2,5
2
1,5
umami salzig
1
0,5
0 O3
Rekombinat Dunkel
adstringierend bitter
süß
Abb. 22. Sensorische Bewertung der Versuchsreihe O3 für dunkles BierVersuchsreihe O4
In den folgenden Abb. 23 und 24 sind die Ergebnisse de Versuchsreihe O4
dargestellt. Für die Erstellung dieser Partialrekombinate wurden keine Kationen und
Anionen verwendet. Aus den Diagrammen ist ersichtlich, dass für die salzig
schmeckenden Substanzen ähnliches gilt wie für die Gruppe der umami-
Verbindungen. Obwohl in geringen Konzentrationen enthalten, wird ein Fehlen dieser
Substanzen im Triangeltest eindeutig festgestellt. Allgemein werden die Intensitäten
der einzelnen Geschmackseindrücke verringert, lediglich die Intensität des
Süßgeschmacks des Partialrekombinat des hellen Bieres wurde gegenüber der
Referenzprobe als verstärkt wahrgenommen.
sauer
2,5
2
1,5
umami salzig
1
0,5
0 O4
Rekombinat Hell
adstringierend bitter
süß
Abb. 23. Sensorische Bewertung der Versuchsreihe O4 für helles Biersauer
2,5
2
1,5
umami salzig
1
0,5
0 O4
Rekombinat Dunkel
adstringierend bitter
süß
Abb. 24. Sensorische Bewertung der Versuchsreihe O4 für dunkles Bier
Versuchsreihe O5
In der Versuchsreihe O5 wurde aus dem Rekombinat die γ-Aminobuttersäure
(GABA) weggelassen. Diese Substanz ist in hellem Bier mit einem Geschmackswert
von 22,5 und in dunklem Bier mit einem Geschmackswert von 18 enthalten. Die Abb.
25 und 26 zeigen die Ergebnisse für das Partialrekombinat von hellem Bier bzw.
dunklem Bier. Neben der zu erwartenden starken Abnahme des adstringierenden
und des sauren Geschmackseindruckes wird dieses Rekombinat sowohl im Falle des
hellen als auch des dunklen vom Verkosterpanel als etwas weniger bitter bewertet.
Auch wird der Gesamteindruck des Partialrekombinates als nicht mehr
produkttypisch beschrieben. Die GABA leistet somit einen wichtigen Beitrag zum
adstringierenden Geschmackseindruck des Bieres.2,5
sauer
2
1,5
umami salzig
1
0,5
0 O5
Rekombinat Hell
adstringierend bitter
süß
Abb. 25. Sensorische Bewertung der Versuchsreihe O5 für helles Bier
sauer
2,5
2
1,5
umami salzig
1
0,5
0 O5
Rekombinat Dunkel
adstringierend bitter
süß
Abb. 26. Sensorische Bewertung der Versuchsreihe O5 für dunkles BierVersuchsreihe O6 In der Versuchsreihe O6 wurden co-Isohumulon, n-Isohumulon und ad-Isohumulon aus den Rekombinaten herausgenommen. Die Abb. 27 und 28 zeigen die Ergebnisse der sensorischen Bewertung der Partialrekombinate für helles bzw. dunkles Bier. Die erwartete Abnahme des bitteren Geschmackseindruckes ging mit einer Verstärkung des Süßgeschmackes einher. Außerdem wurde das Rekombinat als etwas saurer und etwas weniger adstringierend bewertet. Die Intensität der Bittere wurde nicht nur als deutlich weniger intensiv wahrgenommen, gleichzeitig wurde die Qualität auch als deutlich angenehmer, weniger aggressiv und weniger kratzig bewertet. Um auszuschließen, dass die Versuchspersonen weniger bittere Lösungen als generell angenehmer und weniger kratzend bewerten, wurden zwei bittere Modell- Lösungen gleicher Intensität hergestellt, eine unter Verwendung von Hopfeninhaltsstoffen, die andere unter Verwendung von bitteren Aminosäuren und Polyphenolen. Wie bereits bei den Rekombinaten beobachtet, wurde die Lösung der Isohumulone unter diesen Versuchsbedingungen deutlich kratzig und weniger angenehm empfunden als die iso-bittere Lösung der Aminosäuren/Polyphenole. Somit ist davon auszugehen, dass für eine angenehme Bitterkeit von Bier neben den Hopfeninhaltsstoffen insbesondere den Aminosäuren und Polyphenolen eine bedeutende Rolle zukommt.. Auch im Fall des dunklen Biers ging die Intensität des Bittergeschmacks im Partilrekombinat erwartungsgemäß zurück. Wie bei den Rekombinaten für helles Bier wurde die Qualität der Bittere positiver bewertet als im Totalrekombinat.
2,5
sauer
2
1,5
umami salzig
1
0,5
0 O6
Rekombinat Hell
adstringierend bitter
süß
Abb. 27. Sensorische Bewertung der Versuchsreihe O6 für helles Bier
sauer
2,5
2
1,5
umami salzig
1
0,5
0 O6
Rekombinat Dunkel
adstringierend bitter
süß
Abb. 28. Sensorische Bewertung der Versuchsreihe O6 für dunkles BierVersuchsreihe O7
Das Fehlen der bitteren Substanzen Arginin, Histidin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin,
Tyrosin kennzeichnet die Versuchsreihe O7. Die Abb. 29 stellt die Ergebnisse der
Tests für helles Bier dar. Der Rückgang des bitteren Geschmackseindruckes ging
ebenso wie in der Versuchsreihe O6 im Falle des hellen Bieres mit einer Zunahme
des Süßgeschmacks einher. Trotz der Reduktion der Bitterintensität wurde die
Qualität der Bitterkeit jedoch als kratzig beschrieben, was wiederum die Erkenntnisse
der Versuchsreihe O6 unterstützt.
Die Abb. 30 zeigt die Ergebnisse für dunkles Bier. Die Abnahme des bitteren
Eindrucks war nicht ganz so deutlich wie beim hellen Bier. Auch der Süßgeschmack
wird nicht als intensiver beschrieben. Generell scheinen die bitteren Aminosäuren
daher in hellem Bier eine größere Bedeutung für den Biergeschmack aufzuweisen
als vergleichsweise dunkle Biere.
sauer
2,5
2
1,5
umami salzig
1
0,5
0 O7
Rekombinat Hell
adstringierend bitter
süß
Abb. 29. Sensorische Bewertung der Versuchsreihe O7 für helles Biersauer
2,5
2
1,5
umami salzig
1
0,5
0 O7
Rekombinat Dunkel
adstringierend bitter
süß
Abb. 30. Sensorische Bewertung der Versuchsreihe O7 für dunkles Bier
Versuchsreihe O8
In der Versuchsreihe O8 wurden bei der Erstellung des Rekombinates die
Substanzen Epicatechin-(4-8-)-Epicatechin, Epicatechin-(4-6-)-Epicatechin,
Epicatechin und Catechin weggelassen. Die Abb. 31 zeigt die Ergebnisse der
sensorischen Tests für helles Bier. Obwohl die Einzelsubstanzen Geschmackswerte
von deutlich unter 1 haben, werden die abweichenden Proben eindeutig erkannt. Sie
wurden als weniger bitter und adstringierend beschrieben, was für die Bedeutung der
Polyphenole für den Gesamtgeschmack des hellen Bieres spricht. Die Qualität der
Bittere von Polyphenolen wurde in einer getrennten Versuchsreihe als angenehmer
beschrieben als eine iso-bittere Lösung mit Hopfenbitterstoffen. Gleichzeitig tragen
diese Verbindungen zu adstringierenden Geschmack des Bieres bei.
Die Abb. 32 zeigt die Ergebnisse der sensorischen Prüfreihe für dunkles Bier. Auch
hier wird die hohe geschmackliche Relevanz der Polyphenole deutlich. In der
Bewertung der Qualität der Bittere zeigte sich zudem wie bei den hellen Bieren, dass
der Zusatz von Polyphenolen eine als „angenehm, balanciert“ beschriebene Bittere
bewirkt.2,5
sauer
2
1,5
umami salzig
1
0,5
0
O8
Rekombinat Hell
adstringierend bitter
süß
Abb. 31. Sensorische Bewertung der Versuchsreihe O8 für helles Bier
sauer
2,5
2
1,5
umami salzig
1
0,5
0
O8
Rekombinat Dunkel
adstringierend bitter
süß
Abb. 32. Sensorische Bewertung der Versuchsreihe O8 für dunkles Bier3 Zusammenfassung
Durch Anwendung von Geschmacksverdünnungsanalysen, Bestimmung von
Geschmacksschwellenwerten, quantitativen Analysen und Berechnung von
Geschmackswerten als Quotient der Konzentration und des
Geschmacksschwellenwertes einer Verbindung ist es erstmals gelungen 49
potentielle, geschmacksaktive Verbindungen in hellem sowie dunklem Vollbier in
deren Geschmacksbeitrag zu wichten. Durch anschließende Rekombinations- und
Omissionsexpertimente wurde dann der Geschmacksbeitrag verschiedener
Verbindungsklassen bewertet; dabei ergaben sich folgende Teilergebnisse:
- Maltose, Maltooligosaccharide, süße Aminosäure (ins. Glycin und Alanin),
Glycerin und Ethanol tragen zum Süßgeschmack von Bier bei. In
Omissionsexperimenten wurde deutlich, dass die Gruppe der süßschmeckenden
Substanzen die Geschmackseindrücke bitter, adstringierend und sauer in Bier
partiell maskieren.
- co-Isohumulon, n-Isohumulon, ad-Isohumulon, bittere Aminosäuren (insb.
Tyrosin) sowie die Polyphenole Epicatechin- (4-8-)- Epicatechin, Epicatechin- (4-
6-)- Epicatechin, Epicatechin, und Catechin sind für den Bittergeschmack von
Vollbier verantwortlich. Rekombinate ohne die Hopfeninhaltsstoffe wurden mit
deutlich angenehmerer, weniger kratzigerer Bitterkeit bewertet als entsprechende
Vollrekombinate.
- Neben den Polyphenolen ist die γ-Aminobuttersäure ursächlich am
adstringierenden Geschmack der Biere verantwortlich. Das Fehlen dieser
Substanz führte dazu, dass der Gesamteindruck der Geschmacksrekombinate
nicht mehr als produkttypisch beschrieben wurde.
- Die Gehalte umami-artig schmeckender Nucleotide, süßer Aminosäuren,
kurzkettiger Carbonsäuren und Maltooligosaccharide sind in dunklem Bier höher
als in hellem Bier. Insbesondere die Nucleotide tragen zur Vollmundigkeit des
dunklen Biers bei. Hingegen liegen seifig schmeckende Fettsäuren und die
adstringierende γ-Aminobuttersäure in hellem Bier in erhöhten Konzentrationen
vor, was wiederum mit der erhöhten Adstringenz des hellen Bieres korreliert.ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS AMP Adenosin 5´monophosphat BL Bierlyophilisat CMP Cytidin 5´monophosphat COSY Correlated Spectroscopy DMSO Dimethylsulfoxid et al. und andere GMP Guanosin 5 ´monophosphat GABA γ- Aminobuttersäure GPC Gelpermeationschromatographie GR Gesamtrekombinat GVA Geschmacksverdünnungsanalyse HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation Spectroscopy HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence Spectroscopy HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie HX Hypoxanthin IMP Inosin 5´monophosphat kDa Kilo-Dalton l Liter LMBG Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetz M Molar Ma Masse mg Milligramm min Minuten ml Milliliter mmol Millimol nm Nanometer R Rekombinat TD Taste Dilution TMS Tetramethylsilan UF Ultrafiltration UMP Uridin 5´monophosphat XMP Xanthosin 5´monophosphat
4 Experimenteller Teil 4.1 Probenmatererial Bei dem verwendeten Bier handelt es sich um ein Helles und dunkles Vollbier einer Münchner Großbrauerei. Das verwendete Malz ist ein helles Pilsener Malz. 4.2 Reagenzien Wasser bidest.- Qualität Glucose Merck, Darmstadt Ethanol absolut, p.a. Merck, Darmstadt Fructose Merck, Darmstadt Lanthan(III)oxid Aldrich, Steinheim Maltose Aldrich, Steinheim Maltotriose Aldrich, Steinheim Adenosin 5´monophosphat (AMP) Sigma, München Guanosin 5 ´monophosphat (GMP) Sigma, München Uridin 5´monophosphat (UMP) Sigma, München Inosin 5´monophosphat (IMP) Sigma, München Hypoxanthin (HX) Sigma, München Cytidin 5´monophosphat (CMP) Sigma, München Xanthosin 5´monophosphat (XMP) Sigma, München Acetonitril Merck, Darmstadt Ammoniumformiat Merck, Darmstadt Ameisensäure Merck, Darmstadt Cäsiumchlorid Merck, Darmstadt Methanol, LiChrosolv Merck, Darmstadt Methanol, p.a. Merck, Darmstadt 4-(Methylamino)- phenolsulfat, p.a. Merck, Darmstadt Salpetersäure, 65%, p.a. Merck, Darmstadt Schwefelsäure, 95-97% Merck, Darmstadt Silbernitrat, p.a. Merck, Darmstadt Kaliumdisulfit, mind. 96%, p.a. Merck, Darmstadt Kaliumdihydrogenphosphat, p.a. Merck, Darmstadt
Kaliumhexacyanoferrat(III)- Trihydrat, p.a. Merck, Darmstadt
Kaliumthiocyanat, p.a. Merck, Darmstadt
Zinkacetat Dihydrat, p.a. Merck, Darmstadt
ICE2; Standard für α-Säuren Labor Veritas, Zürich
DCHA- Iso; Standard für Iso- α- Säuren Labor Veritas, Zürich
DMSO Eurisotop, Gif- Sur- Yvette, Frankreich
TMS Eurisotop, Gif- Sur- Yvette, Frankreich
Ammoniumheptamolybdat Tetrahydrat, p.a. Riedel de Haën, Seelze
Enzymtests:
Äpfelsäure Boeringer, Mannheim
Citronensäure Boeringer, Mannheim
Milchsäure Boeringer, Mannheim
Essigsäure Boeringer, Mannheim
Brenztraubensäure Boeringer, Mannheim
Bernsteinsäure Boeringer, Mannheim
Oxalsäure Boeringer, Mannheim
Milchsäure Boeringer, Mannheim
Glycerin Boeringer, Mannheim
4.3 Geräte
Gefriertrocknung: Delta I, Christ
Rotationsverdampfer: Rotavapor R, Büchi, Konstanz
Zentrifuge: GR 412, Jouan
Gelchromatographie:
Detekor: UV-1570/1575, Jasco, Groß-Umstadt
Füllmaterial: Sephadex G15, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg,
Sephadex LH20, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Mobile Phase: Bidest. Wasser, mit HCOOH auf pH 4,5 eingestellt (bei G 15),
75 Vol.% Methanol, 25 Vol.% 10mM NH4HCOO, mit HCOOH auf
pH 3,5 eingestellt (bei LH 20)
Peristaltikpumpe: P-1, Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Probensammler: LKB 2070 Ultrarac II, LKB, Bromma, Schweden
Säule: XK 50/100, Amersham Pharmacia Biotech, FreiburgSchreiber: LKB 2210, LKB, Bromma, Schweden
HPLC:
Pumpe: System 522, Bio- Tek Instruments, Bio- Tek, Neufahrn b. Freising
Detektor: HPLC-Detektor 535, Bio- Tek Instruments, Bio- Tek, Neufahrn b.
Freising
AAS:
Gerät: AA-175 Series (Varian, München)
Lampenstrom: 5mA
Druckluft: 48 Einheiten
Acetylen: 4 Einheiten
Ultrafiltration:
Rührzelle: Amicon 8400, Millipore Corporation, Bedford, USA
Druck: 0,8- 3bar Sickstoff
Membranen: YM100, YM30, YM10, YM3, YM1, Millipore Corporation, Bedford, USA
Enzymatik:
Gerät: Hitachi U-2000 Spetrophotometer
Küvetten: Einmalküvetten, 1cm Schichtdicke
Zuckerbestimmung:
Gerät: Dionex BioLC, Dionex Corporation, Austin, USA
Detektor: Dionex ED50, Electrochemical Detektor, Dionex Corporation, Austin,
USA
AS- Analyse:
Gerät: Aminosäureanalysator LC 3000, Biotronic, Maintal
Probenpuffer: Natriumacetat 8,2g/l, Essigsäure 5ml/l, Methanol 25ml/l,
Ameisensäure 4ml/l, Octansäure 100µl/l, mit Phosphorsäure auf pH 2,2 eingestellt4.4 Methoden 4.4.1 Ultrafiltration Das ohne Schaumverlust entkohlensäuerte Bier (0,5l) wird zunächst in einer Rührzelle mit Überdruck durch eine YM100 Membran mit einer Ausschlußgröße von 100kDa ultrafiltriert. Anschließend wird dreimal mit destilliertem Wasser nachgespült. Der Rückstand wird in destilliertem Wasser aufgenommen und eingefroren. Das Filtrat wird anschließend schrittweise durch YM30, YM10, YM3 und YM1 Membranen ultrafiltriert, eingefroren und zusammen mit den Rückständen gefriergetrocknet. Die dabei erhaltenen Rückstände werden ausgewogen und bis zur weiteren Verwendung eingefroren. 4.4.2 Ethylacetatextraktion 1l Bier wird mit der gleichen Menge Ethylacetat versetzt, 30min geschüttelt und zur Phasentrennung zunächst in einen Scheidetrichter gegeben. Anschließend wird das noch vorhandene Zweiphasengemisch in der Zentrifuge getrennt. Die Ethylacetatfraktion wird gesammelt und eingefroren. In gleicher Weise wird das Verfahren noch zwei Mal wiederholt, so dass insgesamt 3l Ethylacetatfraktion gewonnen werden, die im Rotationsverdampfer vom Lösungsmittel befreit werden. 4.4.3 Gelpermeationschromatographie (GPC) 1g lyophilisiertes Bier (Fraktion
36- 72h: 75 Vol.% Methanol, 25 Vol.% 10mM NH4HCOO,
mit HCOOH auf pH 3,5 eingestellt (LH 20)
72- 108h: 100 Vol.% Methanol (LH 20)
Fließgeschwindigkeit: 3ml/min
Detektor: Jasco UV-1575
Wellenlänge: 300nm
Range: 0,16
Fraktionen: alle 6min
4.4.4 HPLC
4.4.4.1 HPLC der Gelfraktionen
Bedingungen:
Trennsäule: ODS- Hypersil, 5µm C18, 10x250mm
Fließgeschwindigkeit: 2ml/min
Injektor: 100µl Probenschleife
Elutionsmittel: 10mM Ammoniumformiat pH 3,5
Methanol LiChrosolv
Detektion: 300nm und 270nm (Methode I), 280nm (Methode II)
Gradient: von 0% Methanol in 40min auf 100%, 10min halten
(Methode I)
0% Methanol für 10min halten, in 40min auf 100%
Methanol, 10min halten (Methode II)
4.4.4.2 HPLC/MS
Massenspektrometer: LCQ-MS, Finnigan MAT GmbH, Bremen
HPLC-Anlage: Spectrasystem P4000, Finnigan MAT
Probenaufgabe: HPLC- Lauf oder Direkteinlaß (Loop)
Ionisierung: Electrospray Ionisation (ESI); positiv/negativ4.4.4.3 HPLC zur Hopfenanalytik
Die gefriergetrockneten Gelfraktionen werden in 2ml bidest. Wasser aufgenommen
und membranfiltriert.
Standards für α- und Iso-α- Säuren (Labor Veritas, Zürich) werden in Methanol,
LiChrosolv gelöst und bei –18°C gelagert.
Bedingungen:
Trennsäule: Nucleosil 100-5, C18 Hop, 5µm C18, 4x250mm
(Methoden III und IV), ODS- Hypersil, 5µm C18,
10x250mm (Methode V)
Fließgeschwindigkeit: 0,9ml/min (Methoden III und IV), 2ml/min (Methode V)
Injektor: 20µl Probenschleife (Methoden III und IV), 100µl
Probenschleife (Methode V)
Elutionsmittel: Methanol:Wasser:Ameisensäure 63:34:3 (A)
Methanol LiChrosolv (B)
Methanol:Wasser:Phosphorsäure 85:17:0,25 (C)
Acetonitril:Wasser:Methanol:Ameisensäure 40:30:30:10
(D)
Detektion: 314nm und 270nm
Gradient: Bestimmung der α-Säuren (Methode III):
100% C für 35min
Bestimmung der Iso-α-Säuren (Methode IV):
0- 19,5min: 80% A
19,5- 29min: auf 65% A
29- 40min: auf 50% A
40- 42min: auf 80% A
Trennung des Iso-α-Säure- Standards (Methode V):
100% D für 40min
4.4.5 Gaschromatographie
Bedingungen:
Gerät: Carlo Erba GC Typ 5300
(Carlo Erba, Hofheim)
Säule: FFAP fused silica Kapillare 15m x 0,53mmFilmdicke 1,0µm (J&W Scientific, Folsom)
Trägergas: Helium 35kPa
Probenaufgabe: on column
Detektor: FID
Temperaturprogramm: 65°C isotherm, 2min
65°C- 240°C 10°C/min
240°C isotherm 15min
4.4.6 Aminosäureanalyse
Die Analyse freier Aminosäuren erfolgt am Aminosäureanalysator LC 3000 nach
Wieser et al. (1987). Dafür wird die Probelösung derart verdünnt, daß der Gehalt
freier Aminosäuren 2- 5nmol/20µl beträgt. Von der UF-Fraktion50- 70min: 50% B, 50% C halten
70- 72min: auf 60% A, 40% B
72- 80min: 60% A, 40% B halten
4.4.8 Enzymatische Analysen
Die enzymatischen Bestimmungen erfolgen aus ohne Schaumverlust
entkohlensäuertem Bier. Dabei werden Testsätze der Firma Boeringer, Mannheim
verwendet. Die Bestimmung erfolgt unter Berücksichtigung der den Testsätzen
beiliegenden Anleitungen.
Bedingungen:
Gerät: Hitachi U-2000 Spetrophotometer
Küvetten: Einmalküvetten, 1cm Schichtdicke
Detektion: 340nm, wenn nicht anders angegeben
Temperatur: 20-22°C, wenn nicht anders angegeben
4.4.9 Atomabsorbtionsspektroskopie
50ml CO2- freies Bier wurde mit Cäsiumchloridlösung (1g/l Cs) für Na und K und mit
Lanthanoxid (50g/l La) für Ca und Mg geeignet verdünnt. Die Auswertung erfolgt
anhand von Kalibriergeraden aus Standardlösungen. Tabelle 4.1 zeigt die
Meßbedingungen bei der AAS.
Tabelle 4.1 Bedingungen bei der Atomabsorbtionsspektroskopie
Element Wellenlänge [nm] Spalt [nm]
Natrium 589,0 0,5
Kalium 766,5 1,0
Calcium 422,7 0,5
Magnesium 285,2 0,54.4.10 Anorganische Ionen 4.4.10.1 Chlorid Chlorid wurde in Anlehnung an §35 LMBG bestimmt. 25ml Bier wird mit 2ml 0,25M- Kaliumhexacyanoferrat(II)- und 2ml 1M- Zinkacetat- Lösung enteiweißt und mit dest. Wasser auf 50ml aufgefüllt. Nach Filtration und Ansäuern mit 5ml 4M- Salpetersäure 20ml des Filtrates 20ml 0,01M- Silbernitratlösung zusetzen und mit 0,01M- Kaliumthiocyanat zurücktitrieren. 4.4.10.2 Phosphat (Köberlein und Mair- Waldburg, 1955) Der Phosphatgehalt in Bier wird photometrisch bestimmt. Probelösung mit dest. Wasser geeignet verdünnen, mit Molybdänschwefelsäure (5% Ammoniummolybdat in 5ml 2,5M- Schwefelsäure) und Reduktionslösung (bestehend aus Kaliumdisulfit 25%, Natriumsulfit 1%, und 4- (Methylamino)- phenolsulfat 0,2%, 1ml) versetzen und mit dest. Wasser auf 25ml auffüllen. Nach 20min Standzeit die Extinktion bei 578nm gegen dest. Wasser messen. Die Bestimmung des Phosphorgehaltes erfolgt mit Hilfe einer Kalibriergeraden (Kaliumdihydrogenphosphat, 0,8-12mg Phosphor/l). 4.4.11 Nucleotidbestimmung 100mg Ultrafiltrat der Fraktion
Mit den ermittelten Responsefaktoren ist es möglich aus einer Probenlösung, die
ebenfalls den internen Standard enthält, den Gehalt der gesuchten Verbindung zu
errechnen:
RV • m( S ) • P(V )
m(V) =
P(S )
Von Proben und Standard werden Doppelbestimmungen durchgeführt.
Bedingungen:
Trennsäule: Phenyl-Hexyl C18, 5µm, 4,6x250mm
Fließgeschwindigkeit: 1,0ml/min
Injektor: 20µl Probenschleife
Elutionsmittel: 0,01M KH2PO4 mit H3PO4 auf pH 2,8 eingestellt
Detektion: 254nm und 220nm
Gradient: Isokratische Elution, 35min
4.4.12 Sensorik
4.4.12.1 Geschmacksverdünnungsanalyse
Es werden Geschmacksverdünnungsanalysen durchgeführt.
Probenvorbereitung: GPC der BierfraktionWasser) aufnehmen und folgende Verdünnungen
herstellen: 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64.
Temperatur: Raumtemperatur
Testvolumen: je 1ml
Prüfer: 4- 5 geschulte Prüfer
Beurteilungskriterien: Geschmacksrichtungen süß, salzig, sauer, bitter,
adstringierend.
Auswertung: Aus den Angaben der Prüfer werden die Mittelwerte
berechnet.
4.4.12.2 Geschmacksprofile
Es werden Geschmacksprofile der einzelnen Ultrafiltrationsfraktionen und der
Rekombinate, in denen jeweils fünf der sechs Ultrafiltrationsfraktionen enthalten
waren, erstellt.
Probenvorbereitung: UF1: 13,52mg Lyophilisat in 10ml 5%iger EtOH-Lösung
UF2: 8,23mg Lyophilisat in 10ml 5%iger EtOH-Lösung
UF3: 18,40mg Lyophilisat in 10ml 5%iger EtOH-Lösung
UF4: 32,23mg Lyophilisat in 10ml 5%iger EtOH-Lösung
UF5: 45,33mg Lyophilisat in 10ml 5%iger EtOH-Lösung
UF6: 166,22mg Lyophilisat in 10ml 5%iger EtOH-Lösung
R1: UF1, UF2, UF3, UF4, UF5 (Mengen jeweils wie oben
beschrieben) in 10ml 5%iger EtHO-Lösung
R2: UF2, UF3, UF4, UF5, UF6 (Mengen jeweils wie oben
beschrieben) in 10ml 5%iger EtHO-Lösung
R3: UF1, UF3, UF4, UF5, UF6 (Mengen jeweils wie oben
beschrieben) in 10ml 5%iger EtHO-Lösung
R4: UF1, UF2, UF4, UF5, UF6 (Mengen jeweils wie oben
beschrieben) in 10ml 5%iger EtHO-Lösung
R5: UF1, UF2, UF3, UF5, UF6 (Mengen jeweils wie oben
beschrieben) in 10ml 5%iger EtHO-Lösung
R6: UF1, UF2, UF3, UF4, UF6 (Mengen jeweils wie oben
beschrieben) in 10ml 5%iger EtHO-Lösung
GR: UF1, UF2, UF3, UF4, UF5, UF6 (Mengen jeweils wie
oben beschrieben) in 10ml 5%iger EtHO-LösungBL: 280mg Bierlyophilisat in 10ml 5%iger EtHO-Lösung
Temperatur: Raumtemperatur
Prüfer: 7- 9 geschulte Prüfer
Beurteilungskriterien: Beurteilung der Geschmacksrichtungen süß, salzig,
sauer, bitter, adstringierend, auf einer Skala von 0 (=nicht
wahrnehmbar) bis 3 (=stark wahrnehmbar).
Auswertung: Aus den Angaben der Prüfer werden die Mittelwerte
berechnet.
4.4.12.3 Geschmacksschwellenwerte
Zur Geschmacksschwellenwertbestimmung werden Triangeltests nach §35 LMBG
durchgeführt. Die zu testende Verbindung wird in Trinkwasser gelöst und schrittweise
1:1 mit Trinkwasser verdünnt. Anschließend werden die Proben mit je zwei
Trinkwasserproben verschlüsselt. Die Tester müssen die abweichende Probe
erkennen und kennzeichnen, sowie die Geschmacksrichtung vermerken. Um
zufällige Treffer aus der Wertung auszuschließen, werden nur die als richtig
erkannten Proben verwendet, ab der jede weitere Probe in der Verdünnungsreihe
ebenfalls als richtig erkannt wird.
4.4.13 Enzymatische Analyse
Die Bestimmung der Gehalte von Essigsäure, Citronensäure, Äpfelsäure,
Brenztraubensäure, Bernsteinsäure, Oxalsäure, Milchsäure und Glycerin in Bier
erfolgt unter Verwendung von Testsätzen der Firma Boeringer, Mannheim.
4.4.14 Aminosäurenanalyse
Die Analyse freier Aminosäuren der Ultrafiltrationsfraktion UF6 erfolgt am
Aminosäureanalysator LC 3000.
4.4.15 Freie Fettsäuren
Die Quantifizierung der freien Fettsäuren erfolgt über GC-FID nach vorheriger
Anreicherung der Proben mittels Festphasenextraktion an Bond- Elut-Aminopropylphase (ICT, Bad Homburg). Diese wird mit Heptan equilibriert und anschließend die Probe (in dest. Wasser aufgenommenes Bierlyophilisat) aufgegeben. Unpolare Substanzen mit Dichlormethan / 2- Propanol (3:1, 4ml) auswaschen und die Fettsäuren mit Diethylether / Ameisensäure (49:1, 4ml) eluieren. 4.4.16 Nucleotide Die Bestimmung der Nucleotide erfolgt HPLC- analytisch aus entkohlensäuertem Bier. Es können geringe Gehalte an Guanosin 5 ´monophosphat (GMP) und Cytidin 5´monophosphat (CMP) nachgewiesen werden. Als interner Standard dient Xanthosin 5´monophosphat, das in der Probe nicht nachweisbar ist. Auch Adenosin 5´monophosphat, Uridin 5´monophosphat und Inosin 5´monophosphat sind im Bier nicht nachweisbar. 4.4.17 An- und Kationen Es wurden die Gehalte der Anionen Chlorid und Phosphat quantifiziert. Chlorid wurde in Anlehnung an §35 LMBG (L 06.00 5) titrimetrisch nach Vollhard bestimmt. Die Quantifizierung von Phosphat erfolgte photometrisch nach Umsetzung mit Molybdat zu Molybdänblau in Anlehnung an Köberlein und Mair- Waldburg (1955). Die Kationen Natrium, Kalium, Calcium und Magnesium wurden in Anlehnung an die amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach §35 LMBG (L 31.00 10) mittels Atomabsorptionsspektrometrie in Bier quantifiziert. Die Messung erfolgte an einem AA-175 Series von Varian, München.
Sie können auch lesen
