BIOCHEMISCHES PRAKTIKUM 2021

BIOCHEMISCHES PRAKTIKUM
 2021

 für Studierende der Humanmedizin und Zahnmedizin
 der Universität des Saarlandes

 Fachrichtung
 MEDIZINISCHE BIOCHEMIE UND MOLEKULARBIOLOGIE

 SKRIPT ZU DEN PRÄSENZPRAKTIKA 1 UND 2

 Bitte drucken Sie dieses Skript aus und bringen Sie es zu den
jeweiligen Terminen mit. Bitte beantworten Sie vorab schriftlich die
 jeweiligen Vorbereitungsfragen.

 1

Liebe Studierende der Human- und Zahnmedizin!
Nachdem im Sommersemester 2020 coronabedingt kein Präsenzpraktikum stattfinden konnte,
freuen wir uns, Ihnen in diesem Sommersemester eine reduzierte Version anbieten zu können.
Unter Beachtung der derzeit gültigen Abstands- und Hygieneregeln haben wir für Sie eine
kleine Auswahl praktischer Übungen zusammengestellt, die einige wichtige Methoden im
biochemischen Labor abbilden. Maßgeblich für die Auswahl der angebotenen Präsenz-
Versuche waren folgende Punkte:
 - Orientierung an dem bis zum Zeitpunkt des Praktikums präsentierten Vorlesungsstoff
 - die im gesetzten zeitlichen Rahmen mögliche Durchführbarkeit durch einen einzelnen
 Studenten (Vermeidung von Gruppenarbeit)
 - Durchführbarkeit des Versuchs am Laborplatz (Vermeidung von Laufwegen)

Dieses Skript ist in 3 Blöcke eingeteilt:
 I. Voraussetzung
 Hier finden Sie Regeln zum experimentellen Arbeiten im Labor. Sie müssen diese vor
 Beginn der praktischen Arbeiten lesen und mit Ihrer Unterschrift bestätigen, dass
 Sie die darin enthaltene Sicherheitsunterweisung verstanden haben und sich daran
 halten werden.
 II. Anleitung zur Durchführung der Präsenzpraktika 1 und 2
 Im eigentlichen Praktikumsskript finden Sie immer folgende Kapitel:
 ➔ Theoretische Vorbereitung
 Hier finden Sie Empfehlungen zur Vorbereitung und Fragen zur Theorie. Die
 Beantwortung der Fragen sind ihre „Hausaufgaben“, die vor Beginn der
 Veranstaltung gemacht werden müssen.
 ➔ Versuchsanleitung
 Die Versuchsanleitung sollten sie vor Beginn der praktischen Arbeiten
 vollständig durchlesen. Hier finden sie eine Schilderung des Versuchsprinzips, das
 „Rezept“ für die Durchführung des Versuches und Vorgaben zur Auswertung der
 im Experiment erhaltenen Rohdaten.
 Blockpfeile an der linken Seite sollen Ihnen in diesem Teil helfen, die erforderlichen
 Arbeitsaufträge zum jeweiligen Praktikum zu finden.
 III. Anhang
 Hier finden Sie eine Zusammenstellung von Einheiten, Gesetzmäßigkeiten und
 Rechenwegen, die Sie zur erfolgreichen Durchführung des Praktikums benötigen und
 die Ihnen die Auswertung erleichtern sollen. Dieses Kapitel enthält sowohl
 Anleitungen für die Auswertung der Präsenzpraktika als auch der online –
 Praktika.

 2

Sie werden in diesem Praktikum Methoden durchführen, die für die Analytik von Proteinen
eingesetzt werden bzw. Proteine als Werkzeug für den Nachweis bestimmter Parameter
nutzen; die Auswahl der Versuche orientiert sich an der Relevanz für das medizinisch-
diagnostische Labor. Sie lernen einen Teil der Reaktionen kennen, die hinter den Werten eines
Laborberichts stehen und die mittlerweile in automatisierten Abläufen gewonnen werden. Wir
wollen Ihnen mit dieser Auswahl einen Eindruck vom Arbeiten im biochemischen Labor
vermitteln und darüber hinaus die dazugehörige Theorie etwas anschaulicher gestalten.
Konkret lernen sie eine Methode der Proteinbestimmung kennen wie sie für die Bestimmung
des Gesamtproteingehalts im Serum herangezogen werden kann und die Aussagen über eine
Dysproteinämie zulässt (Praktikum 1). Diese quantitative Bestimmung wird im Praktikum 2
ergänzt durch die Auftrennung des Gesamtserumproteins in seine verschiedenen
Untergruppen, eine gängige Labormethode, um z.B. Hinweise auf entzündliche Prozesse,
Funktionstüchtigkeit der Leber, Defekte im Immunsystem oder Tumoren zu erhalten. Eine
wichtige Gruppe der Proteine unseres Organismus sind die Enzyme, die katalytische Aktivität
entfalten und Stoffwechsel überhaupt erst ermöglichen. Im Praktikum 1 wird die alkalische
Phosphatase im Mittelpunkt stehen, ein Enzym, das bei Erkrankungen der Leber und der
Gallenwege sowie für Veränderungen des Knochenstoffwechsels als Marker dient. Sie lernen
mit diesem Enzym grundlegende Charakteristika einer enzymatischen Reaktion kennen.
Enzyme werden in der medizinischen Diagnostik auch zum sensitiven und spezifischen
Nachweis ihrer Substrate benutzt. Der Nachweis der enzymatischen Aktivität erfolgt in
photometrischen Messungen, die unter geeigneten Bedingungen mit Hilfe des Lambert-
Beerschen Gesetzes eine Berechnung einer unbekannten Konzentration erlauben. Sie
werden solche enzymatischen Verfahren anhand der Bestimmung der Glucose- und
Cholesterinkonzentration des Serums im Praktikum 2 kennenlernen.

Wir freuen uns auf eine angenehme Zusammenarbeit und wünschen Ihnen viel Erfolg!

 Die Dozent*innen der Medizinischen Biochemie und Molekularbiologie

 3

INHALTSVERZEICHNIS
 Seite

 I. Voraussetzung 4
 1. Experimentelles Arbeiten im biochemischen Labor 4
 1.1. Sicherheitsunterweisung 4
 1.2. Erforderliche Materialien 6
 1.3. Weitere Regeln für das Arbeiten im Labor 6
 1.4. Handhabungshinweise für Pipetten 7
 1.5. Vor Beginn des Praktikums 8

 II. Anleitung zur Durchführung der Präsenzpraktika 1 und 2 9
 1. Praktikum 1 9
 1.1. Proteinbestimmung nach der Biuret-Methode 10
 1.2. Enzyme als Biokatalysatoren – Alkalische Phosphatase 18
 2. Praktikum 2 25
 2.1. Elektrophoretische Trennung der Serumproteine 26
 2.2. Bestimmung von Cholesterin im Serum 33
 2.3. Bestimmung von Glucose im Serum 38

 III. Anhang 44
 1. Rechnen im Biochemischem Praktikum 44
 1.1. Physikalische Größen und Einheiten 44
 1.2. Stoffmengen und Konzentrationen 46
 1.3. Mischen von Lösungen, das Mischungskreuz 49
 1.4. Grundlegende statistische Verfahren 51
 1.5. Lineare Regression und Korrelationskoeffizient 53
 1.6. Wichtige Gleichungen, Herleitungen und Umformung von 57
 Gleichungen
 1.6.1. Massenwirkungsgesetz und Henderson-Hasselbalch-Gleichung 57
 1.6.2. Das Lambert-Beersche Gesetz 60

 4

I. Voraussetzung
 1. EXPERIMENTELLES ARBEITEN IM BIOCHEMISCHEN LABOR

Dieses Kapitel ist vor der Durchführung des ersten Praktikums zu lesen. Sie müssen
mit Ihrer Unterschrift bestätigen, dass Sie die Sicherheitsunterweisung verstanden
haben und sich daran halten werden.

 1.1. Sicherheitsunterweisung (Laborordnung)

 1. Den Anweisungen der Lehrkräfte ist unbedingt Folge zu leisten.

 2. Während der praktischen Übungen sind Arbeitsmäntel und geschlossene Schuhe zu
 tragen.

 3. Während der praktischen Übung nicht getragene Kleidungsstücke sind außerhalb des
 Praktikumssaals aufzubewahren.

 4. Es ist verboten, im Praktikumssaal zu rauchen, zu essen und zu trinken.

 5. Die Versuche sind so durchzuführen, dass niemand gefährdet wird.

 6. Beim Arbeiten mit konzentrierten Säuren, konzentrierten Laugen und anderen
 ätzenden Substanzen ist - auch von Brillenträgern - eine Schutzbrille zu tragen.

 7. Vor der Benutzung von leicht brennbaren Flüssigkeiten sind - auch auf benachbarten
 Arbeitsplätzen - die Flammen zu löschen.

 8. Allgemein zugängliche Geräte wie Photometer, pH-Elektroden, O2-Elektroden,
 Zentrifugen, Waagen, Elektrophoresegeräte, Homogenisatoren und Trockenschränke,
 sind mit besonderer Sorgfalt zu benutzen.

 9. Die Arbeitsplätze, die Arbeitsgeräte und die Ablaufbecken sind nach jeder praktischen
 Übung zu reinigen. Benutzte Glaswaren sind in Spülkörbe einzuräumen.

 10. Es ist darauf zu achten, dass Wasser, Gas und elektrischer Strom nicht verschwendet
 werden.
 5

11. Nicht mehr gebrauchte Chemikalien und Chemikaliengemische, die nicht in das
 Abwasser gelangen dürfen, sind in bereitstehende Sammelgefäße zu bringen (siehe
 Entsorgungshinweise).

12. Unfälle sind der zuständigen Lehrkraft sofort zu melden.

13. Praktikumsteilnehmer haften für die durch sie beschädigten oder zerstörten Geräte.

14. Den Maßnahmen des aktuellen Hygienekonzepts ist unbedingt Folge zu leisten.
 Dieses wird in der Sicherheitsbelehrung vorgestellt und liegt in Schriftform im
 Praktikumsraum aus.

15. Zuwiderhandlungen gegen diese Ordnung haben den Ausschluss aus der betreffenden
 praktischen Übung zur Folge. Das entsprechende Testat wird in diesem Falle nicht
 erteilt.

 6

1.2. Erforderliche Materialien

Zu den Präsenzpraktika sollten die Praktikumsteilnehmer mitbringen:

 1. Schutzkleidung (Kittel)
 2. Schutzbrille
 3. Schreibzeug, Lineal
 4. Taschenrechner
 5. 1 wasserfester Folienschreiber
 6. Schere und Pinzette
 7. Klebestift

Ohne Schutzbrille und Schutzkleidung (Kittel) kann nicht an der Praktikumsveranstaltung
teilgenommen werden.

 1.3. Weitere Regeln für das Arbeiten im Labor

Unter Berücksichtigung des Hygienekonzeptes sind alle Laufwege innerhalb des
Praktikumsraumes zu vermeiden. Sie finden alles, was sie für die Durchführung der
Versuche benötigen, an Ihrem zugewiesenen Arbeitsplatz. Sollte dies nicht der Fall sein,
melden sie sich bei Ihrem Betreuer.

 - „Richtiges Pipettieren“ beachten (siehe folgende Seite).

 - Infektiöse Materialien bitte direkt entsorgen!!!!!! Gelbe Behälter

 - Anweisung zur Entsorgung von Chemikalien beachten!!!!

 - Reaktionsgefäße (Eppendorfgefäße oder „Eppis“), Reagenzgläser immer beschriften.

 - Beschriftung von Materialien, die gespült werden, bitte entfernen!!! An jedem Platz
 stehen Behälter für die zu spülenden Waren.

 - Abfallbeutel finden Sie an Ihrem Platz.

 - Für Glasabfall steht ein gesonderter Sammelbehälter zur Verfügung.

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1.4. Handhabungshinweise für Pipetten

Eine wichtige Voraussetzung für gutes Gelingen aller Versuche:

Richtiges Pipettieren

Sehr häufig müssen kleine Volumina im Bereich weniger Mikroliter (µl) abgemessen werden.
Dies gelingt am sichersten mit mechanischen Pipettierhilfen, z.B. sogenannten Gilson-
Pipetten, wie hier im Praktikum verwendet.
Beachten Sie die folgenden Regeln und üben Sie den Umgang mit den Pipetten vor dem
Versuch.

1. Niemals das Aufsetzen der Pipettenspitze vergessen!
 Druckknopf außerhalb der Flüssigkeit bis zum ersten Druckpunkt niederdrücken.
 Pipettenspitze einige Millimeter in die Flüssigkeit eintauchen.
 Druckknopf immer langsam in die Ausgangsstellung zurückkommen lassen. Während
 dieses „Ansaugens“ der Flüssigkeit die Pipettenspitze immer in der Flüssigkeit belassen.
 – Bei größeren Volumina (z.B. 1 ml) muss die Pipettenspitze dem sinkenden
 Flüssigkeitsspiegel nachgeführt werden.
 Auf der Außenfläche der Pipettenspitze evtl. haftende Flüssigkeitstropfen abwischen!

2. Zum Entleeren der Pipette die Spitze an der Innenwand des Aufnahmegefäßes
 Anlegen und den Druckknopf über den ersten Druckpunkt hinaus langsam bis zum
 Anschlag niederdrücken.
 Pipette nach vollständiger Entleerung zurückziehen und Druckknopf erst loslassen, wenn
 sich die Pipettenspitze wieder in der Luft befindet!

3. Pipettenspitze abwerfen!
 Achtung!! Neue Spitze für jedes Reagenz!!
 Ebenso nach Berührung unterschiedlicher Lösungen mit der Spitze.

4. Niemals Pipetten mit gefüllter Spitze waagerecht halten oder hinlegen!

Pipetten nicht werfen oder fallen lassen, da das Innere aus Glas besteht und deshalb leicht
zerbrechlich ist

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1.5. Vor Beginn des Praktikums

 Checkliste

 Sicherheitsunterweisung gelesen und verstanden

 Mitzubringende Materialien (siehe S. 6) eingepackt

 Regeln für das Arbeiten im Labor und
 Handhabungsweise für Pipetten gelesen

 Komplette Anleitung für das aktuelle Präsenzpraktikum
 durchgearbeitet

 Theoretische Fragen zum aktuellen Praktikum
 schriftlich beantwortet

 Notwendige Vorarbeiten für die Durchführung (z.B.
 Ausfüllen von Pipettierschemata) erledigt

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II. Anleitung zur Durchführung der Präsenzpraktika 1 und 2

1. PRAKTIKUM 1
09.04.2021 (Zahnmediziner); 12.04.2021-23.04.2021 (Humanmediziner)
1.1. PROTEINBESTIMMUNG NACH DER BIURET-METHODE
1.2. ENZYME ALS BIOKATALYSATOREN – ALKALISCHE PHOSPHATASE

Ablaufplan:
 Inhalt Aufgaben
 Vorbesprechung Sicherheitsbelehrung
 Theorie des Versuchs
 Einweisung zum Einstellen von vorgegebenen Volumina durch die
 Gebrauch von Pipetten Studenten; Kontrolle der Einstellung durch
 und Photometer durch Assistenten
 die Assistenten
 Proteinbestimmung Pipettieren von Standards und bereitgestellten
 Proben unbekannter Konzentration
 Messung der Extinktion
 Erstellen der Eichgerade

 Enzymkinetik Pipettieren der Ansätze mit 5 zur Verfügung
 gestellten Substratlösungen unterschiedlicher
 Konzentration; Aufnahme der Enzymkinetik am
 Photometer
 Nachbesprechung Besprechung der Auswertung

Blockpfeile kennzeichnen Arbeitsaufträge. Die Fragen zu den theoretischen Grundlagen sind
vor Praktikumsbeginn zu beantworten.

 10

1.1 PROTEINBESTIMMUNG NACH DER BIURET-METHODE

 Wieso? - Weshalb? - Warum?
 Im Praktikum 1.1. geht es darum einen wichtigen klinischen Laborparameter zu
 bestimmen, die Protein- oder Eiweißkonzentration, wie sie z.B. im klinischen Labor
 routinemäßig für Serum oder Plasma ermittelt wird und in Kombination mit der Serum- bzw.
 Plasmaelektrophorese (Präsenzpraktikum 2) die Diagnose von Dysproteinämien
 ermöglicht.
 Im Rahmen dieses Versuches erhalten Sie eine Einführung in die Photometrie als eine
 einfache, sehr empfindliche und sehr genaue Messmethode, die in allen klinischen und
 biochemischen Laboratorien für zahlreiche Bestimmungen angewendet wird

Theoretische Vorbereitung

Löffler/Petrides/Heinrich 9. Auflage: Kapitel 1, 3, 4, 5
Vorlesung: Funktionelle Biochemie

Fragen zu den theoretischen Grundlagen:
 1. Erklären Sie den Aufbau eines Proteins (Grundbausteine, Peptidbindung, Hierarchie
 der Proteinstruktur).

 2. Welche Aufgaben haben Proteine?

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3. Erläutern Sie den Begriff „optischer Test“

4. Nennen Sie das Lambert-Beersche Gesetz, definieren Sie die Größen und ordnen Sie
 diesen die passenden Dimensionen (Einheiten) zu.

5. Erläutern Sie die Bedeutung der Protein- oder Eiweißbestimmung in der klinischen
 Chemie. Wie hoch ist der Normwert für den Serumproteingehalt und durch welche
 Erkrankungen kann er beeinflusst werden?

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Versuchsanleitung

Anleitung vor Beginn komplett durchlesen!!

Versuchsprinzip
Zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Proteinen wird die Biuret-Reaktion
verwendet. Sie hat ihren Namen von der Reaktion zwischen Biuret (bildet sich beim Erhitzen
 2+
von festem Harnstoff unter NH3-Abspaltung) und Cu -Ionen in alkalischer Lösung. Dabei
entsteht eine anionische, violette Komplexverbindung. Entsprechende violette Cu2+-Komplexe
werden von allen Substanzen mit mindestens 2 Peptidbindungen gebildet (Abb. 1). Ammoniak,
Harnstoff, Harnsäure, Kreatinin, Aminosäuren und Dipeptide geben keine Biuret-Reaktion.

Abb.1: Cu(II)-Protein-Komplex

 Cu2+

Die Farbintensität ist der Zahl der Peptid-Bindungen und damit auch der Proteinkonzentration
proportional. Das Lambert-Beersche Gesetz

 E = .c.d

(E = Extinktion,  = molarer Extinktionskoeffizient, c = Konzentration, d = Schichtdicke der
Küvette) ist somit anwendbar. Die Biuret - Methode ist wegen ihrer Einfachheit und hohen
Spezifität von besonderer Bedeutung für quantitative Bestimmungen von Proteinen. In diesem
Versuch bestimmen sie die Proteinkonzentration einer zur Verfügung gestellten Serumprobe
mit Hilfe von Eichlösungen bekannter Konzentration.
Zur Bedeutung und zum Umgang mit dem Lambert-Beerschen Gesetz lesen Sie bitte
den Absatz „Das Lambert-Beersche Gesetz“ im Anhang.

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Vorbereitung:
Üben Sie das Pipettieren mit den am Platz stehenden Pipetten. Stellen Sie nach Vorgabe
unterschiedliche Volumina ein und pipettieren Sie unterschiedliche Mengen einer Flüssigkeit
(Wasser) in unterschiedliche Behältnisse („Eppis“, Reagenzgläser).

Vervollständigen Sie das Pipettierschema für die praktische Durchführung.
Proteinstandardlösung und NaCl Lösung sollen zusammen jeweils 1 ml ergeben!

 Ansatz Proteinmenge Probe Proteinstandard NaCl Biuret- Extinktion
 Nr. 5 mg/ml Reagenz E546nm

 [mg] [ml] [ml] [ml] [ml]
Für die Eichwerte:
1 0 - 2.5
Leerwert
2 1 - 2.5
3 2 - 2.5
4 3 - 2.5
5 4 - 2.5
6 5 - 2.5
 Für die Analyse der Serumprobe mit unbekannter Konzentration (Dreifachansatz):
7 ? 1 - - 2.5
8 ? 1 - - 2.5
9 ? 1 - - 2.5

Praktische Durchführung:

Die Proteinkonzentration einer Serumprobe mit unbekannter Konzentration soll bestimmt
werden. Die Serumprobe wurde vorab 20fach verdünnt. Bedenken Sie dies bei der
Berechnung der Konzentration.

 1. Pipettieren Sie nach obigem Pipettierschema die Proteinstandardlösungen sowie den
 Dreifachansatz der Probe unbekannter Konzentration in Plastikröhrchen zusammen.
 Mischen Sie zunächst für alle Proben NaCl- und Proteinlösung. Zuletzt fügen Sie allen

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Proben das Biuretreagenz mit Hilfe einer Stabpipette hinzu. Verschließen sie das
 Röhrchen mit Parafilm und mischen Sie den Ansatz sorgfältig!!

 2. Nach dem Pipettieren in Röhrchen und Mischen wird die Reaktionszeit von 15 min
 abgewartet.

 3. Pipettieren Sie 1 ml des gesamten Ansatzes in Küvetten

 4. Mit der ersten (Leerwert)-Probe (Ansatz 1) wird am Photometer der Nullwert eingestellt.
 Dann werden sukzessiv die Extinktionen der Ansätze bei 546 nm gemessen. Nicht
 vergessen: Deckel des Photometers vor jedem Ablesen schließen!

 5. Die genaue Anleitung zur Durchführung der photometrischen Messung befindet
 sich an Ihrem Platz!

 6. Die Extinktion (Absorption) wird im Display angezeigt. Ablesen und in die obige Tabelle
 übertragen.

Entsorgung:
Die Küvetteninhalte sind in an Ihrem Platz bereitstehende Gefäße zu gießen, die
entleerten Küvetten in Abfallbeutel zu entsorgen.

Auswertung:

 Tipps zur Auswertung und Beispiel im Anhang, S. 56 („Rechnen im
 Biochemischen Praktikum“).

 1. Erstellen Sie die Eichkurve für 0, 1, 2, 3, 4 und 5 mg Protein; nutzen Sie das unten
 eingefügte Millimeterpapier (formatfüllende Auftragung!). Auf der X-Achse wird die
 Konzentration der Lösungen abgetragen, auf der Y-Achse die Extinktion bei 546 nm.

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2. Legen Sie eine Bestgerade durch die Punkteschar; diese muss auf jeden Fall durch
 den Nullpunkt gehen. Die Proteinkonzentration der Serumprobe soll einerseits aus der
 Eichkurve abgelesen werden, andererseits mit Hilfe der Geradengleichung
 rechnerisch bestimmt werden.

Vorgehensweise zum Erstellen eines aussagekräftigen Diagramms:
 - Beschriftung der x-Achse und der y-Achse mit entsprechendem Achsentitel und
 passenden Einheiten
 - Bestimmen Sie den jeweils kleinsten und größten x- bzw. y-Wert.
 - Nutzen sie zur Auftragung der Werte das gesamte Millimeterpapier (formatfüllende
 Auftragung), d.h. Null liegt im Schnittpunkt von x- und y-Achse, der größte x- bzw. y-
 Wert wird so weit entfernt wie möglich vom Nullpunkt an der entsprechenden Achse
 abgetragen.
 - Teilen sie die Werte dazwischen entsprechend ein.

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Die Geradengleichung zur Berechnung der Konzentration der unbekannten Probe lautet:
 y=m∙x+b

 y = E (Extinktion); x = c (Konzentration); b = 0;
 Dy E2 - E1
 m = Steigung = Dx = c2 -c1

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3. Wie hoch ist die Proteinkonzentration in mg/ml in der verdünnten Serumprobe? Geben
 Sie den Wert in mg/ml und mmol/ml an.
(Legen Sie die Molmasse von Albumin (= 65 000 Dalton) zugrunde.)

abgelesen:

errechnet:

 4. Stimmt der Wert mit der Normproteinkonzentration im Serum überein? Bedenken Sie
 bei der Berechnung dieser Konzentration, dass die Serumprobe für die Messung
 20fach verdünnt wurde.

 5. Berechnen Sie, wie viel Gramm Albumin in einem ml einer 0,25 µM Lösung enthalten
 sind (Molmasse von Albumin: 65 000 Dalton) (siehe auch: III. Anhang, 1.2.
 Stoffmengen und Konzentrationen).

Chemikalien und Lösungen:
 1. Biuret-Reagenz: 0.3% (w/v) CuSO4, 0.9% (w/v) K-Na-Tartrat + 0.2% (w/v) KI in 0.2 M
 NaOH
 2. Standard-Proteinlösung: 5 mg Rinderserumalbumin/ml 0.9% (w/v) NaCl-Lösung
 3. Serumprobe mit unbekannter Konzentration zur Proteinbestimmung
 4. NaCl-Lösung 0.9% (w/v)

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1.2 ENZYME ALS BIOKATALYSATOREN – ALKALISCHE PHOSPHATASE

 Wieso? – Weshalb? – Warum?
 Enzyme sind wichtige Werkzeuge des Stoffwechsels. Ohne sie ist Leben – so wie wir es
 kennen – nicht denkbar. Das teilweise oder vollständige Fehlen eines Enzyms führt häufig
 zu mehr oder minder schweren Defekten, die sogar tödlich verlaufen können. Enzyme sind
 ebenfalls wichtige Werkzeuge der Forschung und der medizinischen Diagnostik. Sie
 sind dort selbst Gegenstand der Analytik (z.B. Nachweis von Enzymen bei der
 Leberfunktions- oder Herzinfarktdiagnostik) oder ermöglichen den sensitiven und
 spezifischen Nachweis von Stoffwechselmetaboliten (z.B. Nachweis von Glucose in Serum
 und Urin, Nachweis von Cholesterin, siehe Praktikum 2). Um Enzyme sinnvoll und effizient
 in der Diagnostik einsetzen zu können, müssen optimale Versuchsbedingungen (z.B.
 optimaler pH-Wert, optimale Substratkonzentrationen) geschaffen werden. Dies soll
 beispielhaft an der Bestimmung der Abhängigkeit der Umsatzgeschwindigkeit von der
 Substratkonzentration (Kinetik) für die alkalische Phosphatase erarbeitet werden.

Theoretische Vorbereitung

Löffler, Petrides, Heinrich: Biochemie und Pathobiochemie, 9. Auflage; Kapitel 7 - 9, S. 101 –
129
Vorlesung: Funktionelle Biochemie

Fragen zu den theoretischen Grundlagen:
Was ist ein Enzym, wie ist es aufgebaut (typische funktionelle Einheiten) und welche Wirkung
hat es auf Stoffwechselreaktionen?

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Was versteht man unter einer Enzymkinetik und beschreiben sie zwei Arten der Darstellung
(mathematische Formel, graphische Darstellungen). Was besagen die beiden Kenngrößen
vmax und km? Welche Einheiten haben diese und wo in der o.g. graphischen Darstellung kann
man sie ablesen?

Welche Arten der Hemmung eines Enzyms gibt es (nennen sie mindestens 2)? Wie verändern
sich vmax und km?

Nennen sie Hemmstoffe von Enzymen, die klinisch z.B. zur Krebsbehandlung oder
zur Schmerzbehandlung eingesetzt werden. (2 Beispiele)

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In welche Hauptgruppe der Enzyme gehört die im Praktikum benutzte alkalische
Phosphatase? Warum spielt dieses Enzym in der medizinischen Diagnostik eine Rolle?

Versuchsanleitung

Anleitung vor Beginn komplett durchlesen!!

Versuchsprinzip
Proteinkinasen und ihre Gegenspieler die Phosphatasen sind an der Regulation zahlreicher
biochemischer Vorgänge beteiligt. Sie übertragen in aller Regel eine Phosphatgruppe von
einem ATP Molekül auf ein Substrat (Proteinkinasen) oder entfernen ein Phosphat von einem
Substrat (Phosphatasen). Die meisten Phosphatasen sind sehr unspezifische Enzyme, welche
die Hydrolyse von Phosphorsäureestern katalysieren (Gleichung (1)).

 (1) R-O-PO3H2 + H2O R-OH + H3PO4

Die im Versuch benutzte alkalische Phosphatase ist ein Zink-haltiges Enzym. Sie katalysiert
die Übertragung der Phosphatgruppe des Substrats auf Wasser oder auch auf andere
Substrate. Im Versuch dient p-Nitrophenyl-phosphat (p-NPP) als synthetisches Substrat, das
entsprechend Gleichung (2) gespalten wird.

(2)

 21

Das dabei entstehende p-Nitrophenol hat in alkalischer Lösung ein Absorptionsmaximum bei
405 nm, dessen Zunahme photometrisch verfolgt werden kann. Die Bildung des gelb
gefärbten Substrats ist zu Beginn der Reaktion proportional der Geschwindigkeit und damit
der Aktivität des Enzyms.
Da die Reaktionsgeschwindigkeit in der Regel nicht über längere Zeit konstant ist, extrapoliert
man die in den ersten Minuten nach dem Start der Reaktion gemessenen Werte auf die
Anfangs- oder Initialgeschwindigkeit. Nur in diesem Bereich ist eine Anwendung des
Lambert-Beerschen Gesetzes zulässig (siehe unten).
Der Zusammenhang zwischen der Reaktionsgeschwindigkeit und dem Lambert-Beerschen
Gesetz ist in Gleichungen (3) und (4) dargestellt:

(3) E=∙c∙d

(4)
 
 = = ⋅
 ⋅ 

Aus der Bestimmung von E/t (Extinktionsänderung pro Zeit) lässt sich daher über das
Lambert-Beersche Gesetz leicht der Umsatz/Zeit (S/t in [µmol/min]) und damit die
Geschwindigkeit v oder Aktivität des Enzyms berechnen.( und d sind feste Größen).
Als Substrat für die alkalische Phosphatase wird p-Nitrophenylphosphat (NPP) verwendet, bei
dessen Hydrolyse p-Nitrophenol entsteht. Zur Ermittlung der Reaktionsgeschwindigkeit wird
die photometrische Messung des entstehenden p-Nitrophenolat-Anions bei 405 nm
herangezogen. Zur Aufnahme der Kinetik werden Messungen mit Substratlösungen mit 5
unterschiedlichen Konzentrationen an NPP durchgeführt.

Vorbereitung:
Pipettierschema zur Herstellung der unterschiedlich konzentrierten Enzym-Substratlösungen:
Vervollständigen Sie das untenstehende Pipettierschema. Gehen Sie bei der Herstellung der
unterschiedlich konzentrierten Substrat-Puffer-Gemische von 1 ml Gesamtvolumen aus! Die
Substratstammlösung ist 0,05 mM.
 0,005 mM 0,01 mM 0,015 mM 0,03 mM 0,05 mM
 NPP-
 Substratlsg.
 [ml]
 Pufferlsg.
 [ml]

 22

Praktische Durchführung - Aufnahme einer Enzymkinetik
 1. Setzen Sie nach dem obigen Pipettierschema die jeweilige Substrat-Puffer-
 Gemische (1 ml) in Reaktionsgefäßen an.

 2. Überführen Sie davon 990 µl in Halbmikroküvetten.

 3. Stellen Sie mit Hilfe der ausgelegten Bedienungsanleitung für das Photometer das
 passende Kinetikprogramm für die Messung ein.

 4. Führen sie die Messung durch wie in der ausgelegten Anleitung beschrieben.

 5. Führen Sie die Messung mit allen Ansätzen durch. Die Umsatzgeschwindigkeiten
 werden ausgehend von der niedrigsten bis zur höchsten Substratkonzentration
 bestimmt.

 6. Tragen sie die Extinktionsänderung/Zeit (E/min) in die untenstehende Tabelle ein

Tragen sie hier die gemessenen Extinktionsänderungen ein:

 [NPP] 0,005 mM 0,01 mM 0,015 mM 0,03 mM 0,05 mM
 E/min

 23

Auswertung

Berechnen Sie aus den gefundenen Extinktionsänderungen die Aktivität bzw. Geschwindigkeit
 -1 2
des Enzyms. Berechnen Sie 1/v und 1/[S] (mM für p-Nitrophenol bei 405 nm: 18.5 µmol ∙cm ).

(Formel ist im Tabellenkopf angegeben.)
Rechnen Sie die jeweiligen Substratkonzentrationen für die graphische Darstellung in
µM um.

 [S] 1/[S] E/min Aktivität v 1/v
 E/min
 18.5 x 1
 [µM] [1/µM] [µmol/min] [min/µmol]

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Bestimmen Sie den vmax und den KM-Wert durch Auftragung der errechneten Werte nach

Lineweaver-Burk.

Denken sie bei der Darstellung des Diagramms an die Tipps von Seite 15!

Chemikalien und Lösungen:
 1. Pufferlösung pH 8
 2. Substratlösung 0,05 mM
 3. Alkalische Phosphatase

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PRAKTIKUM 2
10.05.2021 (Zahnmediziner); 15.04.2021-07.05.2021 (Humanmediziner)
2.1. ELEKTROPHORETISCHE TRENNUNG DER SERUMPROTEINE
2.2. BESTIMMUNG VON CHOLESTERIN IM SERUM
2.3. BESTIMMUNG VON GLUCOSE IM SERUM

Ablaufplan:
 Inhalt Aufgaben
 Vorbesprechung Theorie des Versuchs

 Serumelektrophorese 1 Vorbereitung der Elektrophorese; Überführung
 bereitgestellter Seren auf die
 Celluloseacetatfolie; Starten der Elektrophorese
 durch die Assistenten
 Cholesterinbestimmung Pipettieren von Standards und bereitgestellten
 im Serum Serumproben
 Messung der Extinktion
 Berechnen der unbekannten Konzentration
 Serumelektrophorese 2 Entnahme der Celluloseacetatfolie aus der
 Elektrophoresekammer; Anfärbung der
 getrennten Proteine; Elution des an die Proteine
 gebundenen Farbstoffs und Bestimmung der
 Konzentration durch photometrische Messung
 Glucosebestimmung im Pipettieren von Standards und bereitgestellten
 Serum Serumproben
 Messung der Extinktion
 Berechnen der unbekannten Konzentration
 Nachbesprechung Besprechung der Auswertung

Blockpfeile kennzeichnen Arbeitsaufträge. Die Fragen zu den theoretischen Grundlagen sind
vor Praktikumsbeginn zu beantworten.

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2.1. ELEKTROPHORETISCHE TRENNUNG DER SERUMPROTEINE

 Wieso? - Weshalb? - Warum?
Das Blutplasma (das ist der nicht korpuskuläre Anteil des Blutes) enthält 7 bis 8.5 Gewicht%
Eiweiß, das ein Gemisch von ca. 90 verschiedenen Proteinen von unterschiedlicher
Konzentration und Funktion darstellt. Einige wichtige Proteine oder Proteingruppen und einige
wichtige Funktionen sind: Albumin (Transport, Osmose), Immunglobuline (Abwehr),
Lipoproteine (Transport), Fibrinogen (Vorstufe eines Gerüstproteins für die Blutgerinnung),
Transferrin (Transport), Antitrypsin (Protease-Hemmstoff), Enzyme und Vorstufen für Enzyme
(Katalyse), Hormone (Regulation). Für die Diagnostik ist die Bestimmung der Konzentration
einzelner Proteine oder Proteingruppen von Bedeutung. Die Konzentration der Serum- und
Plasmaproteine gibt einen ersten Hinweis auf vorliegende Erkrankungen. Bei der Vielzahl
und der Ähnlichkeit der physikalischen und chemischen Eigenschaften verbietet sich wegen
des großen Aufwands die Reindarstellung (Isolierung) und meist auch der spezifische
Nachweis. In solchen Fällen wird ein Trennverfahren (hier die Elektrophorese) mit einem
Gruppennachweis (hier ein Färbereagenz für alle Proteine) kombiniert.

Theoretische Vorbereitung

Löffler/Petrides/Heinrich 9. Auflage: Kapitel 67
Vorlesung: Funktionelle Biochemie
Video zur Serumelektrophorese: https://www.youtube.com/watch?v=z2D7ZkT3aOo

Fragen zu den theoretischen Grundlagen:

 Erläutern Sie das Prinzip der Elektrophorese. Welche Faktoren beeinflussen die
 Auftrennung von Proteinen?

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Welche Aufgaben haben die Plasmaproteine? Nennen sie von jeder Fraktion mindestens
2 Vertreter mit ihren Funktionen. Wie unterscheiden sich Serum und Plasma?

Erläutern Sie die Begriffe „Dysproteinämie, Hyperproteinämie, Hypoproteinämie,
Paraproteinämie“. Welchen Parameter benötigt die Ärztin/der Arzt zusätzlich zum Ergebnis
der Plasma- bzw. Serumelektrophorese zwingend für die Diagnose einer Dysproteinämie?

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Wie ändert sich die Zusammensetzung der Plasmaproteine bei
 1. akuter Entzündung, 2. chronischer Entzündung, 3. Leberzirrhose?
Skizzieren Sie schematisch die zu erwartenden Elektropherogramme im Vergleich zum Serum
eines gesunden Menschen.

 29

Versuchsanleitung

Anleitung vor Beginn komplett durchlesen!!

Versuchsprinzip:
Die elektrophoretische Auftrennung der Serum- bzw. Plasmaproteine wird routinemäßig für
diagnostische Zwecke herangezogen.
Die Tatsache, dass sich geladene Teilchen in einem elektrischen Feld in Richtung auf die
entgegengesetzt geladene Elektrode bewegen (Elektrophorese), wird zur Charakterisierung
und Trennung von Proteinen verwendet. Wanderungsrichtung und -geschwindigkeit hängen
von der elektrischen Ladung, der Größe der Proteinteilchen sowie von äußeren Bedingungen
wie pH-Wert, Ionenstärke, Art des Puffers und Temperatur ab.
Die hier durchgeführte Elektrophorese auf Celluloseacetatfolie wird auch im Kliniklaboratorium
bei der Untersuchung der Protein-Muster von Plasma, Serum, Liquor und Biopsieproben
eingesetzt. Sie ist vielseitig anwendbar und kann in Kombination mit enzymatischen
Untersuchungen auch zur Erfassung des Isoenzymmusters verwendet werden. Die
routinemäßig durchgeführte elektrophoretische Auftrennung des Blutserums Gesunder ergibt
mindestens 5 Fraktionen: Albumine, 1-Globuline, 2-Globuline, ß-Globuline und -Globuline

(siehe untenstehende Abbildung).
Zur Sichtbarmachung der getrennten Proteinfraktionen (Proteinbanden) mit proteinfärbenden
Farbstoffen dienen in der Regel Amidoschwarz, Bromphenolblau, Coomassie-Blau oder
Ponceaurot. Für die quantitative Auswertung müssen die Farbstoffgehalte proportional dem
Proteingehalt einer Bande sein. Die quantitative Auswertung der angefärbten Proteinbanden
erfolgt meistens durch eine direkte photometrische Analyse. Man erhält dann die relativen
Konzentrationen. Man kann auch, wie in unserem Fall, die relativen Konzentrationen der
angefärbten Proteinfraktionen durch separate Extinktionsmessungen der aus den einzelnen
Proteinbanden erhaltenen Eluate ermitteln.

 30

Abb.: Elektrophoretische Trennung der Serumproteine

In diesem Praktikum sollen die elektrophoretische Auftrennung in Proteingruppen und deren
prozentualer Anteil am Gesamtserumprotein eines gesunden oder kranken Probanden
bestimmt werden. Das Gesamtprotein wurde im Praktikum 1 quantitativ mit der Biuretmethode
bestimmt und ist integraler Bestandteil der klinischen Bewertung der Plasma- bzw.
Serumelektrophorese.

Praktische Durchführung:
 1. Die Celluloseacetatfolie finden sie im Pufferbad. Bitte nehmen sie diese mit Hilfe einer
 Pinzette aus dem Puffer und legen Sie den Streifen auf ein Papierhandtuch; streifen
 sie die überschüssige Flüssigkeit leicht mit einem Papierhandtuch ab (Achtung: matte
 Seite des Streifens muss sichtbar sein (=Trägermaterial), d.h. die abgeschnittene
 Ecke rechts oben positionieren (siehe Abbildung unten)). Beschriften Sie den Streifen
 mit einem Bleistift (Initialen ihres Namens) am rechten Rand.

 Die Streifen dürfen nicht austrocknen!

 2. Mit einer Pipette bringt man einen Tropfen (ca. 10 µl) des bereit gestellten Serums
 (Bezeichnung notieren!) auf ein Stück Parafilm (Wachsfolie). Nun wird die Doppel-
 Lamelle eines Auftragstempels vorsichtig in das Serum eingetaucht und dann zwischen
 den Ausstanzungen/Faltkanten (nahe der Ausstanzung/Faltkante auf der rechten
 Seite) der Folie leicht aufgedrückt (siehe Abbildung).

 Auftragstelle →

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3. Die Folie wird jetzt mit der Auftragstelle des Serums zum Minuspol in die
 Trennkammer eingelegt, beide Enden der Folie müssen im Pufferbad liegen.
 Den Deckel der Kammer auflegen und anschließend die Elektroden mit der
 Stromquelle (200 V Gleichstrom) verbinden. (60 min Laufzeit).

 Unfallverhütungsvorschrift: Das Ein- und Ausschalten des Stroms darf nur von
 der Lehrkraft vorgenommen werden.

4. Während der Laufzeit der Elektrophorese führen Sie den Versuch zur
 Cholesterinbestimmung (2.2) durch.
5. Bereiten Sie die Röhrchen für die Elution vor (siehe Schritt 8.)
6. Nach 60 min wird der Strom ausgeschaltet, die Folie aus der Kammer
 herausgenommen und 3 min in der Färbelösung langsam hin und her bewegt.
7. Dann wird die Folie 3 min im Entfärbebad langsam hin und her bewegt bis nur noch die
 rote Farbe der Protein-Fraktionen zu sehen ist.
8. Die angefärbten Protein-Fraktionen werden von dem am besten auswertbaren Streifen
 (diese Folie darf nicht austrocknen) direkt sorgfältig ausgeschnitten und jeweils
 getrennt in ein vorher beschriftetes Röhrchen gebracht.
9. Man gibt 3 ml Elutionslösung zu.
10. Nach 10minütigem gelegentlichem Schwenken misst man nach Überführen von 1 ml
 Eluat in eine Halbmikroküvette die Extinktion der Eluate bei 546 nm gegen die
 Elutionslösung (Leerwert). Bitte darauf achten, dass die Folienreste nicht in die Küvette
 gelangen.

 Richten sie sich bei der photometrischen Messung nach der an ihrem
 Platz ausliegenden Anleitung!

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Auswertung

 Ermitteln Sie die Anzahl, die Wanderungsrichtung und die relativen prozentualen Anteile der
 elektrophoretisch aufgetrennten Plasma-Proteinfraktionen. Ordnen Sie die getrennten
 Proteinbanden nach fallenden Wanderungsgeschwindigkeiten den aus der Literatur
 bekannten Fraktionen zu. Bewerten Sie das Ergebnis. Handelt es sich um das Serum einer
 gesunden oder kranken Person? Woran könnte diese Person gegebenenfalls leiden?

Chemikalien und Lösungen:

1. Spezialfolie für Elektrophorese
2. Pufferbad
3. Färbelösung: Ponceaurot in 3% (w/v) Trichloressigsäure (TCA)
4. Entfärbelösung: 5% (v/v) Essigsäure
5. Elutionslösung (NaOH)
6. bereitgestelltes Serum eines gesunden oder kranken Probanden
 (es handelt sich nicht um das Serum aus Versuch 1!)

 33

2.2. BESTIMMUNG VON CHOLESTERIN IM SERUM
 Wieso? - Weshalb? - Warum?
Cholesterin gehört chemisch gesehen zu den Isoprenlipiden und wird in allen Zellen unseres
Körpers benötigt; es spielt eine zentrale Rolle bei der Bildung von Gehirnzellen, Nervenzellen
und bestimmten Hormonen. Ein zu hoher Cholesteringehalt im Blut (Hypercholesterinämie) ist
einer der Hauptrisikofaktoren für Erkrankungen der Herzkranzgefäße, in deren Folge es zu
einem Herzinfarkt oder einem Schlaganfall kommen kann. Zusammen stellen diese
Krankheiten die Haupttodesursache in Europa dar. Die Bestimmung des Cholesteringehalts
im Serum, entweder als Gesamtcholesterin wie im folgenden Versuch oder differenziert nach
dem an die Trägerlipoproteine LDL und HDL gebundenen Cholesterin, stellt ein
Standardverfahren im medizinisch-diagnostischen Labor dar.

Theoretische Vorbereitung

Vorlesung: Energiestoffwechsel Lipide
Löffler, Petrides, Heinrich: Biochemie und Pathobiochemie, 9. Auflage, Kapitel 23

Fragen zu den theoretischen Grundlagen:

Wie hoch sind die Normwerte für den Cholesteringehalt des Serums? Ab welchem Wert spricht
man von einer Hypercholesterinämie?

Schildern Sie die Biosynthese des Cholesterins bis zum aktiven Isopren (danach nur noch
Prinzipien erläutern). Welches ist das regulatorische Enzym der Cholesterinbiosynthese? Wie
erfolgt die Regulation?

 34

Wie wird Cholesterin im Blut transportiert? Welche Bedeutung hat in diesem Zusammenhang
das Enzym Lecithin-Cholesterin-Acyltransferase (LCAT).

Versuchsanleitung

Anleitung vor Beginn komplett durchlesen!!

Versuchsprinzip
Etwa 70% des Cholesterins liegen im Serum als Ester höherer Fettsäuren (überwiegend
Linolsäure) vor. Die Bestimmung des Cholesterins erfolgt mit Hilfe der Cholesterinoxidase (Gl.
(2)) nach Freisetzung des Cholesterins aus seinen Estern mittels der Cholesterinesterase (Gl.
(1)). Wasserstoffperoxid bildet mit Phenol und 4-Amino-phenazon einen roten Farbstoff (Gl.
(3)), der photometrisch erfasst wird.

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Cholesterinesterase
(1) Cholesterinester + H2O Cholesterin + Fettsäure

z.B.:

Palmitoyl-Cholesterin Cholesterin Palmitinsäure

 Cholesterinoxidase
(2) Cholesterin + O2 4-Cholestenon + H2O2

 Peroxidase
(3) 2 H2O2 + 4-Aminophenazon + Phenol 4-(p-Benzochinon-
monoimino)-phenazon + 4 H2O

Praktische Durchführung

Das Gesamtcholesterin des Serums wird mit Hilfe nachfolgender Vorschrift bestimmt:
 1. Verwenden Sie die Serumproben (A, B), die für Sie am Arbeitsplatz bereitstehen.

 2. Pipettieren sie die Proben nach folgendem Schema. Vergessen Sie nicht die Ansätze
 gut zu durchmischen!

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Angaben pro Reaktion; insgesamt 4 Reaktionen (1 Leerwert, 2 Serumproben,
 1 Standard) ansetzen:

 Leerwert Probe Standard

 Serumprobe (A, B) − 0,01 ml −

 Reagenzlösung zur
 1,00 ml 1,00 ml 1,00 ml
 Cholesterinbestimmung

 Standard − − 0,01 ml

 3. Gut mischen; die Ansätze 20 min bei 25°C (Raumtemperatur) inkubieren. Direkt nach
 der Inkubation oder spätestens nach 40 min Extinktion der Analyse und des Standards
 gegen den Leerwert bei 546 nm messen.

 4. Lesen sie die Extinktion ab, nachdem sie mit Hilfe des Leerwerts den Nullabgleich
 durchgeführt haben.

 Richten sie sich bei der photometrischen Messung nach der an ihrem Platz
 ausliegenden Anleitung!

Extinktion Standard:
 Probe A:
 Probe B:

Auswertung

Die Bildung des roten Farbstoffs ist direkt proportional zur eingesetzten
Cholesterinkonzentration. Die Konzentration könnte daher mit Kenntnis des
Extinktionskoeffizienten  für den gebildeten Farbstoff mit Hilfe des Lambert-Beerschen
Gesetzes berechnet werden. Zur einfacheren Auswertung im Laboralltag wird bei dieser
Messung jedoch die Extinktion eines Standards mit bekannter Konzentration gemessen und
dieser ins Verhältnis zur Extinktion der unbekannten Probe gesetzt. Zur Berücksichtigung der
eingesetzten Verdünnung und Umrechnung in die jeweiligen Einheiten mg/dl bzw. mmol/l wird
der Wert noch mit einem Faktor F multipliziert (siehe Formel in der untenstehenden Tabelle)
(weitere Erklärung zum Faktor F siehe auch III. Anhang, 1.6.2. Das Lambert-Beersche
Gesetz).
 37

Die Konzentration des Cholesterins in den Proben wird wie folgt berechnet:

 mg / 100 ml mmol / l
 Cholesterin-Konzentration 200 x Ext. Probe / 5,3 x Ext. Probe /
 Ext. Standard Ext. Standard
 Standard Standard

Wie hoch sind die Cholesterinwerte (mg / 100 ml und mmol / l) in den beiden Proben?

 Probe A:

 Probe B:

Wie beurteilen Sie die gemessenen Werte? Welche sind als pathologisch zu betrachten?

Chemikalien und Lösungen:

 1. Reagenzien zur Cholesterinbestimmung
 2. Cholesterinstandard
 3. 2 verschiedene Seren zur Analyse (A, B)

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2.3. BESTIMMUNG VON GLUCOSE IM SERUM

 Wieso? – Weshalb? – Warum?
Die Einhaltung einer Glucosehomöostase - also das Einstellen eines in engen Grenzen
schwankenden Blutzuckerwertes - ist wichtig für das Überleben obligat Glucose-abhängiger
Gewebe auch in Zeiten der Nahrungskarenz. Durch konzertierte Aktion des
blutzuckersenkenden Hormons Insulin und seiner blutzuckersteigernden Antagonisten
(Glucagon, Adrenalin, Cortisol) wird im gesunden Menschen ein konstanter Blutzuckerwert
von ca. 5 mM Glucose (90 mg/dl) erreicht. Für den Nachweis von Glucose in Serum oder Urin
werden enzymatische Verfahren angewendet, die einen höchst sensitiven und spezifischen
Nachweis erlauben. Sie lernen als Beispiel in diesem Praktikum den Nachweis von Glucose
mit Hilfe der Glucose-Dehydrogenase-Methode kennen. Im online-Praktikum wird Ihnen dieser
Test im Zusammenhang mit dem oralen Glucosetoleranztest wieder begegnen. Der orale
Glucosetoleranztest (Zuckerbelastungstest, kurz auch oGTT) dient dem Nachweis einer
gestörten Glucoseverwertung wie sie z.B. im Diabetes mellitus vorliegt.

Theoretische Vorbereitung

Vorlesung: Energiestoffwechsel Kohlenhydrate
Vorlesung: Funktionelle Biochemie
Löffler, Petrides, Heinrich: Biochemie und Pathobiochemie, 9. Auflage; Kapitel 7, Kapitel 9
Löffler, Petrides, Heinrich: Biochemie und Pathobiochemie, 9. Auflage; Kapitel 14 + 15

Fragen zu den theoretischen Grundlagen:

Glucose ist ein für den Menschen wichtiges Kohlenhydrat. Charakterisieren Sie dieses
wichtige Kohlenhydrat (funktionelle Gruppen, systematische Einordnung, mögliche
Reaktionen). Nennen Sie die Summenformel und schreiben die Strukturformel der -D-
Glucose in der Fischer-Projektion und der Haworth-Schreibweise auf.

 39

Erklären Sie den Begriff „Glucosehomöostase“. In welchem Bereich sollten sich in einem
gesunden Menschen die Blutzuckerwerte (mg/dl und mmol/l) einpendeln? Warum ist
Glucosehomöostase wichtig?

Welche 2 weiteren (neben der hier verwendeten: Glucose-Dehydrogenase-Bestimmung)
Bestimmungsmethoden der Glucose im Serum/Urin kennen Sie?

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Versuchsanleitung

Anleitung vor Beginn komplett durchlesen!!

Versuchsprinzip
In zur Verfügung gestelltem Serum wird der Glucosegehalt mit Hilfe der Glucose-
Dehydrogenase-Methode bestimmt.

Glucosedehydrogenase (Glc-DH.) katalysiert die Oxidation von Glucose:
 Glc-DH
 β-D-Glucose + NAD +
 D-Gluconolacton + NADH + H+

Sie führen damit einen sog. optischen Test nach Warburg durch. Der Nachweis stützt sich auf
die Enzymaktivität NAD+/NADH oder NADP+/NADPH-abhängiger Oxidoreduktasen. Im Verlauf
der Reaktion bilden oder verbrauchen sich die reduzierten Reduktionsäquivalente NADH oder
NADPH. Im vorliegenden Fall ist sicher gestellt, dass die Reaktion vollständig von links nach
rechts, also zugunsten des D-Gluconolacton und NADH abläuft. Da sich die optischen
Eigenschaften von NADH und NADPH durch eine spezifische Lichtabsorption bei einer
Wellenlänge von 340 nm (Absorptionsmaximum) von denen des NAD+ und NADP+
unterscheiden, lassen sich Änderungen der Konzentrationen der oxidierten bzw. reduzierten
Formen dieser Cosubstrate photometrisch leicht ermitteln. Die Abnahme bzw. Zunahme der
Extinktion ist dem Verbrauch bzw. der Bildung von NADH proportional und spiegelt damit den
zeitlichen Verlauf oder die Kinetik der enzymkatalysierten Reaktion wider. Das Messprinzip
wird daher auch als kinetisch-optischer Test bezeichnet. Mit Hilfe des Lambert-Beerschen
Gesetzes und Kenntnis des Extinktionskoeffizienten für NADH lässt sich nach Messung der
Extinktion auch auf eine unbekannte Konzentration (hier: Glucose) rückrechnen. Da pro Mol
oxidierter Glucose 1 Mol reduziertes NADH gebildet werden, entspricht die Konzentration an
NADH derjenigen von Glucose. Wie im Versuch 2.2. BESTIMMUNG VON CHOLESTERIN IM
SERUM wird auch hier ein Referenzwert (Standard) mitgeführt, mit dessen Hilfe über
Dreisatzrechnung die unbekannte Konzentration in der Serumprobe ermittelt werden kann.

 41

Praktische Durchführung

Wichtig:
Nicht alle Proben gleichzeitig ansetzen, da die Reaktion direkt startet!
Sondern: Einen Ansatz zusammen pipettieren (nach dem Schema in der
untenstehenden Tabelle), Inkubationszeit abwarten, messen und dann mit der nächsten
Probe beginnen!!!

 1. Pipettieren Sie nach folgendem Pipettierschema unmittelbar vor der Messung die
 Reaktionsansätze in einer Halbmikroküvette zusammen. Gut mischen! Beginnen
 Sie mit dem Standard!

 Probe Standard
 Reagenzlösung 1000 µl 1000 µl
 Serum 10µl -
 Standardlösung 100mg/dl - 10 µl

 2. Gemessen wird bei 340 nm. Stellen sie eine Stoppuhr auf 4 Minuten ein. Stellen Sie
 die Küvette ins Photometer. Warten Sie 2 Minuten Inkubationszeit ab und lesen
 Sie die Extinktion ab, ebenso nach jeder weiteren Minute bis die 4 Minuten beendet
 sind. Mit dieser Vorgehensweise erhalten Sie mehrere Werte aus dem Bereich der
 Initialgeschwindigkeit dieser enzymatischen Reaktion. Nur in diesem Bereich
 ermöglicht die Anwendung des Lambert-Beerschen Gesetzes, das der vereinfachten
 Auswertung (siehe „Auswertung“) zugrunde liegt, die zuverlässige Bestimmung der
 Glucosekonzentration.

 3. Tragen sie die jeweiligen Extinktionen in die untenstehende Tabelle ein.

 E340 nm E340 nm E340 nm
 nach 2 min nach 3 min nach 4 min

 Standard

 Probe A

 Probe B

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Auswertung

Bilden Sie die Differenz der Extinktionen zwischen 3 und 2 Minuten und die Differenz zwischen
4 und 3 Minuten. Aus diesen 2 Differenzen bilden sie bitte den Mittelwert, dies ist ihr ΔE
(genauer: E/min). Tragen Sie die Werte in die folgende Tabelle ein:

 Differenz 1 Differenz 2 Mittelwert
 Extinktion Extinktion aus Differenz 1
 nach 3 min – nach 4 min – und Differenz 2
 Extinktion Extinktion
 nach 2 min nach 3 min E

 Standard

 Probe A

 Probe B

Die Glucosekonzentration in der Blutprobe ergibt sich aus folgendem Dreisatz, der die
gemessene Extinktionsdifferenz einer Probe mit bekannter Konzentration ins Verhältnis setzt
zur gemessenen Extinktionsdifferenz der unbekannten Konzentration der Blutprobe.

Glucose-Konzentration (Blutprobe): Standardkonzentration x ΔE Probe [mg/dl]
 ΔE Standard

Tragen Sie die Extinktionsdifferenzen und die daraus berechneten Glucosekonzentrationen
[mg/dl] ein.

 Glucosekonzentration
 [mg/dl]

 Probe A

 Probe B

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Bewerten Sie die gemessenen Glucosekonzentrationen in den verschiedenen Seren.

Chemikalien und Lösungen:

1. Reagenz zur Glucosebestimmung
2. Glucose-Standard 100 mg/dl
3. verschiedene Seren zur Analyse (A, B)

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III. Anhang
Im Folgenden finden Sie eine Zusammenstellung von Einheiten, Gesetzmäßigkeiten und
 Rechenwegen, die Sie zur erfolgreichen Durchführung des Praktikums benötigen und die
 Ihnen die Auswertung erleichtern sollen. Dieses Kapitel enthält sowohl Anleitungen für die
 Auswertung der Präsenzpraktika als auch der online – Praktika.

 1. RECHNEN IM BIOCHEMISCHEN PRAKTIKUM

Im Verlauf des Praktikums werden oftmals Konzentrationen von Massen (z.B. in µg Protein
pro ml) oder Molaritäten (z.B. in mmol einer Säure pro Liter) experimentell bestimmt. Die
tatsächlich gesuchte Größe ist dann aber nicht das primäre Ergebnis selbst, sondern bei einem
Protein z.B. die Serumkonzentration, so dass die gefundene Masse noch in Bezug zum
jeweiligen Volumen gesetzt werden muss. Da die Einheiten in der Regel vorgegeben sind, um
sinnvolle Vergleichswerte zu erhalten, müssen die zunächst erhaltenen Einheiten noch
umgerechnet oder Verdünnungsfaktoren berücksichtigt werden. Hierzu ist es notwendig zu
wissen, wie man verschiedene Einheiten ineinander überführen kann. In manchen Versuchen
werden auch grundlegende statistische Verfahren wie die Bildung von Mittelwerten und
Standardabweichungen oder die lineare Regression benötigt. Das Ziel dieses Praktikums ist
es, die Zusammenhänge zwischen verschiedenen physikalischen Größen zu erklären und das
für das Praktikum notwendige "Rechenrüstzeug" mit auf den Weg zu geben.

1.1 Physikalische Größen und Einheiten
In der Physik gelten zur Beschreibung unterschiedlicher Basisgrößen wie Länge, Masse etc.
Internationale Einheiten (Systeme International d'Unites, abgek.: SI) mit standardisierten
Symbolen und Basiseinheiten. Die wichtigsten SI-Einheiten sind in Tabelle 1
zusammengefasst.

 Basisgrößen Symbole Basiseinheiten (Zeichen)
 Länge l Meter (m)
 Masse M Kilogramm (kg)
 Zeit t Sekunde (s)
 Elektr. Stromstärke I Ampere (A)
 Stoffmenge n Mol (mol)
Tabelle 1: SI-Einheiten (aus Hellenthal, Physik für Mediziner, 5. Auflage 1997)

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Um Bruchteile oder Vielfache dieser Basisgrößen anzugeben, werden Vorsilben verwendet
und der jeweiligen Basiseinheit eine Kurzbezeichnung vorangestellt.

 Vorsilbe Kurzbezeichnung Zehnerpotenz Beispiele
 Piko p 10-12 Pikofarad
 -9
 Nano n 10 Nanometer
 Mikro µ 10-6 Mikromol
 Milli m 10-3 Milligramm
 Zenti c 10-2 Zentimeter
 Dezi d 10-1 Deziliter
 Hekto h 102 Hektopascal
 Kilo k 103 Kilometer
 Mega M 106 Megahertz
 Giga G 109 Gigahertz
Tabelle 2: Bruchteile und Vielfache von Einheiten

Von den Grundeinheiten werden abgeleitete Größen und Einheiten gebildet. So wird das
Volumen in m3 angegeben, also von der SI-Einheit m abgeleitet, die Geschwindigkeit wird in
m*s-1 angegeben, also von den SI-Einheiten m und s abgeleitet. Umgangssprachlich werden
aber oft auch andere Einheiten wie km*h-1 statt m*s-1 verwendet, da diese Größen schon lange
in Verwendung sind und somit besser mit anderen Angaben verglichen werden können. Dies
trifft insbesondere auch auf die medizinische Labordiagnostik zu, wo Angaben z.B. in g*dl-1
statt in kg*m-3 gemacht werden. Durch die Verwendung solcher nicht-SI-Einheiten wird oft
auch der Umgang mit besonders großen oder besonders kleinen Zahlen vermieden. Um die
unterschiedlichen Einheiten ineinander umzurechnen, reicht in der Regel die Kenntnis der in
Tabelle 1 und 2 aufgeführten Größen und Vorsilben aus.

 Beispiele:

 (1) 50 km*h-1 = 50 000 m*h-1 = 50 000 m * (3600 s)-1 = 13.89 m*s-1

 (2) 50 m*s-1 = 0.05 km*s-1 = 0.05 km * (0.000278 h)-1 = 180 km*h-1

 (3) 180 g*dl-1 = 0.180 kg*dl-1 = 0.180 kg*(0.1 l)-1 = 0.180 kg*(0.1 dm3)-1 =
 0.180 kg * (0.0001 m3)-1 = 0.180 kg * 0.0001 m-3 = 1 800 kg*m-3 (oder 1 800 g/l)

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1.2. Stoffmengen und Konzentrationen

Weiter ist es oft notwendig, aus Konzentrationsangaben Stoffmengen zu berechnen oder
umgekehrt aus Stoffmengen und Volumen eine Konzentration zu ermitteln. Die
Konzentrationen werden in der Regel in "molar" angegeben und mit "M" abgekürzt, wobei eine
1 molare Lösung einer Substanz 1 mol*l-1 enthält.

 Beispiele:

 (1) Wie viel mol (mmol, µmol) NaOH sind in 100 ml einer 0.05 molaren Lösung enthalten?

 0.05 molar = 0.05 mol*l-1
 100 ml = 0.1 l
 0.05 mol*l-1 * 0.1 l = (0.05*0.1) mol*l-1 * l = 0.005 mol (= 5 mmol = 5 000 µmol)

 In 100 ml einer 0.05 molaren NaOH-Lösung sind 0.005 mol (5 mmol, 5 000 µmol)
 NaOH enthalten.

 (2) Wieviel g NaCl muss man in 300 ml Wasser lösen, um eine 0.5 M Lösung zu erhalten,
 wenn 1 mol NaCl eine Masse von 58.44 g haben (58.44 g*mol-1)?

 eine 0.5 M Lösung NaCl enthält 0.5 mol*l-1
 300 ml = 0.3 l
 0.5 mol*l-1 * 0.3 l = (0.5*0.3) mol*l-1 * l = 0.15 mol
 → 300 ml einer 0.5 M NaCl-Lösung enthalten 0.15 mol NaCl
 58.44 g*mol-1 * 0.15 mol = (58.44*0.15) g*mol-1*mol = 8.766 g

 Man muss 8.766 g NaCl einwiegen und auf 300 ml mit Wasser auffüllen, um eine 0.5 M
 Lösung zu erhalten.

In der zweiten Aufgabe ist die Angabe aufgetaucht, welche Masse 1 mol einer Substanz hat.
Diese Angabe wird als molare Masse bezeichnet und mit Mr abgekürzt. Die Einheit für die
molare Masse ist Dalton (Da), dabei gilt 1 Dalton = 1 g*mol-1. Die molare Masse eines
Moleküls setzt sich aus den molaren Massen der im Molekül vertretenen Atome zusammen.

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Beispiel:

 (1) Wie ist die molare Masse von MgCl2?

 Atomgewicht Mg: 24.305 g*mol-1, Atomgewicht Cl: 35.453 g*mol-1
 molare Masse von MgCl2 = 24.305 + (2*35.453) = 95.211 g*mol-1

Kennt man die molare Masse einer Substanz und ihre molare Konzentration, so kann man von
der molaren Konzentration (= Stoffmengenkonzentration) in eine Massenkonzentration
umrechnen.

 Beispiel:

 (1) Wieviel mg*dl-1 Creatinin enthält eine 80 µM Lösung (Mr Creatinin = 113 Da)?

 eine 80 µM Lösung Creatinin enthält 80 µmol*l-1 = 0.08 mmol*l-1 = 0.00008 mol*l-1
 0.00008 mol*l-1 * 113 Da (g*mol-1) = (0.00008 * 113) mol*l-1*g*mol-1
 = 0.00904 g*l-1
 0.00904 g*l-1 = 9.04 mg*l-1
 → in einem Liter der Lösung sind 9.04 mg Creatinin enthalten
 1dl = 0.1 l
 → in einem dl der Lösung sind 0.904 mg Creatinin enthalten.
 Die Massenkonzentration der Lösung beträgt 0.904 mg*dl-1.
Neben Stoffmengenkonzentrationen und Massenkonzentrationen wird die Konzentration -
insbesondere, aber nicht ausschließlich von Flüssigkeiten in Flüssigkeiten - oft auch in Prozent
angegeben. Dabei muss zwischen Volumenprozent und Massenprozenten unterschieden
werden. So besagt die Angabe "Dieser Wein beinhaltet 10 Vol-% Alkohol", dass in 100 ml des
Weines 10 ml reiner Alkohol enthalten sind, was aber nicht gleichbedeutend ist mit 10 g reinen
Alkohols. Die Angabe Vol-% und Gew-% stimmt nur dann überein, wenn die gelöste Substanz
und das Lösungsmittel die gleiche Dichte haben. Die Dichte einer Substanz gibt das Verhältnis
zwischen Masse und Volumen an.

Dichte = Masse * Volumen-1 [kg*m-3]

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