Klinische Chemie und Laboratoriumsdiagnostik - Vorlesung: Immunologische Labormethoden
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Klinische Chemie und Laboratoriumsdiagnostik
Vorlesung: Immunologische Labormethoden
Dr. rer. nat. Manfred Fobker
Zentrale Einrichtung Labor
– UKM Labor –
Universitätsklinikum Münster
Albert-Schweitzer-Campus 1
D-48149 Münster
Telefon: 0251 83-48701
Fax: 0251 83-47225
fobker@uni-muenster.de
www.klichi.uni-muenster.de
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www.klichi.uni-muenster.de/folien
Sommersemester 2020
Immunglobulin-
Epitop
Antigen Antigenbindung
Schwere Kette Antigen
Paratop NH2 NH Leichte Kette
2
Antigen NH2
NH2
Bindung
VH VH
sregion
VL VL
Fab CH1 CH1
S-S CL
CL S-S
S-S S-S
CH2 CH2
Flexible
Fc Übergangsregion
CH3 CH3
COOH COOH
Spezifität von Antikörpern
Antigen: Stoffe (z.B. Proteine), die
„Antikörper-generierend“ sind
Analytische Spezifität: Fähigkeit
nur den gesuchten Analyten
nachzuweisen
Kreuzreaktivität: Antikörper
erkennt ähnliche Antigene
Was möchte ich messen?
Beispiel: PSA-Fraktionen
PSA PSA PSA
Freies PSA PSA-ACT PSA- 2M
10-15% 85-90% nicht detektierbar
ACT= 1-antichymotrypsin 2M= 2-Makroglobulin
Verbotene Dopingsubstanzen
Narkotika Diuretika
Stimulanzien Anabolika Peptidhormone
Antikörper-Reaktionen • Bildung von Antigen-Antikörper- Netzwerken (Präzipitate) • bivalent •Vernetzungsgrad von ihren relativen Mengen abhängig
Quantitative immunchemische Verfahren: Nephelo- und Turbidimetrie
PSA
Antigen Antikörper Markierung
Spezifität: • radioaktive Isotope
• polyklonal
• fluorogene Moleküle
• monoklonal
• Enzym
Herkunft:
• luminogene
• Mensch/Tier Moleküle
Immunoassay-Testformen (heterogen)
Ag
Signal
Ag Ag
Ag Ag
Ag
Konzentration
A. Kompetitive Testform
Immunoassay-Testformen (heterogen)
Ag Ag
Ag Ag Ag
Ag Ag
Waschen
Messsignal
B. Sandwich-Typ (immunometrischer Test)
KonzentrationEnzyme Linked Fluorescent Assay
(ELFA)
Antigen markierter AK
MUP
Ag AP
MU +P
R O O
„ Sandwich-Prinzip “
CH3
4-Methylumbelliferyl-PhosphatTeststreifen
GLORIA-Technik (Gold Labelled Optical-read Rapid Immuno Assay)
PSA
PSA
PSA
Filter
Mischzone Testfeld Kontrolle Löschpapier
POSITIV
Filter
Mischzone Testfeld Kontrolle Löschpapier
NEGATIVHomogene Immunoassays
(„Eintopfverfahren“)
hohe Ag-
Konzentration Substrat
Ag
+ Ag
niedrige Ag-
Ag + Ag
E
Produkt
E Konzentration
a) EMIT (Enzyme-Multiplied Immunoassay Technique)Test-Spezifikationen
Probenmaterial: Serum
Haltbarkeit: wenige Stunden- mehrere Wochen
(Peptide !)
Probenvolumen: 10-50 µl
Kalibratoren: WHO-Standard
(methodenabhängige Werte)
Inkubationszeit: 10 min-60 minImmunoassays
-Anwendungen-
• Hormonbestimmungen
(Schilddrüsen- und Fertilitätshormone, Insulin)
• Tumormarker (z.B. CEA, PSA, CA 15-3)
• Medikamentenspiegel (z.B. Digoxin, Antibiotika)
• Herzmarker (z.B. Troponin I)
• Virusdiagnostik (z.B. HBsAg)Wie sensitiv ist mein Verfahren?
PSA_Kalibration
30
25
Analytische Sensitivität
Signalstärke
20
(Nachweisgrenze)
15
10
5
0
0 10 20 30 40 50 60
Konzentration ng/mlmg (10g-3)
g (10g-6)
ng (10g-9)
pg (10g-12)
fg (10g-15)
Immunologische Messmethoden sind die sensitivsten Verfahren zum
Nachweis von Substanzen in menschlichen Körperflüssigkeiten.Die Nachweisgrenze Aasee
Fläche: 40 Hektar
Tiefe: 2 m
= 8 x 108 Liter
Immunologischer
Test: z.B. PSA
Nachweisgrenze
0,01 ng/ml = 10-8 g/l
Zuckerwürfel 2 g:Nachweisgrenzen Analytisch: „0-Kalibrator“ 20 Messungen + 2-3 SD Biologisch: „Analyt-freies“ Serum 20 Messungen + 2-3 SD Funktionell: „Analyt-freies“ Serum Konzentration, bei der VK > 20% oder aufgehobene Verdünnungslinearität
Untere Nachweisgrenze - Ergebnisse
0.80
0.69
0.63
0.70
0.58
0.60
0.50
0.50
0.50
PSA (ng/ml
0.50
0.40
0.38
0.40
0.30
0.29
0.29
0.27
0.30
0.21
0.20
0.10
0.09
0.07
0.05
0.05
0.04
0.10
0.03
0.01
0.00
1 2 3 4 5 6 7
Assay
Analytische untere Nachweisgrenze
Biologische untere Nachweisgrenze (Männer nach Zystoprostatektomie)
Biologische untere Nachweisgrenze (Frauen ohne Grunderkrankung)
(Junker R et al.: Measurement of prostate-specific antigen: No
advantage to ultrasensitive assays? J Natl Cancer Inst 1996;88:1594)Kalibration (Standardkurve)
PSA_Kalibration
30
25
Signalstärke
20
15
10
5
0
0 10 20 30 40 50 60
Konzentration ng/ml„High-dose-hook-Effekt“
Ag Ag
Ag Ag
Ag
Ag
Ag Ag
Ag
Ag Waschen
Ag Ag
Ag
Ag Ag Ag
Messsignal
• Sandwich-Typ (immunometrischer Test)
PSA-KonzentrationMessgrenze bzw. Linearitätsgrenze
Schwanger?
1. Positiv
Kontrolle
2. Negativ
3. Schwach schwanger
Testfeld
Auch schwache Signale sind positiv!Entscheidungsgrenzen im Serum/Urin
Serum Urin
20
20 postmenopausalOK!
Vorsicht !!!Ich wünschte, meine Eltern hätten
auf andere Weise erfahren, dass ich
trinke und fahre.Therapeutisches Drug Monitoring(TDM) / Toxikologie Drogenschnelltest im Urin:
Beseitigen Sie schnell alle Unsicherheiten einer möglichen HIV Infektion Der MiraTes SelbstTest zeigt ob sich Antikörper gegen HIV in ihrem Blut befinden. Wenn keine Testlinie im Testfenster erscheint, können Sie erleichtert Luft holen. Mit Hilfe von dem dazu gelieferten Fingerstecher, stechen Sie nahezu schmerzlos in ihren Finger. Daraufhin bringen Sie einen Tropfen Blut auf den Test an. Das Ergebnis wird nach 15 Minuten sichtbar. Leider gibt es (noch) keine deutschsprachigen Gebrauchsanleitung. Wir hoffen das die einbegriffen engelssprachigen Gebrauchsanleitung hinreichend ist.
Störungen bei Immunoassays
Serumproteine (z.B. Rheuma-
faktoren, Bindungsproteine)
Anti-Tier-Antikörper kreuzreagierende Substanzen
heterophile Störfaktoren
Antikörper Medikamente
Niereninsuffizienz,
nephrotisches Syndrom, Hämolyse, Lipämie,
Schwangerschaft, Hyperbilirubinämie
TransfusionenHuman-Anti-Maus-Antikörper (HAMA)
HAMA
Epitop
PSA
falsch hohes Ergebnis
PSA
falsch niedriges
ErgebnisT-PSA-Assays Boehringer Enzymun PSA
Byk-Sangtec IRMA-mat
Abbott PSA AxSym Byk-Sangtec Liaison
Abbott PSA IMx Byk-Sangtec LIA-mat
Baxter/Dade Stratus-PSA CanAg Equi-molar EIA
Bayer Technicon Immuno 1 Chembio PSA Membrane T.
Behring Berilux PSA Chimica PSA ELISA
Behring N Latex PSA Chiron ACS2 PSA
Behring Opus PSA CIS ELSA2 PSA
Biochem Immunosystems CIS Kryptor PSA
MAIAclone CIS RIACT PSA
Biochem Immunosystems Diag. Systems Active PSA
SR1 PSA Diag. Systems Active Ultrasens PSA
Biomar PSA ELISA Dianova PSA DIA 0301 E
Biomar psaQuick stick Dianova PSA ELISA TM 10
BioMedTech BioSign PSA DiaSorin ETI-PSAK
bioMerieux Vidas PSA DiaSorin PSACTK
Boehringer Elecsys PSA DPC Biermann Coat-A-Count
DPC Biermann Immulite 3. Gen.DPC Biermann Immulite PSA
DPC Biermann IRMA-count Nichols PSA CELIA
DPC Biermann Milenia PSA Nobis Nobi-Well TMB
DRG Instruments PSA EIA Ortho-Clin.-Diag. Vitros PSA
Eiken PSA Princeton BioSign PSA
Eurogen./Tosoh AIA-Pack PA Roche Cobas Core PSA
FF Diagnost. PSA Oncoquant Seratec PSA ELISA 270
FF Diagnost. PSA Oncoscreen Seratec PSA Semiquant
Hybritech Tandem-E Serono PSA MAIAclone
Hybritech Tandem-R Serono SR1 PSA
Immunocorp PSA IRMA Sorin/Yang Pros-Check
Immunotech Liana PSA Syntron QuikPac 2
Int. Immunodiagn. PSA IEMA Syntron QuikStrip 1
Jant Pharmacal Accustrip PSA United Biotech Ubi Magwel
Medpro PSA EIA Veda Lab PSA EIA
Medpro PSA Membrane T. Veda Lab PSA Membrane T.
Melotec SA Melotest PSA Wallac Delfia PSA EQM
Merck PSA-US Magia Wallac Dual Label
Mitsui Pharm. High-Sens-MP
Mitsui Pharm. PSA-MP Quartus
= 70 AssaysAnalytische Beurteilung und Wertigkeit
einer Bestimmungsmethode
•Präzision
•Richtigkeit
•Stabilität (Drift)
•Verschleppung
•Robustheit
•Analytische Sensitivität und Spezifität
•Diagnostische Sensitivität und SpezifitätDiagnostische Sensitivität: Wahrscheinlichkeit mit der Kranke richtig erkannt werden (alle richtig positiven Ergebnisse/ alle Kranken) Diagnostische Spezifität: Wahrscheinlichkeit mit der Nicht-Kranke richtig erkannt werden (alle richtig negativen Ergebnisse/ alle Gesunden) Positiver prädiktiver Wert: Wahrscheinlichkeit bei positivem Testergebnis, das der Patient krank ist (alle richtig positiven Ergebnisse/ alle positiven Ergebnisse) abhängig von der Prävalenz
Screeninguntersuchung
Krankheit “Y” ist asymptomatisch (Inzidenz: 1 / 1000)
Krankheit “Y” ist im Serum nachweisbar
Sensitivität: “Y”-Assay = 99 % (1 von 100 Kranken wird
übersehen)
Spezifität “Y”-Assay = 98 % ( 2 von 100 Gesunden
fälschlich im VerdachtScreeninguntersuchung
•Assay “Y” ergibt ein positives
Testergebnis in Ihrer Probe
•Wie hoch schätzen Sie Ihr Risiko
ein, an Krankheit “Y” zu leiden ?Screeninguntersuchung
Bei einem positiven Testergebnis im Assay “Y” würde ich
schätzen, daß ich mit dieser Wahrscheinlichkeit tatsächlich
an Krankheit “Y” leide:
~ 99 %
~ 98 %
~ 95 %
~ 50 %
~ 5%
~ 1%Screeninguntersuchung
Bei einem positiven Testergebnis im Assay “Y” würde ich
schätzen, daß ich mit dieser Wahrscheinlichkeit tatsächlich
an Krankheit “Y” leide:
~ 99 %
~ 98 %
~ 95 %
~ 50 %
X ~ 5%
~ 1%Screeninguntersuchung
100.100 getestet
100 Kranke, 100 000 Gesunde
99 der 100 Kranken erkannt, 1 übersehen
98.000 der Gesunden als gesund erkannt
2.000 der Gesunden falsch-positives Testergebnis
99 + 2000 haben positives Testergebnis
Wahrscheinlichkeit, daß Sie bei positivem Testergebnis an
Krankheit “Y” leiden:
richtig positiv / alle positiven Ergebnisse
99 / 2099 = 0,047 x 100 = 4,7 %Screeninguntersuchung 100.100 getestet 100 Kranke, 100 000 Gesunde 99 der 100 Kranken erkannt, 1 übersehen 98.000 der Gesunden als gesund erkannt 2.000 der Gesunden falsch-positives Testergebnis 99 + 2000 haben positives Testergebnis Wahrscheinlichkeit, daß Sie bei negativem Testergebnis nicht an Krankheit “Y” leiden: richtig negativ / alle negativen Ergebnisse 98000 / 98001 = 0,99 x 100 = 99,9999 %
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