Schlafkrankheit - neue Medikamente für eine alte Seuche - Naturwissenschaftliche Gesellschaft Winterthur 27. Februar ...
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Schlafkrankheit – neue Medikamente für eine alte Seuche
Naturwissenschaftliche Gesellschaft Winterthur
27. Februar 2015
Prof (em) THOMAS SEEBECK
thomas.seebeck@izb.unibe.ch
“. . . it is really possible in every animal species and with every kind of
trypanosome infection to achieve a complete cure with one injection,
a result which corresponds to what I call therapia sterilisans magna.”
Paul Ehrlich über die Chemotherapie der
Schlafkrankheit in seiner Rede zur
Entgegennahme des Nobelpreises 1908
NGW Winterthur 27.2.2015
Schlafkrankheit – die frühe Forschung
1332-1395
14. Jahrhundert: Der arabische Arzt / Historiker / Philosoph und
Jurist IBN KHALDUN beschreibt die erste Fallstudie von menschlicher
Schlafkrankheit am Beispiel eines lokalen Königs von Mali
NGW Winterthur 27.2.2015
1841 entdeckt Prof. Gabriel Valentin vom Physiologischen Institut
der Universität Bern einen merkwürdig beweglichen Mikroorganismus
im Blut eines Fischs
Dieser Organismus war der erste
Vertreter einer riesigen Familie
von Protozoen, von denen viele als
Parasiten leben. Mehrere von ihnen
sind wichtige Krankheitserreger des
1841 Menschen, seiner Haustiere, und von
GABRIEL VALENTIN Nutzpflanzen
“Ueber ein Entozoon
Im Blute von Salmo faris”
NGW Winterthur 27.2.2015
Die erste Publikation
von Gabriel Valentin
über Trypanosomen
NGW Winterthur 27.2.2015
Die CHAGAS KRANKHEIT
Eine Infektionskrankheit die in 18 Ländern Mittel- und Südamerikas endemisch ist
Sie wird verursacht durch den einzelligen Parasiten Trypanosoma cruzi der durch
Bettwanzen übertragen wird
Man rechnet momentan mit 16 – 18 Millionen Fällen.
Die Krankheit verläuft in zwei Phasen. In einer ersten, akuten Phase stirbt ein Teil der
Patienten, v.a. Kinder. In den Ueberlebenden folgt eine lange (Jahrzehnte !) Phase ohne
Symptome. Bei ca. 2/3 der Patienten heilt die Infektion in dieser Phase ab. Beim
Rest treten dann als Spätfolgen tödliche Probleme mit der Muskulatur des Herzens und
des Verdauungstrakts auf
agencia.fapesp.br
Rhodnius prolixus
cienciahoje.uol.com.br NGW Winterthur 27.2.2015
CHAGAS KRANKHEIT: die Symptome
Romaña's Sign:
die frühe Phase
Megacolon: späte Phase
Kardiomegalie: späte Phase
sbcp.org.br
health.gov.mt
NGW Winterthur 27.2.2015
Die LEISHMANIOSEN: ein Komplex von klinisch sehr verschieden
verlaufenden Infektionen
Verursacher sind verschiedene Spezies von Leishmania ssp. welche von
zwei Sandfliegenarten übertragen werden (Phlebotomus in der Alten Welt,
und Lutzomyia in der Neuen Welt)
wikimedia.org
parasitophilia.blogspot.com
bvgh.org
Lutzomya longipalpis
Infizierte Macrophagen
Leishmania mexicana
primeraedicionweb.
com.ar
NGW Winterthur 27.2.2015
2 mm
Viszerale
Die verschiedenen klinischen Leishmaniose
Verläufe der Leishmaniosen (Kala Azar)
(v.a. Indien)
Kutane
Leishmaniose
(Aleppobeule)
(v.a. Mittlerer
Osten)
pubs.acs.org
Leishmaniose beim Hund leishdomus.org
Mucokutane
Leishmaniose
(Espundia;
Chiclero Ulzer)
(v.a. Südamerika)
leishdomus.org
leishdomus.org latinpharma.net
NGW Winterthur 27.2.2015
Ein dritter Verwandter des Fischparasiten den Herr Valentin in Bern
entdeckte ist, resp. sind die beiden Erreger der menschlichen Schlafkrankheit,
Trypanosoma brucei gambiense und Trypanosoma brucei rhodesiense
T.b. gambiense T.b. rhodesiense
(der langsame Killer) (der schnelle Killer)
NGW Winterthur 27.2.2015Die Schlafkrankheit ist ein alter Fluch grosser Gebiete Afrikas (38 Länder sind
betroffen). Die menschliche Form der Krankheit verläuft unabänderlich tödlich,
die tiermedizinische Form verursacht katastrophale oekonomische Schäden und
ist vielen Gegenden ein grosses Hindernis für die landwirtschaftliche Entwicklung.
Zu Kolonialzeiten konnte die menschliche Schlafkrankheit durch rigorose Kontrollen
und Zwangsbehandlung einigermassen in Grenzen gehalten werden
NGW Winterthur 27.2.2015Warum reiten diese Herren nicht viel
bequemer zu Pferde ?
NGW Winterthur 27.2.2015Der Lebens-Zyklus von Trypanosoma brucei
In der TSETSE
Fliege Blut-
Mahl
Midgut SHORT
STUMPY
PROCYCLIC
Salivary blood- Blut-Ausstrich
gland stream
EPIMASTIGOTES
LONG
META- SLENDER
CYCLICS
Blut- im Säuger
Mahl
NGW Winterthur 27.2.2015Die Tsetse-Fliege (Glossina ssp): etwa 20 verschiedene Arten
rayandeson.blogspot.com
Glossina ist
lebend-
gebärend !
pic2fly.com
Mit Trypanosomen
infizierte Speicheldrüse NGW Winterthur 27.2.2015Prävention: Bekämpfen und Vermeiden der Tsetse Fliege
Schulmaterial zur Warnung vor der Tsetse-Fliege
Tsetsefliegen-Falle NGW Winterthur 27.2.2015Nach dem Biss einer infizierten
Von dort wandern die
Tsetsefliege bildet sich zuerst
Parasiten in die Blutbahn
eine schmerzhafte Schwellung
und vermehren sich dort
an der Bissstelle
NGW Winterthur 27.2.2015Solange die Trypanosomen noch im Blutkreislauf sind, kann eine Infektion
entweder durch mikroskopischen Nachweis der Parasiten im Blut, oder durch
einen Agglutinations-Test (CATT: Card Agglutination Test for Trypanosomiasis)
nachgewiesen werden
Hämatokrit-Zentrifuge zur Anrei- CATT-Test
cherung der Trypanosomen
Plasma
Leuk + Tryps
EC
NGW Winterthur 27.2.2015In der Spätphase durchdringen die Trypanosomen
dann die Blut-Hirn-Schranke und befallen das
Zentralnervensystem (ZNS)
Für die Diagnose einer Infektion
im Spätstadium muss Liquor durch
Punktion des Rückenmarks gesammelt
werden
Lumbalpunktion im Dorf
Auffangen des Liquors
Im ZNS sind die Trypanosomen
auch für die meisten Medikamente
unzugänglich !
www.finddiagnostic.org NGW Winterthur 27.2.2015Der Stand der Dinge in der medikamentösen
Behandlung der Schlafkrankheit:
Katastrophal!Eine Schande für die moderne Pharmakologie:
Die heute vorhandene Chemotherapie ist fast vollkommen
abhängig von nur vier alten und hoch-toxischen Substanzen:
Frühes Infektionsstadium (ZNS nicht infiziert):
- Suramin (T. rhodesiense) (1919 eingeführt !)
- Pentamidin (T. gambiense) (1941 eingeführt)
Spätes Stadium (ZNS Infektion):
- DFMO (Eflornithin) ( nur T. gambiense) (1990 eingeführt)
- Melarsoprol (T. gambiense und T. rhodesiense)
(1949 eingeführt)
NGW Winterthur 27.2.2015Und zusätzlich:
Die Produktion zweier dieser Substanzen, Melarsoprol and Eflornithin,
wurde zeitweilig eingestellt. Damit blieb lediglich eine Medikamenten-Reserve
für etwa zwei Jahre übrig
Die Produktion von Melarsoprol, einer Arsen-haltigen Verbindung, war nicht länger
mit Umweltauflagen für die Produktion vereinbar. Eflornithin wurde nicht mehr
produziert weil es sehr teuer in der Herstellung ist, und seine einzige Anwendung
die afrikanische Schlafkrankheit war.
Dann aber:
Massiver politischer Druck von allen Seiten überzeugte den
Hersteller von Melarsoprol, die Substanz weiterhin zu produzieren
Eflornithin wurde “wiederentdeckt” als ein essentieller Zusatzstoff
für eine Haarentfernungscrème. Plötzlich war seine Herstellung
wieder ökonomisch interessant.
NGW Winterthur 27.2.2015Eflornithin
Für ihn zu teuer
Als Kosmetikum ein
ökonomischer Erfolg
NGW Winterthur 27.2.2015Gegenwärtig sind eine neue Kombination zweier alter Wirkstoffe,
sowie zwei neue Wirkstoffe in klinischer Erprobung:
1. Die Kombinationstherapie (NECT) mit Eflornithin und Nifurtimox (einem
Wirkstoff der bereits gegen die Chagas Krankheit eingesetzt wird) verkürzt die
Therapiedauer und vereinfacht die Logistik gegenüber der Therapie
mit Eflornithin allein
Eflornithin Nifurtimox
2. Die Nitroimidazol-Verbindung Fexinidazol. Sie wurde von Hoechst AG als
Wurmmittel entwickelt, aber in den 80er Jahren aufgegeben. In Zusammen-
Arbeit mit der Drugs for Neglected Diseases Iniative (DNDi) wurde die
Substanz nun als Trypanosomen-Medikament “wiederbelebt” und ist im
klinischen Test
Fexinidazol
3. Einige Oxaborole sind als neue, hochpotente und sichere Trypanozide
im klinischen Test
NGW Winterthur 27.2.2015Warum weiterhin nach neuen Medikamente suchen wenn bereits eines
oder mehrere, oder zumindest gute Kandidaten, vorhanden sind ???
Die Ausfallquote während der Entwicklung, inklusive klinische Tests, ist
nach wie vor hoch
Keines der etablierten Medikamente ist ohne Probleme
Die Entstehung von Medikamenten-Resistenz ist ein permanentes, sehr
schwerwiegendes Problem aller Infektionskrankheiten. Die Verfügbarkeit von
mehreren, chemisch und mechanistisch verschiedenen Wirkstoffen kann
diese Entwicklung bremsen
NGW Winterthur 27.2.2015Beispiel für das Risiko bei der Medikamentenentwicklung:
Pafuramidin, ein oraler Wirkstoff gegen die Schlafkrankheit
Pafuramidin Maleat DB289
entwickelt am Schweizerischen
Tropeninstitut, www.swisstph.ch
2000 aus einem Screening Programm ausgewählt für weitere Entwicklung;
präklinische Tests und Proof-of-Concept Studien
2001 Phase II Versuche in der Demokratischen Republik Kongo (DRC) und in Angola;
sehr gute Resultate. Behandlungsdauer wird von 5 auf 10 Tage verlängert.
2005-2009 klinische Versuche (Phase III) in DRC, Angola und Süd-Sudan.
273 Patienten werden behandelt (Behandlungsdauer 10 Tage) und dann
über 2 Jahre weiterverfolgt
Oktober 2007 zusätzliche Phase I Studien (gesunde Freiwillige) in Südafrika:
Behandlungsdauer verlängert auf 14 Tage
Februar 2008 Projekt gestoppt da 6 der Probanden Nierenschäden entwickelten und
hospitalisiert werden mussten
NGW Winterthur 27.2.2015Erste Schritte zur Entwicklung eines neuen Wirkstoffes am
Institut für Zellbiologie der Universität Bern
Ausgehend von einer definierten zellbiologischen Hypothese konnte ein
ein bestimmtes Enzym (eine cAMP-spezifische Phosphodiesterase) als
aussichtsreiches Ziel (“Target Identification”) identifiziert werden (in der Theorie)
Durch eine genetische Technik (RNA Interferenz) konnte nachgewiesen werden
dass dieses Enzym in der Tat essentiell ist, d.h dass der Parasit eine Hemmung
dieses Enzyms nicht überlebt (“Target Validation”)
In weiteren Schritten wurde dann nach chemischen Verbindungen gesucht
welche dieses Enzym möglichst effektiv und möglichst spezifisch hemmen
(“High Throughput Screening”)
Aus diesen Arbeiten entwickelte sich rasch eine “Public-Private Partnership”,
also eine enge Zusammenarbeit zwischen akademischen Forschungsgruppen,
verschiedenen Pharma-Unternehmen und internationalen Organisationen
NGW Winterthur 27.2.2015Signalübermittlung durch cAMP – ein “Executive Summary”
PDE
5’-AMP
(Phosphodiesterase)
ATP cAMP
CFTR Kanal
Guanosin-Nukleotid
Austausch-Proteine
Hyperpolarizations-
(GEFs)
aktivierte
Ionenkanäle
CNG Kanäle
(z.B. des Geruchssinns)
Protein Kinase A
NGW Winterthur 27.2.2015
etc, etcIn der menschlichen Pharmakologie sind Inhibitoren der Phosphodiesterasen
sehr erfolgreich zu klinisch eingesetzten Medikamenten entwickelt worden.
Das wahrscheinlich bekannteste davon ist:
Sildenafil (Viagra®)
ein potenter Inhibitor
der menschlichen
Phosphodiesterase 5
NGW Winterthur 27.2.2015RNA Interferenz
erlaubt es, in lebenden Zellen (welche
gleichzeitig Tausende von verschiedenen
mRNAs exprimieren) eine ganz bestimmte
mRNA gezielt auszuschalten
Sie benützt einen evolutionär alten
Mechanismus mit welchem die Zellen
doppelsträngige RNA als Alarmzeichen
erkennen, diese abbauen und gleichzeitig
auch alle mRNAs welche die gleichen
Sequenzen tragen.
Dieser Mechanismus schützt Zellen
vor dem Ueberhandnehmen
von mobilen genetischen Elementen gene-quantification.de
NGW Winterthur 27.2.2015Die Identifikation der Phosphodiesterase von T. brucei als Drug Target
1. Die vorhandenen Daten lassen darauf schliessen dass die
Phosphodiesterase ein zentral wichtiges Enzym der intrazellulären
Signalübermittlung von Trypanosomen ist
2. Die daraus abgeleitete Hypothese besagt dass eine Eliminierung
dieser Phosphodiesterase für den Parasiten lethal sein sollte
3. Die experimentelle Frage lautet nun:
Wenn wir die mRNA für die Phosphodiesterase via RNA-Interferenz
eliminieren, und die Zelle somit keine Phosphodiesterase mehr
produzieren kann – ist das für den Parasiten in der Tat tödlich ?
NGW Winterthur 27.2.2015Der Einbau eines induzierbaren RNA-Interferenzkonstrukts ins Genom
eines experimentellen T. brucei Stammes
T7 Promotor T7 Terminator
RNAi Konstruct
Wirts-Zelle exprimiert:
Tet-Operator
T7 Polymerase
Tet Repressor
T
+ Tet AAAAAAA
Freisetzung des Repressors durch
Tet-Repressor
Tetrazyklin induziert die Transkription
blockiert die
der Hairpin-RNA. Diese löst dann via
Transkription
den Interferenzmechanismus die
Zerstörung der Ziel-mRNA aus
NGW Winterthur 27.2.2015Induktion der RNA Interferenz gegen die mRNA für die Phosphodiesterase
verursacht ein rasches Absterben der Parasiten-Zellen in der Zellkultur
Wildtyp Stamm
(± Tetrazyklin)
RNAi ohne Tetrazyclin
(Kontrolle)
RNAi plus Tetrazyclin
(RNA Interferenz
wird induziert)
Oberholzer et al. FASEB J. 21, 2007, 720
NGW Winterthur 27.2.2015Induktion der RNA Interferenz gegen die mRNA für die Phosphodiesterase
verursacht eine rasche Elimination der Parasiten in der Maus
1 mg/ml Tetrazyklin
im Trinkwasser
109
X 5 x108 limit X kein Tetrazyklin
Trypanosomen / ml Blut
(Kontrolle)
108
107
106
plus Tetrazyklin
0 50 100 150 200
Stunden nach der Infektion
wird die Phosphodiesterase inaktiviert (durch RNAi) so sterben die
Trypanosomen sehr rasch ab und die Infektion ist geheilt
NGW Winterthur 27.2.2015Wie findet man nun einen guten Hemmstoff Teil 1
für die Phosphodiesterase
1. Man produziere genügend Enzym (z.B. durch biochemische Reinigung
(mühsam !) oder durch Rekombinanten-Technologie (auch mühsam !))
2. Man synthetisiere genügend viele verschiedene Wirkstoff-Kandidaten
(ca. 500’000 - 1 Million)
3. Man teste jede dieser Verbindungen gegen das
Enzym (siehe 1) mit Hilfe entweder von
sehr vielen sehr willigen Masterstudierenden . . .
. . . oder einem
geeigneten Roboter r
NGW Winterthur 27.2.2015Wie findet man nun einen guten Hemmstoff Teil 2
für die Phosphodiesterase ?
4. Man teste ob die gefundenen Substanzen
auch in ganzen Zellen aktiv sind
5. Man optimiere die besten Verbindungen
durch chemische Modifikation
(spezifischer, wirksamer, bessere
pharmakologische Eigenschaften, etc)
6. Etc, etc etc . . . (2 - 4 Jahre)
NGW Winterthur 27.2.2015Ein “High-Throughput-Screening” einer proprietären Substanzbank
(von Nycomed Pharma / Takeda Pharma; ca. 500’000 Verbindungen)
mit rekombinanter Phosphodiesterase produzierte eine Serie von hoch
potenten Hemmstoffen (EC50 Werte im tiefen nanomolaren Bereich).
Diese sind ca. 1000-mal potenter als der beste bisher verfügbare Wirkstoff (Sildenafil)
Sildenafil
IBMX
Rolipram
Etazolate
Cpd A
NGW Winterthur 27.2.2015Das Dihydrophthalazinon Cpd A ist ein enorm potenter Hemmstoff für
die Phosphodiesterase von Trypanosomen
CpdA:
IC50 4 nM
EC50 30-70 nM
De Koning et al.,
J. infect. Dis. 206, 2012, 229
NGW Winterthur 27.2.2015Der nächste Schritt: Wie optimiert man die Spezifizität des
gefundenen Wirkstoffkandidaten ?
Hier kann die Struktur des Ziel-Enzyms weiterhelfen. Die Raumstruktur der Parasiten-
Phosphodiesterase ist extrem ähnlich mit derjenigen eines entsprechenden
menschlichen Enzyms. ABER: das Trypanosomen-Enzym hat eine “Ausbuchtung”
im aktiven Zentrum die das menschliche Enzym nicht hat (“Parasite Pocket”).
Dieser kleine Unterschied kann nun genutzt werden zum Design von Verbindungen
die ganz spezifisch nur das Parasiten-Enzym hemmen
blau: LmjPDEB1 (Parasit)
gold: HsPDE4D2 (Mensch)
Wang et al., Mol. Microbiol. 66, 2007, 1029
NGW Winterthur 27.2.2015Schema der Optimierung eines Wirkstoffes damit er spezifischer
für Trypanosomen wird
Das menschliche und das Parasiten-Enzym sind extrem ähnlich aufgebaut und
weisen eine Tasche auf in welcher der Inhibitor bindet. Substanzen die nur in
dieser Tasche binden hemmen sowohl das menschliche wie auch das
Trypanosomen-Enzym “parasite
pocket”
Mensch Trypanosom
Wird der Wirkstoff aber chemisch so modifiziert dass er noch einen “Arm” hat
der in die Parasiten-spezifische Vertiefung hineinreicht, dann kann diese Substanz
nur noch an das Trypanosomen-Enzym binden und dieses spezifisch hemmen
NGW Winterthur 27.2.2015Die “Parasite-Pocket”, der entscheidende
strukturelle Unterschied zwischen dem Enzym
des Menschen und dem der Trypanosomen
Jansen et al., J. Med. Chem. 56, 2013, 2087
T. brucei L. major T. cruzi Mensch
“Compound 1” greift “Compound 2” greift
nicht in die Parasite in die Parasite Pocket:
Pocket: unspezifisch parasiten-spezifischDer lange Weg zu einem neuen Medikament hat
auch Kosten zur Folge
Klinische Entwicklung ZULASSUNG
Entdeckung Vorklinische
Phase I Phase II Phase III Phase IV
Entwicklung
8000-
10,000 10 -30
4-5 3
1
Zahl Verbindungen
KOSTEN
100 - 500 Mio CHF
Modifiziert nach Trends in Parasitol. 17/1, 2001
NGW Winterthur 27.2.2015Moderne Forschung geschieht nie als Einzelaktion mehr oder weniger genialer
EinzelkämpferInnen im stillen Kämmerlein, sondern ist immer ausgesprochene Team-
Arbeit und eng in internationale Netzwerke eingebettet !
Neben den eigentlichen Forschungsgruppen spielen internationale
Organisationen eine immer wichtigere Rolle, sowohl für die
Finanzierung als auch für die Koordination
Ein paar Beispiele:
Die Bill and Melinda Gates Foundation:
http://www.gatesfoundation.org
Die Drugs for Neglected Diseases Initiative:
http://www.dndi.org
Das TDR Programm der Weltgesundheitsorganisation (WHO):
http://apps.who.int/tdr/
Das Finddiagnostics Programm:
http://www.finddiagnostics.org
NGW Winterthur 27.2.2015Die laufenden Entwicklungsarbeiten an den Phosphodiesterase-Inhibitoren
als Antiparasitika laufen momentant im Rahmen eines multinationalen Konsortiums
das unter anderem vom EU Rahmenprogramm 7 finanziert wird
http://www.pde4npd.eu
VU Amsterdam, Dept. Chemie (Prof. Rob Leurs; Leiter des Konsortiums)
University of Glasgow
IOTA Pharmaceuticals (Cambridge, UK)
University of Kent (Canterbury, UK)
European Screening Port (Hamburg)
Consejo Superior de Investigaciones Scientificas (Madrid)
Theodor Bilhartz Institut (Kairo)
Universität Antwerpen
Instituto Oswaldo Cruz (Rio de Janeiro)
TIPharma (Leiden)
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