Steviolglycoside in Süßwaren - Entwicklung und Validierung einer Analysen-methode mittels HPLC-UV - LCI
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» Analytik 485
Steviolglycoside in Süßwaren
Entwicklung und Validierung einer Analysen-
methode mittels HPLC-UV
Teresa Brandes, Marion Raters und Reinhard Matissek
Der Einsatz von Steviolglycosiden als Süßungsmittel ist seit dem 2.12.2011 in der Europä-
ischen Union (EU) erlaubt. Aufgrund ihrer etwa 200-mal stärkeren Süßkraft im Vergleich
zu Saccharose sind Steviolglycoside äußerst attraktiv als Ersatzstoffe, speziell im Süßwaren-
bereich. Jedoch gibt es von der EU Regelungen bezüglich Reinheit und Zusammensetzung
des Süßstoffs, deren Kontrolle erforderlich ist.
Stevia rebaudiana Bertoni ist eine mehr- gehören rund 230 verschiedene Spezies,
jährige, krautige Pflanze aus der Familie wovon aber nur zwei süßende Eigenschaf-
der Korbblütler (Asteraceae), welche ur- ten besitzen: Stevia rebaudiana und Ste-
sprünglich aus dem Nord-Osten von Pa- via phlebophylla (Lemus-Mondaca et al.,
raguay in Südamerika stammt. Schon seit 2012).
vielen Jahrhunderten wird sie dort an- Der süße Geschmack der Steviapflanze
gebaut und als Süßungs- und Heilmittel wird verursacht durch Diterpen-Glycoside
von der indigenen Bevölkerung Paragu- in den Blättern, welche 4–20 % des Tro-
ays und Brasiliens verwendet, u. a. um ih- ckengewichts ausmachen und deren Ge-
ren Mate-Tee zu süßen (Matissek, 2010). halte je nach Anbauart und -bedingungen
Daher wird die Pflanze auch von den Indi- schwanken können (Brandle et al., 1998). Teresa Brandes
anern ka‘a he‘ẽ genannt, was so viel wie Diese Diterpen-Glycoside werden in den
„Süßkraut“ oder „Honigkraut“ bedeutet. Blättern von Stevia rebaudiana biosyn-
Die Pflanze „Stevia rebaudiana“
Die Pflanze selbst wächst am besten un-
thetisiert und dort gespeichert. Es han-
delt sich um sekundäre Stoffwechselpro-
dukte der Pflanze, d. h. es sind Stoffe, die
» Zur Person
absolvierte ihr Studium
ter tropischen Anbaubedingungen: viel weder für einen funktionierenden Zell- im Fach Lebensmittelche-
Wärme und Feuchtigkeit. Da sie nicht stoffwechsel noch für Zellwachstum und mie an der Rheinischen
frosthart ist, kann sie hierzulande nur ein- -teilung notwendig sind (Nuhn, 1990). Friedrich-Wilhelms-Uni-
jährig oder in Gewächshäusern kultiviert versität in Bonn und
werden (Lemus-Mondaca et al., 2012). Steviolglycoside fertigte im Rahmen des
Wissenschaftlich untersucht wurde Ste- Steviolglycoside bestehen aus dem Agly- 1. Staatsexamens ihre
via rebaudiana erstmals 1887 von dem kon (Nicht-Zucker-Komponente) Steviol, wissenschaftliche Ab-
nach Paraguay ausgewanderten Schwei- welches mit verschiedenen Zuckerbau- schlussarbeit am LCI
zer Botaniker Dr. Moises Giacomo Bertoni.
Er verfasste 1899 die erste wissenschaftli-
steinen glykosidisch verknüpft ist. Ste-
viol selbst ist geschmacklos und erfährt
in Köln an.
«
che Beschreibung und botanische Einord- durch die Konjugation mit Zuckern eine
nung (Kienle, 2012). Zu der Gattung Stevia enorme Zunahme seiner Wasserlöslich-
DLR | September 2013 «
486 Analytik «
und Tabelle 1 zeigen die allgemeine Struk-
R2 tur der Steviolglycoside.
O
Die rechtliche Beurteilung
Die Zulassung von Stevia als Lebensmittel
CH3 erstreckte sich insgesamt über 14 Jahre.
CH2
1997 wurde der 1. Antrag für die Zulas-
sung der Pflanze sowie der aus ihr ge-
wonnenen Erzeugnissen gestellt. Eine Zu-
lassung war notwendig, weil diese „vor
H3C O dem Stichtag in noch nicht nennenswer-
Abb. 1 tem Umfang im Handel“ waren und somit
O
Allgemeine Struktur in den Geltungsrahmen der Novel-Food-
R1
der Steviolglycoside Verordnung (Verordnung (EG) Nr. 258/97)
(s. a. Tab. 1) fallen. Da aber aufgrund unzureichender
Datenmenge die gesundheitliche Un-
bedenklichkeit von Stevia für den Ver-
braucher nicht bestätigt werden konnte,
keit, sodass auch ein Transport inner- wurde die Zulassung im Februar 2000 mit
halb der Pflanze möglich ist. Die beiden der Entscheidung 2000/196/EG der Euro-
Hauptglycoside Steviosid und Rebaudio- päischen Kommission abgelehnt. 2007
sid A machen mit etwa 90 % des Gesamt- wurde erneut ein Antrag bei der Europä-
glycosidgehalts den größten Anteil aus. ischen Behörde für Lebensmittelsicherheit
Daneben treten noch die Steviolglycoside (EFSA) eingereicht, welche im April 2010
Steviolbiosid, Rebaudiosid B, C, D, F, Dul- zu einer positiven Bewertung des Süß-
cosid A und Rubusosid als Minorkompo- stoffs kam. Das bedeutet, für den Verbrau-
nenten auf, wobei aber nicht alle davon cher sind keine toxischen, kanzerogenen
natürlichen Ursprungs sind (Bergs et al., oder ähnliche unerwünschte Wirkungen
2012). Auf diese insgesamt neun Steviol- durch Steviolglycoside bekannt, sodass ein
glycoside sowie Rebaudiosid E wird auch ADI-Wert von 4 mg Stevioläquivalente/kg
in Verordnung (EU) Nr. 231/2012 verwie- Körpergwicht/Tag formuliert wurde. Der
sen, da nur diese als Zusatzstoff in Lebens- Begriff ADI steht für „acceptable daily
mitteln unter gewissen Reinheitskriterien intake“ und stellt die Menge einer Sub-
verwendet werden dürfen. Abbildung 1 stanz dar, die täglich ein Leben lang auf-
Tab. 1 Übersicht der 10 zugelassenen Steviolglycoside (modifiziert, Kienle 2012)
Steviolglycosid R-Gruppen in Abb. 1 Summenformel molekulare Masse Süßkraft im
[g/mol] Vergleich zu Zucker
(Saccharose = 1)
R1 R2
Rebaudiosid A β-glc- (β-glc)2-β-glc- C44H70O23 967,01 200–300
Rebaudiosid B H (β-glc)2-β-glc- C38H60O18 804,88 150
Rebaudiosid C β-glc- (β-glc, α-rha-)-β-glc- C44H70O22 951,01 30
Rebaudiosid D β-glc-β-glc- (β-glc)2-β-glc- C50H80O28 1129,15 221
Rebaudiosid E β-glc-β-glc- β-glc-β-glc- C44H70O23 967,01 174
Rebaudiosid F β-glc- (β-glc, β-xyl)-β-glc- C43H68O23 936,99 200
Steviosid β-glc- β-glc-β-glc- C38H60O18 804,88 210
Steviolbiosid H β-glc-β-glc- C32H50O13 642,73 90
Rubusosid β-glc- β-glc- C32H50O13 642,73 114
Dulcosid A β-glc- β-rha-β-glc- C38H60O17 788,87 30
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» Analytik 487
genommen werden darf, ohne gesund- sind Peptide, Heterocyclen, Dihydrochal-
heitliche Beeinträchtigungen befürchten kone und andere Substanzklassen. Stevi-
zu müssen. Am 11. November 2011 wurde olglycoside gehören wie oben erwähnt zu
schließlich die „Verordnung zur Zulassung den Süßstoffen. Durch ihre enorme Süß-
von Steviolglycosiden als Süßungsmittel“ kraft sind nur geringe Mengen des Zusatz-
(Verordnung (EU) Nr. 1131/2011) erlassen, stoffs notwendig. Um die fehlende Masse
entsprechend der seit dem 2. Dezember des bei herkömmlichen Produkten einge-
2011 – unter gewissen Anforderungen be- setzten Zuckers zu ersetzen, werden häu-
züglich Reinheit, Zusammensetzung und fig Ballaststoffe wie etwa Polydextrose
Höchstmenge – Steviolglycoside als Süß- oder Inulin verwendet. Die große Ver-
stoff in der gesamten EU verwendet wer- braucherakzeptanz und der Unterschied Dr. Marion Raters
den dürfen. Zu erkennen ist eine Verwen- zu anderen, bisher zugelassenen Süßstof- Staatl. gepr. Lebens-
dung dieser im Zutatenverzeichnis an der fen, liegt in der Natürlichkeit des neuen mittelchemikerin,
E-Nummer „E 960“. Süßstoffs. Er wird ausschließlich durch Ex- stellvertretende Insti-
traktion aus den Blättern und nicht wie tutsleiterin, LCI Köln
Die Verwendung von Steviol- etwa Saccharin oder Aspartam durch che-
glycosiden in Süßwaren mische Synthesen gewonnen (Rosenplen-
Steviolglycoside werden als Süßungsmit- ter und Nöhle, 2007; Matissek 2009).
tel verwendet und gehören somit zu den Zu Beginn ihrer Herstellung wurde
Lebensmittelzusatzstoffen. Unter der Be- beim Verzehr steviahaltiger Lebensmittel
zeichnung Süßungsmittel werden natür- häufig ein bitterer Nachgeschmack fest-
liche oder synthetisch hergestellte Stoffe gestellt. Das diesen unerwünschten Nach-
zusammengefasst, die als Ersatz für Haus- geschmack verursachende Steviolglyco-
haltszucker (Saccharose) genutzt werden sid – das Steviosid – ist das in der Pflanze
können. Unterschieden wird bei Süßungs- mengenmäßig wichtigste Steviolglycosid
mitteln zwischen Zuckeraustauschstoffen und war früher dementsprechend auch
und Süßstoffen. Diese beiden Stoffgrup- zu einem großen Teil in den Produkten
pen zeichnen sich durch sehr verschiedene enthalten. Durch neue Züchtungen und
Eigenschaften, aber auch durch Gemein- verschiedene Prozessführungen und Kris-
samkeiten aus. Generell sind Süßungsmit-
tel für Diabetiker geeignet, da sie kaum
tallisationsschritte bei der Extraktion von
Steviolglycosiden aus der Pflanze können
» Reiner Süß-
geschmack von
einen Einfluss auf den Blutglucose-Spie-
gel haben. Weiterhin werden sie von der
nun jedoch auch Extrakte hergestellt wer-
den, die bis zu 99 % Rebaudiosid A enthal-
Rebaudiosid A «
Mundflora nicht verstoffwechselt, d. h. es ten. Dieses gilt als rein süß und hat keinen
bilden sich keine Säuren, die den Zahn- bitteren Nachgeschmack (Kienle, 2012).
schmelz schädigen können (Rosenplenter Aus diesem Grund wird Rebaudiosid A
und Nöhle, 2007). häufig als einziges Steviolglycosid zur Her-
Unter Zuckeraustauschstoffen werden stellung von steviahaltigen Süßwaren ver-
Zuckeralkohole, auch Polyole genannt, wendet. Bisher gibt es schon eine kleine
zusammengefasst, wie etwa Xylit, Mannit Auswahl an steviahaltigen Süßwaren, die
oder Sorbit. Sie entstehen bei der Hydrie- im Einzelhandel erworben werden kön-
rung ihrer jeweiligen Zuckeräquivalente, nen. Am häufigsten handelt es sich hierbei
haben eine ähnliche Süßkraft wie Zucker um Schokoladen und Bonbons, aber auch
und liefern dabei etwa 40 % weniger Ka- Kaugummis, Backwaren und Fruchtgum-
lorien. Den Zuckeraustauschstoffen ste- mis sind auf dem Markt erhältlich.
hen die Süßstoffe gegenüber, welche zum
Teil eine enorme Süßkraft im Vergleich zu Methodenentwicklung und
Saccharose – das 30–300-fache – besitzen, -validierung
jedoch kaum Kalorien liefern. Chemisch Aufgrund der bereits beschriebenen Zu-
gesehen handelt es sich bei Süßstoffen um lassungsbeschränkungen für Steviolgly-
eine sehr heterogene Gruppe, vertreten coside in Lebensmitteln, ist die Analytik
DLR | September 2013 «
488 Analytik «
dem Schema in Abbildung 2 zu entneh-
5 g der homogenisierten Probe in ein 50-mL-Becherglas einwiegen men.
Die Quantifizierung
Zugabe von 30 mL eines ACN/Wasser-Gemischs (3/7, v/v)
Für die Bestimmung der Gehalte an Stevi-
olglycosiden in Lebensmitteln ist die RP-
30 Minuten bei Raumtemperatur (Schokoladen bei 50 °C) rühren HPLC die Methode der Wahl. Hier konnte
eine sehr zufriedenstellende Auftrennung
Inhalt es Becherglases quantitativ in einen 50-mL-Kolben überführen, innerhalb kurzer Laufzeiten erreicht wer-
gut mit ACN/Wasser (3/7) nachspülen
den. Zur Quantifizierung der Analyten
wurde die Methode des externen Stan-
Je 2 mL Carrez I und II zugeben, nach jeder Zugabe gut durchmischen
dards verwendet. Ein Beispielchromato-
gramm eines Standardmix mit insgesamt
Kolben im Wasserbad auf 20 °C temperieren und mit Lösungsmittel-
gemisch bis zur Marke auffüllen neun Steviolglycosiden ist in Abbildung 3
zu sehen.
Durch einen Faltenfilter filtrieren
Die Methodenvalidierung
Seit dem verstärkten Einzug von QS-Syste-
Filtrat membranfiltrieren (∅ 0,2 μm) ins Vial
men in Laboratorien und der Einführung
der Akkreditierung beschäftigt man sich
HPLC-UV bei 210 nm
intensiv mit der Methodenvalidierung.
Grundsätzlich handelt es sich bei der Me-
Abb. 2 thodenvalidierung um ein wichtiges Ins-
Schema der entwickelten trument der Qualitätssicherung (QS). Nach
Probenaufarbeitung dieser Substanzen von großer Bedeutung. der DIN EN ISO/IEC 17025:2005 ist die Vali-
Es ist durchaus zu erwarten, dass die An- dierung definiert als „… die Bestätigung
zahl an steviahaltigen Süßwaren künftig durch Untersuchung und Bereitstellung
weiter steigen wird. Aus diesem Grund eines Nachweises, dass die besonderen
wurde im LCI eine Bestimmungsmethode Anforderungen für einen speziellen, be-
zur Analytik von Steviolglycosiden in Le- absichtigten Gebrauch erfüllt werden.“ So
bensmitteln – speziell in Süßwaren – ent- soll sichergestellt werden, ob die für ei-
wickelt und validiert. nen bestimmten Parameter ausgesuchte
Methode, die verwendeten Geräte und
Probenaufarbeitung Materialien sowie die Umgebungsbedin-
Als Matrix zur Methodenentwicklung gungen geeignet sind, um zuverlässige
diente eine Zuckerware, gesüßt mit E 960. Analysenergebnisse zu erhalten. Der Ma-
Die im Rahmen einer Forschungsarbeit im ximalumfang einer Validierung umfasst
LCI entwickelte Probenaufarbeitung ist Präzision, Richtigkeit (auch Wiederfin-
dungsrate genannt), Linearität, Robust-
heit und Nachweis- und Bestimmungs-
grenze.
Prof. Dr. Reinhard Matissek Als Ergebnis der im Anschluss an die
Institutsleiter und Direktor des LCI; apl. Pro- Methodenentwicklung durchgeführten
fessor am Institut für Lebensmittelchemie Methodenvalidierung für Rebaudiosid A
der TU Berlin; u. a. Vorstandsmitglied der konnte festgestellt werden, dass die Prä-
Stiftung der Deutschen Kakao- und Schoko- zision der entwickelten Methode nur ei-
ladenwirtschaft, Hamburg/Bonn, Mitglied ner geringen relativen Standardabwei-
in verschiedenen Kommissionen des Bun- chung unterliegt. Die Richtigkeit wurde
desinstuts für Risikobewertung (BfR) und mithilfe eines zertifizierten Referenzma-
Mitglied des Wissenschaftlichen Aus- terials nachgewiesen. Die Nachweis- und
schusses des FEI die Bestimmungsgrenze der entwickelten
» September 2013 | DLR
» Analytik 489
Intensität
18
16
14
D
id
s
io
12 ud
ba
Re
–
10
sid A
1
io sid
Abb. 3
ev io
St d
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8
ul dio d F
Trennung eines Stan-
C
3 eb
sid id
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A
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6 dardmix mit neun
bu
sid
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b
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–
D
Steviolglycosiden auf
7
4 –
4
ba
–
5
ev
6
Re
St
–
einer RP-18-HPLC-Säule
–
9
8
2
mit UV-Detektion;
0
Konzentration der
0 5 10 15 20 25 30 35 Steviolglycoside beträgt
Zeit [min]
je 0,02 µg/mL
Methode zur Bestimmung von Rebaudio- sind neben dem Sollwert noch eine so-
sid A in Süßwaren sind in Tabelle 2 auf- genannte obere und untere Warngrenze
geführt. (OWG bzw. UWG) sowie eine obere und
untere Eingriffsgrenze (OEG bzw. UEG) zu
Die Qualitätsregelkarte finden. Die Warngrenzen (WG) bzw. Ein-
Insbesondere bei industriellen Laboren griffsgrenzen (EG) ergeben sich aus der
gelten strenge Qualitätsstandards, deren Standardabweichung (sr) und dem Mittel-
Einhaltung dringend erforderlich ist. Ein wert (x) nach den Formeln 1 und 2.
laborinternes Mittel einer solchen Qua- WG = x ± 2sr Formel 1
litätssicherung ist neben der Teilnahme EG = x ± 3sr Formel 2
an Ringversuchen (externe Qualitätssiche-
rung) das Führen von sog. Qualitätsregel- Durch Auftragung des Sollwerts sowie der
karten (QRK) (interne Qualitätssicherung).
Eine QRK dient der grafischen Überprü-
Warn- und Eingriffsgrenzen in ein Dia-
gramm erhält man eine Shewhart-Regel-
» Trennung von
neun Steviol-
fung der Qualität einer Analysenmethode. karte (benannt nach dem Statistiker Wal- glycosiden in
Voraussetzung hierfür ist eine Normal-
verteilung der Messwerte und eine kon-
ter A. Shewhart), in die die Messwerte der
QS-Probe eingetragen werden. Auf diese
einem Lauf «
stante Standardabweichung. Zum Anle- Weise können zufällige und systemati-
gen dieser QRK wird eine stets gleiche sche Fehler erkannt werden. Überschrei-
Kontrollprobe, im Folgenden als Qua- ten Messwerte die Warngrenzen, kann
litätssicherungs-Probe (QS-Probe) be- dies einmalig toleriert werden, werden je-
zeichnet, in einer Mehrfachbestimmung doch die Eingriffsgrenzen überschritten,
(mindestens 20 Werte) auf den zu bestim- so muss nach den Ursachen geforscht und
menden Analyt untersucht. Die QS-Probe der Fehler behoben werden (Kromidas,
dient in der Routineanalytik zur arbeits- 1995; Funk et al., 2005).
täglichen Überprüfung der Kompetenz Eine solche Qualitätsregelkarte wurde
der Mitarbeiter, der Überprüfung der Che- im Rahmen der oben beschriebenen Me-
mikalien und Gebrauchsgegenstände so-
wie zur Funktionsüberprüfung der ver-
wendeten Geräte. Aus den so generierten Tab. 2 Nachweis- und Bestimmungsgrenze von Rebaudiosid A mittels
UV-Detektion
Messwerten wird der Mittelwert, auch
Sollwert genannt, gebildet sowie die Stan- Nachweisgrenze [µg/mL] 0,1
dardabweichung ermittelt. Auf der QRK Bestimmungsgrenze [µg/mL] 0,4
DLR | September 2013 «490 Analytik «
waren zu entwickeln. Diese ermöglicht es,
Rebaudiosid-A-Gehalt [mg/kg]
645 die verschiedenen laut EU-Verordnung Nr.
OEG 231/2012 relevanten Steviolglycoside se-
635
625
lektiv, schnell und robust zu erfassen. Die
OWG
für Rebaudiosid A durchgeführte Metho-
615
denvalidierung lieferte sehr zufriedenstel-
605
lende Ergebnisse und auch die erstellte
595 Sollwert
Qualitätsregelkarte erfüllt alle Anfor-
585
derungen an die interne Qualitätssiche-
575 rung. Somit wird es in Zukunft möglich
565
UWG
sein, die durch die EU gestellten Anfor-
555 derungen bezüglich Reinheit und Zusam-
545 UEG mensetzung der Steviolglycoside in Süß-
535
waren zu überprüfen.
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Probennummer
Abb. 4 Anschrift der Autoren
Qualitätsregelkarte
Teresa Brandes
für den Analyten thodenvalidierung für den Analyten Re-
Dr. Marion Raters
Rebaudiosid A baudiosid A angelegt und ist in Abbildung Prof. Dr. Reinhard Matissek
4 zu sehen. Dieser Qualitätsregelkarte Lebensmittelchemisches Institut
kann somit entnommen werden, dass die des Bundesverbandes der Deutschen
Messwerte für Rebaudiosid A zwar ge- Süßwarenindustrie e. V.
ringen Schwankungen unterliegen, diese Adamsstr. 52–54
aber innerhalb der Warngrenzen der QRK 51063 Köln
liegen. Aufgrund dessen kann von einer marion.raters@lci-koeln.de
reinhard.matissek@lci-koeln.de
gut funktionierenden Analytik ausgegan-
www.lci-koeln.de
gen werden.
Fazit
Verweise finden Sie unter
Es ist im LCI gelungen, eine sehr sensitive,
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Steviolglycoside in Süßwaren
Entwicklung und Validierung einer Analysenmethode mittels HPLC-UV
Teresa Brandes, Marion Raters und Reinhard Matissek
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über die Zulassungsverweigerung von diana Bertoni, source of a high-potency, vom 27. Januar 1997 über neuartige
„Stevia rebaudiana Bertoni: Pflanzen natural sweetener: A comprehensive Lebensmittel und neuartige Lebens-
und getrocknete Blätter“ als neuartige review on the biochemical, nutritional mittelzutaten.
DLR | September 2013 «Sie können auch lesen
