Die Etablierung eines in vivo Modells zur Untersuchung der Arteriogenese
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Universität Ulm
Medizinische Klinik und Poliklinik
Innere Medizin II
Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. med. Vinzenz Hombach
Die Etablierung eines in vivo Modells zur
Untersuchung der Arteriogenese
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der
Medizinischen Fakultät der Universität Ulm
Alexander Jurij Babiak
Neu-Ulm
2003
Amtierender Dekan: Prof. Dr. R. Marre
1.Berichterstatter: Prof. Dr. J. Waltenberger
2.Berichterstatter Prof. Dr. K.-D. Fischer
Tag der Promotion: 05. Februar 2004
2
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis .................................................................................................................. 3
1. Abkürzungsverzeichnis ..................................................................................................... 5
2. Einleitung .......................................................................................................................... 6
2.1. Morbidität und Mortalität durch kardiovaskuläre Erkrankungen............................... 6
2.2. Gefäßwachstumsprozesse........................................................................................... 6
2.2.1. Vaskulogenese ..................................................................................................... 6
2.2.2. Angiogenese ........................................................................................................ 7
2.2.3. Arteriogenese....................................................................................................... 7
2.3. Die Entdeckung der Kollateralblutversorgung ........................................................... 8
2.4. Der Zusammenhang koronarer Kollateralgefäße auf die Morbidität/Mortalität ........ 9
2.5. Mechanismen der Arteriogenese .............................................................................. 10
2.6. Der Einfluss arterieller Kollateralen auf die Perfusion ischämischer Gewebe ........ 11
2.7. Tiermodelle der Arteriogenese ................................................................................. 12
2.7.1. Die Wahl der Spezies. ....................................................................................... 12
2.7.2. In vivo Perfusionsmessungen in Tiermodellen der Arteriogenese .................... 13
2.8. Der Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) und dessen Rezeptoren ............. 15
2.8.1. Der Vascular Endothelial Growth Factor .......................................................... 15
2.8.2. Die VEGF-Rezeptoren ...................................................................................... 15
2.8.3. Die Wirkungen von VEGF-A in vivo ................................................................ 16
2.9. Ziele der Arbeit......................................................................................................... 17
3. Material und Methoden ................................................................................................... 18
3.1. Reagenzien und Geräte............................................................................................. 18
3.1.1. Reagenzien und Geräte für die Operationen...................................................... 18
3.1.2. Reagenzien und Geräte für die nuklearmedizinische Untersuchungen ............. 18
3.1.3. Reagenzien für die Behandlung der Versuchsgruppen...................................... 19
3.2. Die Produktion der Reagenzien und Medien............................................................ 19
3.2.1. Das Kontrastmittel............................................................................................. 19
3.2.2. Die Zubereitung der Injektionslösungen ........................................................... 19
3.3. Die Versuchsgruppen und deren Behandlungsschemata.......................................... 20
3.3.1. Arbeitshypothese ............................................................................................... 20
3.3.2. Einteilung der Versuchsgruppen ....................................................................... 21
3.3.3. Injektionstechnik und Injektionsschema ........................................................... 21
3.4. Die Tierexperimente ................................................................................................. 22
3.4.1. Der Tierversuchsantrag...................................................................................... 22
3.4.2. Die Versuchstiere und deren Haltung................................................................ 22
3.4.3. Die Operationen................................................................................................. 22
3.5. Analyseverfahren zur Messung des Kollateralenwachstums ................................... 24
3.5.1. Die nuklearmedizinische Untersuchung............................................................ 24
3.5.2. Die statistische Auswertung der Daten der Perfusionsszintigraphie ................. 26
3.5.3. Die morphologische Evaluation der Kollateralgefäße....................................... 26
4. Ergebnisse........................................................................................................................ 28
4.1. Die Operation zur Ligatur der A. femoralis führt zu einer reproduzierbaren Ischämie
des Hinterlaufes der Maus ............................................................................................... 28
4.2. Die Perfusions - Szintigraphie.................................................................................. 29
4.2.1. Evaluierung der szintigraphischen Messung ..................................................... 29
4.2.2. Die Extremitätenperfusion am Tag 1 nach Ligatur der rechten A. femoralis ... 32
4.2.3. Extremitätenperfusion am Tag 4 nach Ligatur der rechten A.femoralis ........... 32
4.2.4. Extremitätenperfusion sieben Tage nach Ligatur.............................................. 33
3
4.3. Änderungen der Kollateralenmorphologie als Folge einer regionalen
Perfusionsstörung ............................................................................................................ 37
4.3.1. Durchführbarkeit einer morphologischen Analyse............................................ 37
4.3.2. Ergebnisse der Kollateralenevaluation .............................................................. 38
5. Diskussion ....................................................................................................................... 43
5.1. Die Etablierung eines neuen Tiermodells der Arteriogenese ................................... 43
5.1.1. Die Maus als Versuchstier................................................................................. 43
5.1.2. Die Zielgrößen der in vivo Experimente............................................................ 43
5.1.3. In vivo Perfusionsmessungen bei Tiermodellen der Arteriogenese – die
Szinitigraphie im Vergleich mit bereits etablierten Verfahren.................................... 45
5.1.4. Die Gefäßmorphometrie bei Kleintieren ........................................................... 46
5.2. Die Ergebnisse der Studie unter kritischer Betrachtung........................................... 48
5.2.1. Die Ligatur der A. femoralis.............................................................................. 48
5.2.2. Die wiederholte Applikation der Testsubstanzen.............................................. 48
5.2.3. Die Ergebnisse der Perfusionsszintigraphie ...................................................... 48
5.2.4. Die Ergebnisse der morphometrischen Beurteilung der Kollateralen ............... 50
5.3. Der Einsatz von Wachstumsfaktoren zur Steigerung der Perfusion in
minderperfuniertem Gewebe ........................................................................................... 51
5.3.1. Experimentelle Vorarbeiten............................................................................... 51
5.3.2. Klinische Studien mit VEGF als perfusionssteigerndes Agens ........................ 51
5.4. Schlussfolgerungen aus der Arbeit ........................................................................... 55
6. Zusammenfassung ........................................................................................................... 56
7. Literaturverzeichnis ......................................................................................................... 58
8. Danksagung ..................................................................................................................... 73
9. Lebenslauf ....................................................................................................................... 74
4
1. Abkürzungsverzeichnis
A. Arteria
ANOVA Analysis of Variance between groups
EGF Epidermal Growth Factor
eNOS endothelial Nitric Oxide Synthase
bFGF basic Fibroblast Growth Factor
ICAM-1 Intercellular Adhesion Molecule
iNOS inducible Nitric Oxide Synthase
KHK Koronare Herzkrankheit
LSM Least Square Mean
MBq Mega Becquerel
MCP-1 Monocyte Chemoattractant Protein-1
MSA Maus Serum Albumin
NO Nitric Oxide, Stickstoffmonoxid
pAVK periphere arterielle Verschlusskrankheit
PBS Phosphate Buffered Saline, gepufferte Kochsalzlösung
PDGF-BB Platelet Derived Growth Factor
PlGF Placenta Growth Factor
pM piko Molar
Tc-99m-MIBI Hexakis(2-methoxyisobutylisonitrile)-technetium-99m: Lipophiler
Perfusionsmarker, welcher mit Technetium 99m gekoppelt zu
Durchblutungsmessungen –verwendet wird.
TGF-β1 Transforming Growth Factor β1
TNF-α Tumor Nekrose Faktor α
VCAM-1 Vascular Cell Adhesion Molecule-1
VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
VEGFR Vascular Endothelial Growth Factor Receptor
52. Einleitung
2.1. Morbidität und Mortalität durch kardiovaskuläre Erkrankungen
Im Jahre 1999 starben in Deutschland 406122 Menschen an Erkrankungen des Herz-,
Kreislaufsystems. Diese sind somit die häufigste Todesursache in unserem Land (90). Den
größten Anteil an kardiovaskulären Todesfällen stellt die ischämische Herzkrankheit mit
183736 Todesfällen pro Jahr (90). Diese Zahlen sind für andere Industrienationen
vergleichbar (1). Die wichtigsten Risikofaktoren kardiovaskulärer Erkrankungen sind die
arterielle Hypertonie, das Rauchen und Diabetes Mellitus. Dies zeigt, dass trotz bereits
etablierter Verfahren der Herzchirurgie oder der interventionellen Kardiologie noch Bedarf
an neuen Therapiestrategien besteht. Ein interessanter Ansatz ist das Beeinflussen der
physiologischen Kollateralblutversorgung. Das Fördern der Ausbildung von natürlich
gewachsenen Umgehungsgefäßen könnte – ähnlich der Koronarchirurgie oder der
interventionellen Kardiologie – die Blutversorgung des ischämisch beeinträchtigten
Herzens verbessern uns somit Morbidität und Mortalität der koronaren Herzkrankheit
senken.
2.2. Gefäßwachstumsprozesse
Seit einigen Jahren werden drei Arten des Wachstums von Blutgefäßen unterschieden:
die Vaskulogenese, die Angiogenese und die Arteriogenese (9).
2.2.1. Vaskulogenese
Vaskulogenese beschreibt die embryogenetische Entwicklung von Gefäßen. Hierbei
kommt es in der Embryonalphase zu einer Aggregation von mesenchymalen Zellen zu
sogenannten Blutinseln. Die darin enthaltenen pluripotenten embryonalen Vorläuferzellen
differenzieren zu Hämangioblasten und schließlich zu Angioblasten. Diese wiederum
differenzieren weiter zu endothelialen Vorläuferzellen (59, 64). Diese Zellen reihen sich
anschließend zu einem primitiven Netzwerk, welches später zu Gefäßen differenziert. Seit
kurzem ist bekannt, dass auch im peripheren Blut des adulten Organismus zirkulierende
6Hämangioblasten und endotheliale Vorläuferzellen zu finden sind (59). Diese scheinen bei
Endothelregeneration und bei nicht-embryogenetischen Gefäßwachstumsprozessen, wie
der Wundheilung, eine Rolle zu spielen, (12).
2.2.2. Angiogenese
Eine andere Art des Gefäßwachstums ist die Angiogenese. Dieser Begriff wurde bereits
1971 von Folkman geprägt. Folkman beschrieb damals die Vaskularisierung solider
Tumoren. Hierbei kommt es durch Proliferation und Migration von Endothelzellen zum
Aussprossen von Kapillaren aus einem bereits bestehenden kapillären Netzwerk (22). Es
kommt zu einer Destabilisierung bereits vorhandener Gefäße und zum Abbau der
perivaskulären Matrix. Hierauf wandern Endothelzellen in diesen Bereich ein und
proliferieren. Zahlreiche Zytokine wie VEGF, PlGF und Angiopoietin 2 sind daran
beteiligt. Die Endothelzellen lagern sich schließlich zu tubulären Strukturen an (9). Ein
wichtiger Aktivator der Angiogenese ist die Ischämie in minderperfundiertem Gewebe,
welche über zahlreiche Signalwege die Angiogenese in Gang setzt (53), (103). Die
Angiogenese findet physiologischerweise bei der Wundheilung, Frakturheilung,
Follikulogenese, Ovulation und in der Embryogenese statt. Pathologische Formen der
Angiogenese, bei denen die hemmende Regulation außer Kraft gesetzt scheint sind die
proliferative Retinopathie, die Vaskularisierung solider Tumoren und die Vaskularisierung
arterieller atherosklerotischer Plaques.
2.2.3. Arteriogenese
Arteriogenese ist das Wachstum arterieller Kollateralgefäße (2). Hierbei kommt es nach
Verschluss einer großen Arterie zu einer Vergrößerung bereits vorhandener Arteriolen,
welche eine natürliche Umgehung bilden, um das der verschlossenen Arterie
nachgeschaltete Gewebeareal mit Blut zu versorgen. Da die Arteriogenese Gegenstand
dieser Arbeit ist, soll sie im Folgenden näher erläutert werden.
72.3. Die Entdeckung der Kollateralblutversorgung
Bereits im Jahre 1845 wies Luigi Porta in über
200 Tierversuchen die Bedeutung der
Kollateralblutversorgung nach. In seinem Werk
Delle alterazioni patologiche delle arterie per la
ligatura e la torsione erzeugte er experimentell
die Entstehung einer Kollateralblutversorgung
durch Ligatur der A. femoralis in einem
Schwein. Porta beschrieb neu entstandene
korkenzieherartig geformte Gefäße, welche den
Bereich der Ligatur umgaben. Er bewies, dass
die Unterbindung einer großen Arterie durch die
neu entstandenen Kollateralen kompensiert
werden kann und es deshalb nicht zu Nekrosen
der distalen Extremität kommt. Im Jahre 1940
wurden von Eckstein erneut experimentelle
Ligaturen verschiedener Arterien durchgeführt.
Bei Hunden wurden wahlweise die A. femoralis,
die A. carotis, der Ramus interventricularis
Abbildung 1: Darstellung arterieller
anterior oder der Ramus circumflexus
Kollateralen nach Ligatur der A. femoralis
unterbunden. Die Flussgeschwindigkeit und der beim Schwein aus dem Jahre 1845 (Paris,
Blutdruck distal der Ligatur wurden gemessen. Bibliothek der alten medizinischen Fakultät)
Eckstein zeigte, dass es in der Frühphase nach
einem arteriellen Verschluss zu einer kompensatorischen Rekonstitution des Blutflusses
kommt, welche initial schnell verläuft und im Verlauf immer langsamer wird. Damals
wurde bereits richtig geschlossen, dass Mechanismen wie z.B. Vasodilatation in der
Akutphase zum Tragen kommen. Für die Spätphase wurden weitere Prozesse postuliert,
wie wir heute wissen: das Wachstum von Kollateralen – die Arteriogenese (16).
82.4. Der Zusammenhang koronarer Kollateralgefäße auf die
Morbidität/Mortalität
Die Existenz koronarer Kollateralgefäße kann die Toleranz gegenüber Ischämie bei
arteriellen Gefäßverschlüssen bzw. Stenosen verbessern. Infarkte treten später oder gar
nicht ein, wenn das von einer Gefäßstenose betroffene Gewebeareal über eine
Kollateralversorgung verfügt (76).
In der klinischen Situation ergibt das Vorhandensein arterieller Kollateralgefäße im Herzen
durchweg positive Auswirkungen auf die Morbidität und Mortalität nach einem
Herzinfarkt:
• die Größe eines Myokardinfarktes und die damit verbundene Mortalität wird
gesenkt (29), (25), (107). Hierbei korreliert der Erhalt der Myokardfunktion und die
Größe des Infarktes mit der Ausprägung der Kollateralgefäße, welche das
ischämische Areal versorgen (70), (24)
• infarkttypische Komplikationen wie linksventrikuläre Aneurysmen treten seltener
auf (32)
• die linksventrikuläre Funktion nach stattgefundenem Herzinfarkt ist signifikant
verbessert (72)
• die Prävalenz einer post-infarkt Angina ist reduziert (70)
Die Ausprägung von Kollateralgefäßen beim Menschen findet angiographischen
Erhebungen zufolge dann statt, wenn eines der Koronargefäße an einer Stelle mehr als
70% stenosiert ist (65). Sieben Tage nach Totalverschluss einer Koronararterie kommt es
zu einer Zunahme funktionell relevanter Kollateralen, wobei zu dieser Zeit bereits 84%
aller Patienten sichtbare Kollateralgefäße aufweisen (79). Die Entstehung hämodynamisch
relevanter Kollateralgefäße findet in mehreren Prozessen statt, welche nachfolgend kurz
beleuchtet werden sollen.
92.5. Mechanismen der Arteriogenese
Die Arteriogenese ist eine Vergrößerung bereits vorhandener arterieller Gefäße.
Experimentell konnte gezeigt werden, dass bereits 6 Stunden nach Verschluss einer
Koronararterie eine passive Erweiterung dieser Kollateralgefäße stattfindet (74). Neben der
passiven Dilatation der Arteriolen findet zusätzlich eine Proliferation glatter Muskelzellen
und Endothelzellen in der Gefäßwand statt. Nach Verschluss einer großen Arterie kommt
es zu einem Abfall des Blutdruckes im nachgeschalteten Gewebe. Dadurch bildet sich ein
Druckgradient über der Kollateralarterie aus. Dieser wiederum führt zu einem verstärkten
Fluss in derselben. Der gesteigerte Fluss bedingt durch den kleinen Durchmesser der
präformierten Arteriole eine Steigerung der Schubspannung am Endothel. Dies gilt als
auslösender Faktor und somit als Aktivator der Arteriogenese. Experimentelle Studien
zeigten nach Verschluss einer Arterie einen Anstieg der Schubspannung in den
Kollateralen um den Faktor 100 und mehr (8). Diese Schubspannung führt durch
Verformung der Endothelzelle zu einer Aktivierung des Endothels (10). Hierauf kommt es
bereits nach 12 Stunden zu einer verstärkten Expression von Adhäsionsmolekülen wie
ICAM-1 und VCAM-1 auf der lumenzugewandten Seite der Endothelzellen (77). Zudem
kommt es zu einer gesteigerten Expression zahlreicher Wachstumsfaktoren. Die erhöhte
Expression von Adhäsionsmolekülen und die Synthese von MCP-1 bewirken eine Invasion
zirkulierender Leukozyten, insbesondere Monozyten in die arterielle Gefäßwand (2). Diese
modulieren durch Freisetzung verschiedener Zytokine die Proliferation von glatten
Muskelzellen und Endothelzellen und steuern somit den Umbau der Gefäßwand. Bereits 22
Stunden nach experimenteller Arterienokklusion ist die erste Zellteilung im Endothel der
Kollateralgefäße beendet (75) und insgesamt eine starke Proliferation im Endothel und der
glatten Muskelzellen der Kollateralen nachweisbar (77). Diese Prozesse führen schließlich
zu einer Zunahme des Durchmessers der Arteriole, der das 20–fache des Ursprungswertes
betragen kann.
102.6. Der Einfluss arterieller Kollateralen auf die Perfusion ischämischer
Gewebe
Häufig wurde diskutiert, wodurch die reduzierte Perfusion in ischämische Gewebe
tatsächlich kompensiert wird: Angiogenese oder Arteriogenese?
Beide Prozesse lassen sich nach Unterbinden einer Arterie nachweisen. Es wurde jedoch
experimentell belegt, dass im Kaninchen Modell die Perfusion der Extremitäten mit de
Arteriogenese zusammenhängt (35), (31). Hierbei konnte gezeigt werden, dass die
Steigerung der Durchblutung hauptsächlich mit Anzahl und Größe der zuführenden
arteriellen Kollateralen einhergeht und nicht mit der Dichte von Kapillaren inmitten des
ischämischen Gewebes.
Ein wichtiger Aspekt sollte jedoch bei der Betrachtung von Perfusionskapazität und dem
Wachstum von Gefäßen berücksichtigt werden:
Der Fluss in einem Gefäß unterliegt überproportional dem Durchmesser desselben.
Unterstellt man das Hagen-Poiseulles Gesetz, so steigt der Fluss mit der 4.Potenz des
Radius [r] an. Die Länge des Gefäßes [L] als auch die Druckdifferenz über dem Gefäß sind
von untergeordneter Bedeutung im Hinblick auf die Stromstärke [V]. Somit haben kleinste
Schwankungen der Gefäßgröße erheblichen Einfluss auf die Perfusion des zu versorgenden
Areals. Dies birgt Schwierigkeiten bei der Quantifizierung solcher Gefäße, da die
Größendifferenz eventuell zu klein ist für die Sensitivität vieler Messmethoden. Hinzu
kommt, dass in vivo Faktoren wie der Vasotonus sowie die Rheologie des Blutes
berücksichtigt werden müssen.
Hagen-Poiseulle Gesetz
π × r 4 × ∆P
V =
8 ×η × L
112.7. Tiermodelle der Arteriogenese
2.7.1. Die Wahl der Spezies.
Experimentelle Ansätze für die Erforschung regionaler Gewebsischämien und die
Rekonstitution der Perfusion wurden an zahlreichen Tierarten in vivo untersucht.
Beschrieben sind sowohl Experimente an Großtieren, wie z.B. Schweinen und Hunden
(75), (16), als auch an Kleintieren wie Kaninchen, Ratten und Mäusen. Sowohl aus
Unterbringungs- und nicht zuletzt aus finanziellen Gründen werden in zahlreichen
Laboratorien Kleintiere favorisiert. Für etliche Kleintierarten sind experimentelle arterielle
Ligaturen - meist der A. femoralis - beschrieben worden. Sowohl Kaninchen (97), (36),
Ratten (50), (91) als auch Mäuse (14), (3), (67), (87), (7), (17), (28), (86), (88), (52), (55),
(71), (89), (93) finden sich in der Literatur zu dieser Art von Versuchen. Nicht nur die
Ligatur peripherer Arterien, sondern auch das Unterbinden koronarer Arterien wurde
beschrieben. Bei diesen Versuchen werden im allgemeinen große Tiere, z.B. Hunde (76)
bevorzugt. Allerdings wurden auch experimentelle Ligaturen koronarer Arterien bei
Kaninchen (58) und Mäusen (106) durchgeführt. Kleintiere bergen in der kardiovaskulären
Forschung zahlreiche Schwierigkeiten: die anatomische Abgrenzung einzelner
Gefäßabschnitte ist in kleinen Tieren unverhältnismäßig schwierig, was das Ligieren der
Gefäße an definierten Stellen erschwert. Des weiteren ist die Bestimmung der Perfusion
und der Funktionalität ischämischer Areale kompliziert. Auch die morphologische
Untersuchung einzelner Gefäßabschnitte ist schwierig, da zumindest in Mäusen und Ratten
keine in vivo Angiographien gemacht werden können.
122.7.2. In vivo Perfusionsmessungen in Tiermodellen der Arteriogenese
Für den Nachweis der funktionellen Relevanz wachsender Kollateralen stehen mehrere
Methoden zur Verfügung. Invasive Messungen der vaskulären Konduktanz und
Flussmessungen einzelner Strombahnen, wie sie in einigen Arbeiten beschrieben werden
(2), kommen einem terminalen Experiment gleich und sollen an dieser Stelle nicht näher
erläutert werden.
2.7.2.1. Mikrosphären zur Perfusionsmessung
Hierbei werden farbige oder radioaktiv markierte Partikel einer definierten Größe (zumeist
15µm) in die arterielle Zirkulation eingebracht. Die Mikrosphären verfangen sich aufgrund
ihrer Ausmaße in den präkapillären Arteriolen. Das Versuchstier muss vorerst nicht getötet
werden, sondern kann auch nach Applikation der Mikrosphären unter Beobachtung
verbleiben. Für die Auswertung muss das Gewebe jedoch entnommen, aufgearbeitet und
mit entsprechenden Maßnahmen ausgewertet werden. Als Zielparameter gilt dann die
Anzahl der Partikel pro Gewichtseinheit des Gewebes. Es ist auch möglich
verschiedenartig markierte Partikel zu unterschiedlichen Zeitpunkten zu injizieren, um auf
diese Weise Längsschnittstudien durchzuführen. Mikrosphären zur Perfusionsmessung
erfordern immer eine Gewebeentnahme, die vor allem bei Kleintieren das Töten derselben
voraussetzt. Diese Methode der Perfusionsmessung gilt jedoch als valide und ist deshalb
weit verbreitet.
2.7.2.2. Laser-Doppler Perfusionsmessung
Als rein nicht-invasive Perfusionsmessung wird die Laser Doppler Untersuchung gewertet.
Diese Technik wurde in zahlreichen Experimenten zur Unterbindung peripherer Arterien
bei Kleintieren angewendet (14), (66), (73). Bei dieser Methode wird mittels eines Laser
Strahls die Oberfläche des zu untersuchenden Gewebes zeilenweise abgetastet. Durch die
festen Blutbestandteile kommt es zu einer Reflexion des Laser Lichtes, was von einer
Photodiode detektiert wird. Durch die Flussgeschwindigkeit der Blutbestandteile kommt es
zu Phasenverschiebungen des reflektierten Lichtes, was quantifiziert und anschließend als
graphische Darstellung ausgegeben werden kann.
132.7.2.3. Die Szintigraphie zur Perfusionsmessung
Die Szintigraphie wurde einmalig in Kleintiermodellen zur Perfusionsmessung der
Extremitäten angewandt (50). Bei dieser Methode wird Technetium 99m markiertes MIBI
intravenös verabreicht, welches sich abhängig von der Perfusion in allen Geweben des
Organismus verteilt (11). Aufgrund seines lipophilen Charakters penetriert MIBI die
Zellmembran und reichert sich in den Zellen an. Die genauen Mechanismen sind hierbei
jedoch nicht geklärt. MIBI wird an Technetium 99m gekoppelt. Dieses Nuklid hat eine
Halbwertszeit von 6 Stunden und ist ein Gamma-Strahler. Dies ermöglicht eine genaue
Detektion mittels einer Gamma Kamera. Die MIBI-Technetium Szintigraphie findet auch
im klinischen Alltag für Perfusionsmessungen Verwendung. Die Validierung dieser
Methode an Kleintieren wurde bereits in einer experimentellen Studie durchgeführt (50).
Dabei wurde bei Ratten nach Unterbindung der A. femoralis die Extremitätenperfusion
gleichzeitig mit Mikrosphären und szintigraphische ermittelt. Die Arbeit kam zu dem
Schluss, diese Methode sei valide für diese Art von Messungen. Die Anwendung der
Perfusionsszintigraphie in einem Arteriogenese Modell der Maus ist jedoch noch nicht
vorbeschrieben.
142.8. Der Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) und dessen
Rezeptoren
2.8.1. Der Vascular Endothelial Growth Factor
VEGF ist mittlerweile eine Familie von 8 strukturverwandten Glykoproteinen. VEGF
wurde im Jahre 1983 entdeckt und damals als Vascular Permeability Factor (VPF)
bezeichnet (81). Das zuerst entdeckte VEGF wird nunmehr als VEGF-A bezeichnet. Die
Entdeckung und Beschreibung anderer VEGF Proteine folgte im Laufe der Jahre. Neben
VEGF-B (57), VEGF-C (37), VEGF-D (108) reicht die Liste der VEGF-verwandten
Proteine mittlerweile bis VEGF-E, welches im Jahre 1994 entdeckt wurde aber erst im
Jahre 1998 charakterisiert und klassifiziert worden ist (49), (56). Ein weiteres Mitglied der
VEGF Familie ist das Strukturverwandte PlGF (51). Im folgenden soll auf VEGF-A etwas
näher eingegangen werden. VEGF-A ist ein dimeres Glykoprotein. Durch
posttranskriptionelle Modifikationen (splicing) der mRNA kann das VEGF-A Gen mehrere
Isoformen kodieren. Je nach Anzahl der Aminosäuren bezeichnet man die verschiedenen
VEGF-A Isoformen VEGF121, VEGF145, VEGF165, VEGF 183, VEGF189 und VEGF206 (20).
VEGF-A wird in zahlreichen Zellen des Organismus synthetisiert. Zahlreiche Tumorarten
synthetisieren ebenso VEGF-A (21). Reize für die Expression von VEGF-A ist zum einen
die Ischämie (85). Durch erniedrigte Sauerstoffspannung im Gewebe wird über den
hypoxia-inducible factor-1 die VEGF Synthese angeregt (53). Zum anderen tragen
Zytokine wie PDGF-BB, EGF, TNF-α, TGF-β1, Interleukin 1β und zahlreiche Hormone
zur Steigerung der Expression bei.
2.8.2. Die VEGF-Rezeptoren
Die VEGF-Rezeptoren wurden erstmals am Anfang der neunziger Jahre beschrieben (84),
(94). Hierbei handelt es sich um Rezeptor Tyrosinkinasen. Die extrazelluläre Domäne
besteht aus 7 Immunglobulin ähnlichen Domänen, einer einzelnen transmembranösen
Region, einer juxtamembranösen Domäne, einer gespaltenen Tyrosin Kinase Domäne und
einer Carboxy-terminalen Schwanzregion. Die Bindung von VEGF-A an diese Rezeptoren
führt zu Konformationsänderungen in den Rezeptoren, zu deren Dimerisierung und zur
Autophosphorylierung an Tyrosinresten. Hierauf kommt es zu den bereits beschriebenen
VEGF-vermittelten Effekten an den Zielzellen. Die Hauptvertreter der VEGF Rezeptoren
im menschlichen Gefäßendothel sind VEGFR-1 und VEGFR-2 (84), (95). VEGFR-2 wird
15im adulten Organismus auf Angioblasten, auf Endokardzellen und auf Endothelzellen
exprimiert (63), (54). VEGFR-1 wird auf Monozyten und auf Endothelzellen exprimiert
(83). Aktiviert werden beide Rezeptoren u.a. durch VEGF-A. VEGFR-1 hat mit einer
Dissoziationskonstanten von ca. 15 pM die höhere Affinität (15) gegenüber VEGF-A als
VEGFR-2 (ca. 125 pM) (104). VEGFR-2 ist wichtig für die embryonale Entwicklung. Im
Tierexperiment wurde gezeigt, dass eine VEGFR-2 Deletion bei Mäusen zum Absterben
des Embryos führt (82). Die Expression von VEGFR-2 ist abhängig von der
Sauerstoffspannung und steigt bei Hypoxie an (105). VEGFR-2 vermittelt nach
Aktivierung durch VEGF-A oder VEGF-E eine Steigerung der NO-Produktion (39), eine
Steigerung der Proliferation (104) und Migration von Endothelzellen (62) (69), aber auch
eine Steigerung der vaskulären Permeabilität (4). Die Aktivierung der Angiogenese wird
allgemein VEGFR-2 zugeschrieben. Über die Funktion von VEGFR-1 ist weit weniger
bekannt. Zwar sterben VEGFR-1 defiziente Mäuse im Embryonalstadium, allerdings nicht
bei funktionellen Deletionen (33). Bei diesen Tieren ist der Rezeptor auf der
Zelloberfläche vorhanden, die Rezeptor Tyrosinkinase jedoch inaktiv. Ein weiterer
Vertreter der VEGF-Rezeptoren ist VEGFR-3. Dieser Rezeptor ist in lympahtischen
Gefäßen als auch in Tumorgefäßen exprimiert und ist an deren Entstehung beteiligt (41).
2.8.3. Die Wirkungen von VEGF-A in vivo
Die Effekte von VEGF-A im lebenden Organismus sind vielfältig. Einer der Haupteffekte
ist die Aktivierung der Proliferation und Migration von Endothelzellen (104). Zudem
setzen Endothelzellen bei Aktivierung durch VEGF vermehrt NO frei und synthetisieren
vermehrt eNOS, iNOS (40), Plasminogen Aktivator und Kollagenase (60), (98). VEGF-A
zeigte in vielen Versuchen eine angiogene Wirkung auf Kapillaren. Es bewirkt eine
Sprossung von Kapillaren aus bereits bestehenden Gefäßen und die Bildung tubulärer
Strukturen (61), (19). Zudem steigert VEGF-A die Permeabilität von Gefäßwänden (4).
Außerdem steigert VEGF-A die Expression der Adhäsionsmoleküle ICAM-1 und VCAM-
1 auf Endothelzellen (38). Die Applikation von VEGF-A in vivo erzeugt eine leichte
Hypotonie und eine Tachykardie, was auf eine Senkung der Nachlast durch NO vermittelte
Vasodilatation zurückgeführt wird (109), (18). In der Embryogenese konnte durch
zahlreiche Versuche eine entscheidende Rolle von VEGF bei der Entwicklung von
Blutgefäßen nachgewiesen werden (82), (22).
162.9. Ziele der Arbeit
Primäres Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines in vivo Maus-Modells zur
Erforschung des Wachstums arterieller Kollateralgefäße. Es soll dazu dienen, sowohl die
molekularen Mechanismen der Arteriogenese als auch deren pharmakologische
Beeinflussbarkeit zu untersuchen. Charakterisierbar sollten hierbei sowohl das Ausmaß des
Kollateralenwachstums wie auch dessen Einfluss auf die Perfusion sein. Folgende
Anforderungen wurden an das Modell und die damit verbundenen Experimente gestellt:
• Die Induktion einer peripheren Ischämie und die Induktion von Arteriogenese in
einem zuvor definierten Gewebeareal.
• Eine wiederholte systemische Applikation von Testsubstanzen sollte möglich sein.
• Eine nicht-invasive und wiederholbare Messung der Perfusion in der ischämischen
Extremität sollte etabliert und validiert werden.
• Die Größe der Kollateralen sollte evaluiert und mit der Perfusion korreliert werden
können.
• Das die Kollateralgefäße beinhaltende Gewebeareal sollte feingeweblich
analysierbar sein.
• Eine therapeutische Stimulation der Arteriogenese mittels Wachstumsfaktoren
sollte durchgeführt und quantifiziert werden.
173. Material und Methoden
3.1. Reagenzien und Geräte
3.1.1. Reagenzien und Geräte für die Operationen
Operationsbesteck Aeskulap, Deutschland
Operationsmikroskop OP-MI.1 Zeiss, Deutschland
Spiegelreflexkamera Contax 167
Film ILFORD 400 ASA
Spritzen 1 ml Plastipak, Becton Dickinson
Kanülen Microlance 3, 27 GA ¾ 0,4x19, Nr.20
Microlance 3, 30 GA ½ 0,3x13, Nr.1
Microlance 3, 25 GA 1 0,5x25 Nr.18
Herzkatheter Insyte® 24 G, Becton Dickinson
Rasierer Contura®, Wella
Nahtmaterial Prolene® 7-0, Ethicon
NaCl, 0,9 % Fresenius, Deutschland
Ketanest® S, 25 mg/ml Parke-Davis
Rompun® 2% BAYER
Adenosin Fluka Chemie AG, CH-9471
Heparin Heparin-Natrium Braun, B.Braun Melsungen AG
Gelatine, Lebensmittelqualität Merck, Darmstadt, Deutschland
Wismuth Bismuth(III)-nitrat, Merck KgaA, 64271 Darmstadt
3.1.2. Reagenzien und Geräte für die nuklearmedizinische Untersuchungen
Gamma-Kamera Basicam®, Siemens
Bildauswertung-Software ICON Software Packet
MIBI Cardiolite®, Dupont Pharma
183.1.3. Reagenzien für die Behandlung der Versuchsgruppen
PBS Dulbecco`s GIBCO, Invitrogen Corporation, Paisley, United Kingdom
Maus Serum Albumin Sigma , Albumin Mouse LOT 49F93112
VEGF-A ReliaTech, Receptor Liagand Technologies GmbH
Braunschweig, Deutschland
3.2. Die Produktion der Reagenzien und Medien
3.2.1. Das Kontrastmittel
Bei dem für die Gefäßdarstellung verwendeten Kontrastmittel handelte es sich um eine
selbst hergestelltes Lösung. Hierfür wurden 40g Wismuth in 100 ml einer 18% NaCl-
Lösung gelöst. Dieses Gemisch wurde dann in 5 Litern Wasser verrührt. In 12 Stunden
sedimentierten die festen Bestandteile der Lösung, sodass der Überstand abgegossen
werden konnte und das Sediment zurückblieb. Dies wurde nun im Verhältnis 1:1 mit
Gelatine verrührt. Hierfür wurde Gelatine in Pulverform in Wasser bei 45°C unter Rühren
zu einer 40% Gelatinemischung verrührt. Diese Masse wurde bei 4°C gelagert. Vor
Verwendung wurde die Masse in einem Wasserbad bei ca. 40°C verflüssigt. Die Substanz
wurde portioniert und bei 4°C bis zum Verwenden gelagert.
3.2.2. Die Zubereitung der Injektionslösungen
3.2.2.1. Die Injektionslösung für die Kontrollgruppe.
Die Trägersubstanz, welche allen Tieren verabreicht wurde, bestand aus PBS mit 0,1%
Maus Serum Albumin (MSA). Zunächst wurde eine 0,5 % Lösung aus PBS und MSA
angesetzt. Diese wurde bei 4°C gelagert. Vor der Injektion wurde die Lösung mit PBS auf
0,1% verdünnt und 0,9 ml blasenfrei in einer Spritze aufgezogen. Eine Injektion bestand
aus 200 µl Lösung. Das Abfüllen der Injektionslösung geschah unter sterilen Bedingungen.
Die fertig aufgezogene Spritze wurde bis zum Gebrauch bei 4°C gelagert.
193.2.2.2. Die Injektionslösung für die Verum-Gruppe
VEGF-A wurde gelöst in einer Konzentration von 522 ng/µl bei –80°C gelagert. Kurz vor
Gebrauch wurde es aufgetaut und unter sterilen Bedingungen verarbeitet. Als Basis für die
Injektionslösung diente die zuvor beschriebene 0,1% MSA/PBS Lösung. Die pro Injektion
veranschlagte Dosis betrug 500 µg VEGF-A. Pro Spritze wurden 0,9 ml 0,1%MSA PBS
Lösung mit einem VEGF-A Gehalt von 2250 µg hergestellt. Dies reichte für vier
Injektionen zu je 200µl, wobei 20% Verlust eingerechnet waren. Die Spritzen wurden bei
4°C bis zum Gebrauch aufbewahrt.
3.3. Die Versuchsgruppen und deren Behandlungsschemata
3.3.1. Arbeitshypothese
Vor Beginn der Arbeit wurden folgenden Hypothesen formuliert:
• Eine suffiziente, einseitige Unterbindung der A. femoralis ist möglich. Diese ist
nachvollziehbar anatomische an immer derselben Position angelegt. Das Wachstum
der Kollateralen findet an einem zuvor definierten Areal statt.
• Die systemische Applikation von VEGF-A über eine Woche bei Tieren mit einer
durch Ligatur erzeugten Ischämie des Hinterlaufes steigert
1. die nuklearmedizinisch gemessene Perfusion der Extremität nach einer Woche
2. den Durchmesser der Kollateralgefäße
im Vergleich zu einer Behandlung mit Placebo.
Zusätzlich wurden Vorversuche zu dieser Arbeit durchgeführt: In insgesamt vier
Versuchsgruppen wurde die Perfusion einen und vier Tagen nach Ligatur der A- femoralis
bestimmt. Dies diente zur Abschätzung der Kinetik der Reperfusion. Die Ergebnisse dieser
Experimente gingen nicht in die abschließende statistische Auswertung der Versuche ein.
203.3.2. Einteilung der Versuchsgruppen
Die Mäuse wurden willkürlich einer der sechs Gruppen zugeordnet. Hierbei unterschied
sich die Art der Behandlung und der Zeitraum zwischen Ligatur der A. femoralis und der
Perfusionsszintigraphie.
1. Kontrollgruppe mit Endpunkt nach 1 Tag
2. Kontrollgruppe mit Endpunkt nach 4 Tagen
3. Kontrollgruppe mit Endpunkt nach 7 Tagen
4. VEGF-A behandelte Gruppe mit Endpunkt nach 1 Tag
5. VEGF-A behandelte Gruppe mit Endpunkt nach 4 Tagen
6. VEGF-A behandelte Gruppe mit Endpunkt nach 7 Tagen
Die veranschlagte Gruppengröße war n=8 in der sieben Tages Gruppe. Sowohl für die
VEGF-A als auch für die Kontrollgruppe wurden für diesen Beobachtungszeitraum je acht
Tiere einbezogen. Bei den Gruppen, welche über einen und vier Tage beobachten wurden,
handelte es sich um Pilotexperimente. Die Wahl des Endpunktes zu Tag sieben sollte
bestätigt werden. Des weiteren sollte zu Tag eins die Effektivität der Ligatur evaluiert
werden.
3.3.3. Injektionstechnik und Injektionsschema
Die Wachstumsfaktoren wurden in eine der vier Schwanzvenen verabreicht. Hierfür wurde
die Maus in den Injektionsapparat des Tierforschungszentrums eingebracht. Dann wurde
der Schwanz der Maus etwa 30 s lang in handwarmen Wasser aufgewärmt. Nach
Desinfektion der Injektionsstelle mit Alkohol wurde ein Bolus von 0,2 ml in eine der
Schwanzvenen injiziert. Die Substanzen wurden täglich um 8 Uhr und um 18.00 Uhr in die
Schwanzvene verabreicht. Die erste Applikation erfolgte direkt im Anschluss an die
Ligatur der Arterie, die nächste am Abend des selben Tages um 18.00. Danach galt das
oben beschriebene Injektionsschema. Der Beobachtungszeitraum betrug sieben Tage,
wobei der Operationstag als Tag 0 bezeichnet wurde und alle darauf folgenden Tage als
post OP Tage bezeichnet wurden.
213.4. Die Tierexperimente
3.4.1. Der Tierversuchsantrag
Die Versuche fanden mit Genehmigung des Regierungspräsidiums des Landes Baden-
Württemberg gemäß des Tierschutzgesetzes von 1998 statt. Der Tierversuchsantrag mit der
Nummer 666 wurde im Jahre 1999 vom Regierungspräsidium genehmigt.
3.4.2. Die Versuchstiere und deren Haltung
Es wurden 12 Wochen alte Balb/C Mäuse mit einem Körpergewicht zwischen 26 und 30g
verwendet. Sie entstammten der Zucht des Tierforschungszentrums der Universität Ulm.
Die Tiere wurden unter spezifisch pathogenfreien Bedingungen unter Aufsicht des
Tierforschungszentrums Ulm gehalten. Die Mäuse lebten für die Dauer der Experimente in
Fünfergruppen in Typ II (350 cm2) Käfigen in einem strengen 12 Stunden Hell/Dunkel
Rhythmus.
3.4.3. Die Operationen
Die an den Mäusen vollführten Operationen fanden im Eingriffsraum des
Tierforschungszentrum und in den Laboratorien der Inneren Medizin 2 statt. Die hierfür
benötigten Instrumente wurden nach dem für Operationsbesteck üblichen Schema in der
Zentralsterilisation des Klinikums dampfsterilisiert. Hierbei wurde eine alternierende
Über- und Unterdruckinkubation mit einer Mindestzeit von sieben Minuten bei 134°C
Dampftemperatur durchgeführt. Bis zum Gebrauch wurden die Instrumente unter sterilen
Kautelen in Folie verschweisst.
3.4.3.1. Die Narkose
Die Narkose bestand aus einer Kombination von Ketamin und Xylazin. Die Dosis betrug
96 mg/kg des Körpergewichtes Ketamin und 15mg/kg des Köpergewichtes Xylazin. Die
Injektion wurde verdünnt in 0,9% NaCl als Bolus von 270 µl intraperitoneal verabreicht.
Bis zur vollen Entfaltung der Wirkung (etwa nach 5 Minuten) wurden die Tiere in ihren
Käfig gesetzt.
223.4.3.2. Die Operation zur Ligatur der A. femoralis
Nach Eintritt der Anästhesie wurde die Leistengegend an beiden Seiten mit einem
Elektrorasierer rasiert und die Haut mit Alkohol desinfiziert. Die Haut wurde über der
rechten A. femoralis auf einer Länge von 6 mm eröffnet. Die Muskelfaszie über der
Adduktorengruppe wurde eingeschnitten, sodass das femorale Gefäß-, Nervenbündel im
proximalen Oberschenkel freilag. Die A. femoralis mitsamt ihren Begleitstrukturen wurde
mobilisiert und an der Ligaturstelle von perivasalem Fettgewebe befreit. Danach wurde die
A. femoralis zwischen dem Abgang der A. caudalis femoris und dem der A. saphena
atraumatisch von Nerv und Vene freipräpariert. Danach wurde die Arterie mit einem Faden
(Prolene® 7-0, Ethicon) oberhalb der Aufzweigung zu A. saphena und A. poplitea
unterhalb des Abgangs zur A. caudalis femoris ligiert. Distal dieser Ligatur wurde eine
zweite Ligatur gesetzt, um einen sicheren Verschluss des Gefäßes zu gewährleisten . Die
übrigen Strukturen wurden dabei genauestens geschont. Die Wunde wurde mit 0,9%
Kochsalzlösung gespült und danach mit vier Stichen verschlossen (Prolene® 7-0, Ethicon).
Die Maus wurde bis zum Aufwachen überwacht.
3.4.3.3. Die terminale Operation vor Darstellung der Kollateralen
Dieser Eingriff fand am achten postoperativen Tag in unserem Labor in der Medizinischen
Klinik statt. Die Maus wurde wiederum narkotisiert. Nach vollständigem Einsetzen der
Narkose wurde der Thorax und das Abdomen eröffnet. In die Aorta wurde durch den
linken Ventrikel ein Katheter eingebracht. Anschließend wurde 1ml NaCl durch den
Katheter injiziert. Danach wurde die V. cava inferior unterhalb der Nierenvenen inzidiert
und die Maus entblutet. Daraufhin wurden 1ml Heparin Lösung (entspricht 5000 I.E.), 1ml
NaCl und 2 ml Adenosin Lösung verabreicht. Danach wurde durch den selben Katheter das
auf ca. 40°C erwärmte Kontrastmittel verabreicht um das Gefäßsystem darzustellen. Um
das Kontrastmittel abzukühlen, wurde die Maus für ca. eine Minute mit Eis bedeckt. Die
sichtbaren Gefäße konnten nun durch das Operationsmikroskop abgelichtet werden. Eine
10-fache Vergrößerung wurde gewählt. Anschließend wurden die Kollateralen mitsamt der
Muskulatur aus der Adduktorengruppe freipräpariert. Der entnommene Gewebeblock
wurde in einen mit Tissue Tek gefüllten Messingzylinder von ca. 10 mm Durchmesser
eingebracht und auf einer Korkplatte fixiert. Anschließend wurde dieser Aufbau in
flüssigem Stickstoff gefroren und bei –80°C für spätere Untersuchungen aufbewahrt.
233.5. Analyseverfahren zur Messung des Kollateralenwachstums
3.5.1. Die nuklearmedizinische Untersuchung
Die Untersuchung fand je nach Gruppe am ersten, vierten oder siebten postoperativen Tag
statt. Hierfür wurden die Mäuse wiederum narkotisiert. Die Dosis der Narkotika betrug 96
mg/kg Ketamin und 15mg/kg Xylazin. Die Injektionslösung wurde verdünnt in 0,9% NaCl
als Bolus von 270 µl intraperitoneal verabreicht. Bis zum Eintritt der Wirkung (etwa nach
5 Minuten) wurden die Tiere in ihren Käfig gesetzt. Danach wurde der Maus nach
vorsichtiger Desinfektion der Injektionsstelle Technetium 99m-MIBI mit einer Aktivität
von 50 MBq als Bolus von 200 µl in eine der Schwanzvenen verabreicht. Anschließend
wurde die Maus auf dem Bauch liegend auf der Gamma-Kamera platziert. Die Hinterläufe
wurden mit Klebeband fixiert. Besonderes Augenmerk wurde darauf gelegt, die Tiere in
einer standardisierten Position auf der Kamera zu platzieren. Der Abstand zwischen den
Hinterläufen betrug bei allen Tieren von Krallenende zu Krallenende 8cm. Es wurde eine
zehnminütige Szintigraphie durchgeführt. Die Maus wurde bis zum Aufwachen überwacht
und danach wieder in den Käfig gelassen. Die Daten wurden auf dem System ICON mit
dem Programm Region-Ratio dargestellt und ausgewertet. Hierbei wurde je ein
Messbereich (Region of Interest) über die beiden hinteren Extremitäten gelegt. Es wurde
Wert darauf gelegt, dass nur die Extremität im zu bestimmenden Areal liegen (siehe
Abb.2). Das Festlegen der Messbereiche wurde von drei Personen durchgeführt. Erst nach
Konsens über die richtige Position des Messbereiches wurde die Berechnung der Daten
gestartet. Gemessen wurde die Anzahl der Zerfälle in einem Zeitraum von zehn Minuten.
3.5.1.1. Die Auswertung der Perfusionsmessung
3.5.1.1.1. Die Validierung der Methode
Die Methode wurde auf Ihre Validität getestet indem, nicht-operierte, unbehandelte Mäuse
(n=7) szintigraphisch untersucht wurden. Die Mäuse wurden mit UB1 bis UB7
nummeriert. Die Rohdaten wurden von 3 Personen evaluiert, indem die Region of Interest
über die Hinterläufe gelegt wurde. Hierbei konnten die Mäuse von zwei Untersuchern je
zweifach und von einem Untersucher dreifach bestimmt werden. Die Maus UB 5 wurde
nur von zwei Untersuchern evaluiert. Die Messungen geschahen unabhängig voneinander
und ohne Absprache zwischen den Untersuchern. Die Anzahl der Zerfälle über den
24Extremitäten jeder Maus wurden gegeneinander ins Verhältnis gesetzt und nachfolgend
alle dasselbe Tier betreffende Messungen gemittelt. Die hierbei verwendete Formel lautete:
Relative Perfusion= Anzahl der Zerfälle im Bereich des ligierten Beins______
Anzahl der Zerfälle im Bereich des nicht-ligierten Beins
3.5.1.1.2. Die Messung der Perfusion am Tag 1 nach Ligatur bei Tieren der VEGF-A
Gruppe und der Kontrollgruppe
Ein Tag nach Ligatur der A. femoralis wurde bei drei Tieren aus der Kontrollgruppe und
bei zwei Tieren aus der VEGF-A Gruppe die Perfusionsmessung vorgenommen. Die
Messungen wurden von zwei Untersuchern am gleichen Tier insgesamt 4 mal
vorgenommen. Die Anzahl der Zerfälle wurde wiederum ins Verhältnis gesetzt und für
jede Gruppe gemittelt. Hierbei verwendete Formel lautete:
Relative Perfusion= Anzahl der Zerfälle im Bereich des ligierten Beins____
Anzahl der Zerfälle im Bereich des nicht-ligierten Beins
3.5.1.1.3. Die Messung der Perfusion am Tag 4 nach Ligatur bei Tieren der VEGF-A
Gruppe und der Kontrollgruppe
Vier Tage nach Ligatur der A. femoralis wurde eine Perfusionsmessung vorgenommen.
Hierbei waren in der Kontrollgruppe vier Tiere und in der VEGF-A Gruppe sechs Tiere.
Bei der Auswertung der Daten wurde wie in Kapitel 3.5.1.1.2. beschrieben verfahren.
3.5.1.1.4. Die Messung der Perfusion am Tag 7 Tage nach Ligatur bei Tieren der
VEGF-A Gruppe und der Kontrollgruppe
Sieben Tage nach Ligatur der rechten A. femoralis wurde die Perfusion der Hinterläufe
szintigraphische gemessen. Um die interindividuellen Unterschiede zwischen den Tieren
so gering wie möglich zu halten, wurden die Daten beider Hinterläufe ins Verhältnis
gesetzt. Die verwendete Formel lautete:
Relative Perfusion = Anzahl der Zerfälle im Bereich des ligierten Beins
Anzahl der Zerfälle im Bereich des nicht-ligierten Beins
253.5.2. Die statistische Auswertung der Daten der Perfusionsszintigraphie
Die Auswertung der Daten geschah mit freundlicher Unterstützung des Institutes für
Biometrie und medizinische Dokumentation der Universität Ulm. Die Daten jeder Gruppe
wurden zu einem Mittelwert - dem Least Square Mean - verrechnet. Hierbei handelt es sich
um einen Mittelwert, welcher die Auswirkungen von Extremwerte (sog. Ausreissern)
reduziert. Zudem wurden die 95% Konfidenzintervalle für jede Gruppe errechnet. Die
Least Square Means der einzelnen Gruppen wurden mit einem ANOVA Test
gegeneinander verglichen. Die Signifikanzniveaus des Vergleichs wurden adjustiert, d.h.
der Menge der verglichenen Einzelwerte der in den Versuchsgruppen angepasst. Dabei
wird das errechnete Signifikanzniveau mit der Anzahl der Tiere in der größeren
Versuchsgruppe multipliziert. Dies erhöht das Signifikanzniveau, ergibt aber eine höhere
Plausibilität der Ergebnisse.
3.5.3. Die morphologische Evaluation der Kollateralgefäße
In diese Untersuchung wurden Tiere aus der Kontrollgruppe und aus der VEGF-A Gruppe
eingeschlossen, welche über 7 Tage beobachtet worden waren und an denen eine
Perfusionsmessung vorgenommen worden war. Direkt nach Darstellung der Gefäße mit
Wismuth Kontrastmittel, wurden die Gefäße mit der im OP Mikroskop angebrachten
Kamera fotografiert. Zuvor wurden die Bezeichnungen der Tiere unkenntlich gemacht. Die
Auflichtfotografien wurden auf 18 x 13 cm großen Abzügen den Untersuchern vorgelegt.
Fünf Mitarbeiter unserer Gruppe beurteilten die Kollateralen nach einem Collateral Score.
Der Collateral Score beinhaltete folgenden Kriterien:
1) Präformierte Kollaterale, jedoch noch kein Wachstum (1 Punkt)
2) Geringes Wachstum im Durchmesser, jedoch nicht in der Länge (2 Punkte)
3) Geringes Wachstum im Durchmesser und in der Länge (3 Punkte)
4) Mittleres Wachstum im Durchmesser und in der Länge (4 Punkte)
5) Stark ausgeprägtes Wachstum im Durchmesser und in der Länge (5Punkte)
6) Die Kollaterale entspricht in ihrer Ausprägung der Zielarterie (6 Punkte)
263.5.3.1. Verarbeitung der Daten aus dem Collateral Score.
Entsprechend der Beurteilung wurde für jede Ausprägung die entsprechende Anzahl an
Punkten ermittelt. Die Ergebnisse der Beurteilung durch die einzelnen Messpersonen
wurden gemittelt. Die Gesamtergebnisse wurden gegeneinander aufgetragen. Eine
vergleichende Statistik wurde aufgrund des semiquantitativen Ansatzes nicht durchgeführt.
274. Ergebnisse
4.1. Die Operation zur Ligatur der A. femoralis führt zu einer
reproduzierbaren Ischämie des Hinterlaufes der Maus
Nach der Ligatur der rechten A. femoralis kam es zu einem transienten Erblassen der
Extremität. Die Funktion des Fußes war nach Erwachen aus der Narkose im Sinne einer
leichten Parese eingeschränkt. Das Tier zeigte nach Erwachen aus der Narkose keine
Anzeichen für Schmerz und verhielt sich abgesehen vom motorischen Defizit normal. Es
kam zu keiner Veränderung des Ernährungszustandes oder des Sozialverhaltens, was einen
Hinweis auf eine andauernde Beeinträchtigung wie Schmerz oder Missempfindung hätte
geben könnte. Während der Beobachtungszeit kam es nicht zu Nekrosen bzw.
Amputationen der Extremitäten. Obwohl der Operationssitus klein war, konnte nach
Auswerten der Fotographien gezeigt werden, dass die Ligatur anatomisch immer an der
selben Position lag (siehe Abb. 6, 7, und 8). Das Wachstum der Kollateralen fand bei
jedem Tier an der medialen Femurseite im Bereich der Mm. adductores statt (siehe Abb. 6,
7 und 8).
284.2. Die Perfusions - Szintigraphie
4.2.1. Evaluierung der szintigraphischen Messung
Die Evaluierung der Szintigraphie zeigte, dass bei nicht operierten, unbehandelten Tieren
die relative Perfusion 0,98 +/-0,11 betrug. Hierbei wurden die aufgezeichneten Daten von
drei Untersuchern bestimmt.
Kontrolle VEGF-A
Abbildung 2: Szintigraphische Aufnahme einer Maus aus der Kontrollgruppe (links) und einer Maus
aus der VEGF-A Gruppe (rechts) sieben Tage nach Ligatur der rechten A. femoralis dextra. Die
Messbereiche umfassen die hinteren Extremitäten und sind blau dargestellt. Die rechte Seite der Maus
projeziert in diesen Aufnahmen nach oben.
29Tabelle 1: Darstellung der Messergebnisse der Evaluation der szintigraphischen
Perfusionsmessung bei unbehandelten Tieren.
Anzahl der Anzahl der Anzahl der
Maus Untersucher radioaktiven radioaktiven radioaktiven
Zerfälle Zerfälle Zerfälle
Messung 1 Messung 2 Messung 3
Mittelwert
Quotient aus Quotient aus Quotient aus
Links Rechts links rechts links rechts aller 3
links/rechts links/rechts links/rechts
Messungen
UB 1 1 6239 5969 0,956 7810 5760 0,737 0,847
2 7170 6620 0,923 7475 6460 0,864 0,893
3 8316 8738 1,050 8050 8520 1,058 8018 8681 1,082 1,063
UB 2 1 1314 1592 1,21 1409 1428 1,013 1,112
2 1754 1681 0,958 1521 1492 0,980 0,969
3 4204 2433 0,578 3642 2514 0,690 4055 2639 0,650 0,639
UB 3 1 4883 4737 0,970 5412 4399 0,812 0,891
2 6024 5298 0,879 5823 5933 1,018 0,949
3 7348 6080 0,827 7498 6394 0,852 7231 6394 0,884 0,854
UB 4 1 4951 6316 1,275 5143 6203 1,206 1,240
2 5943 6397 1,076 5152 6038 1,171 1,124
3 6720 8314 1,237 7025 8203 1,167 6882 8260 1,200 1,201
UB 5 1 1726 2071 1,199 2209 2044 0,925 1,06
2 1856 1910 1,029 1998 1895 0,948 0,988
3
UB 6 1 10556 11596 1,098 10690 11272 1,054 1,076
2 10754 12443 1,157 12032 11329 0,941 1,049
3 12587 14787 1,174 14903 16605 1,114 14101 15563 1,103 1,130
UB 7 1 5780 5524 0,955 6441 5561 0,863 0,909
2 6358 6323 0,994 6005 5640 0,939 0,966
3 7997 7215 0,902 8126 7072 0,870 7688 7038 0,915 0,895
Mittelwert 0,98
30Erläuterungen zu Tabelle 1: Sieben Tiere wurden ohne jegliche Behandlung der
szintigraphischen Perfusionsmessung unterzogen. Drei Untersucher nahmen mehrere
Messungen vor (Untersucher 1und 2 je 3, Untersucher 3 je 2 Messungen). Nach jeder
Messung ist die relative Perfusion aufgetragen. Ganz rechts das Ergebnis aller Messungen
einer Messperson.
1,3
1,2
1,1
Relative Perfusion
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
UB 1 UB 2 UB 3 UB 4 UB 5 UB 6 UB 7
Maus
Abbildung 3: Perfusionsmessung unbehandelter Tiere. Diese Messung diente der Evaluation der
Methode. Sieben Tiere wurden einer szintigraphischen Perfusionsmessung unterzogen. Die Ordinate
zeigt die relative Perfusion als Verhältnis der Messwerte von ligierter zu nicht-ligierter Extremität
(Einzeldaten siehe Tabelle 1). Die Abszisse zeigt die einzelnen Tiere, bezeichnet als UB1-UB7. Die
Mittelwerte aller Messungen der drei Untersucher wurden als waagerechte Balken dargestellt. Die
senkrechte Linie beschreibt die Standardabweichung.
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