SARS-COV-2 IM ABWASSER ALS GRADMESSER DER INFEKTIONSVERBREITUNG - AQUA URBANICA 2021 13.9.2021 - INNSBRUCK - TU GRAZ
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SARS-CoV-2 im Abwasser
als Gradmesser der Infektionsverbreitung
Aqua Urbanica 2021
13.9.2021 - Innsbruck
Norbert Kreuzinger
norbkreu@iwag.tuwien.ac.at
Technische Universität Wien
Institut für Wassergüte und Abfallwirtschaft
Die Idee
• Abwasser als „Spiegel“ der Gesellschaft
• Abwasser integriert alle Ausscheider und
Virusvarianten im Kanaleinzugsgebiet
• Inzidenzen
– Problematik 7/14t Inzidenzen
– Zuordnung zu Hauptwohnsitz
– Abhängig von „Testmoral“ (ungeimpft & geimpft)
• Erhaltene Daten unabhängig von der
Teststrategie
• Ansatz sensitiv (~ 1 aus 10.000)
• Zahlen bilanzierbar
• Zahlreiche Einflussfaktoren
– Siehe später
Aqua Urbanica 2021 - Kreuzinger - Innsbruck 13.9.2021
Die Herausforderung
• Über den gesamten Weg von Ausscheidung
bis hin zum Messsignal zahlreiche potentielle
methodische „Probleme“:
– Ausscheidungsseitig
– Abwasseranfall (zB. Wasserverbrauch, Fremdwasser)
– Verhalten im Kanal (zB. „Abbau“)
– Probenahme (volumenproportional vrs. zeitproportional)
– Probenlagerung (zB. T; Dauer Teilprobe bis Analytik)
– Untersuchte Matrix (fest / flüssig)
– Probenaufbereitung (Methode; Ausbeute)
– RNA Extraktion (Methode; Ausbeute)
– qPCR (zB. verwendete Primer; Inhibitoren; Standards)
• Viele dieser Punkte durch QM „beherrschbar“
• (+/- konstanter) methodischer Fehler bleibt
• Vergleichbarkeit Daten
– Selbe Probe, unterschiedliche Labore
– Unterschiedliche Proben, selbes Labor
Aqua Urbanica 2021 - Kreuzinger - Innsbruck 13.9.2021
Ausscheider und -mengen
• Wann werden im Krankheitsverlauf welche
Viren-Mengen ausgeschieden?
• Wann beginnt; wann endet Ausscheidung?
• Wie unterscheidet sich das
Ausscheideverhalten bei unterschiedlichen
Patienten?
• Wie hängt Ausscheidung mit der Schwere
der Erkrankung zusammen?
• Wie unterscheidet sich das
Ausscheideverhalten bei unterschiedlichen
Virus-Varianten?
• Zentrale Fragen für Bewertung der Aussage
aus Ergebnissen
Wölfel, R., Corman, V.M., Guggemos, W. et al. Virological assessment of hospitalized patients with COVID-2019
Nature 581, 465–469 (2020) https://doi.org/10.1038/s41586-020-2196-x
Aqua Urbanica 2021 - Kreuzinger - Innsbruck 13.9.2021
Ausscheider und -mengen
22
8.2.21 - Öffnung 5.3.21 - >98% Alpha im Abwasser
Phase 1 (8.4.20 - 20.9.20)
Phase 2 (21.9..20 - 20.10.20)
Phase 3 (21.10..20 - 7.12.20)
Phase 4 (8.12.20 - 7.2.21)
Genkopien Abwasser pro Erkranktem
Phase 5 (8.2.21 - 31.4.21) 20
Phase 6 (1.4.21 - 31.5.21) 26.12.20 - Lockdown 3 1.4.21 - Lockdown Ost
1011
(absolute 14 - Tagesinzidenz)
Phase 7 (1.6.21 - Gegenwart)
Abwassertemperatur (°C)
20.10.20 - B.1.160 verliert Dominanz
17.11.20 - Lockdown 2
7.12.20 - Öffnung Handel
ab 8.12.20 - Alpha im Abwasser 18
10.8.2021
11.7.21- >98% Delta im Abwasser
ab 30.5.21- Delta im Abwasser
3.5.21 - Öffnung Ost 16
Mitte Juli 20 - neue PCR 19.5.21 - Öffnung
1010 27.6.21 - niedrigste 7 Tagesinzidenz 21.9.20 - Sperrstunde / Masken neu
14
12
109
10
10 100 1000
10 100 1000
14-Tage-Inzidenz (#/100.000)
14-Tage-Inzidenz (#/100.000)
Aqua Urbanica 2021 - Kreuzinger - Innsbruck 13.9.2021 Unpublished own data
Analytik - workflow
• Probenahme
Lagerung 4°C
– mengenproportionale Tagesmischprobe
Probenahme Abwasserprobe
– “Routineprobe” auf Kläranlage
• Probenaufbereitung - PEG – Zentrifugation
– Zeitintensiv (Summe ~ 4h)
Probenauf bereitung – 1,5h bei 12.000g
„PEG“
• RNA Extraktion
Lagerung -20°C – Int Standard für Extraktionskontrolle
• RT qPCR Amplifikation
Auflösen Pellet in RNA-Extraktionspuffer – Analog Humantestung
– Quantifizierung mit Standard
Transfer in Eppendorf-Tube Lagerung
• Quantifizierung
RNA Extraktion
• Data Processing
– Umrechnung auf [ # Genom / mL]
RT qPCR
– Normierung um „klassische“ Abwasserparameter
Aqua Urbanica 2021 - Kreuzinger - Innsbruck 13.9.2021
Analytik
• Eingesetzte Methoden
abhängig von Fragestellung
– Konventionelle Quantifizierung
– RT qPCR
– Verschiedene Targets und Systeme
• Variantenanalyse
– ddPCR
– Schmelzkurvenanalysen
• Sequenzierung
– „Targetanalysen“ – Variants of Concearn
– „nontarget“ – HG Sequenzanalysen
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Analytik
Check PCR Primersystem mittels Sequenzierung aus Abwasserproben
• Eingesetzte Methoden
abhängig von Fragestellung
Primer-/Sondenset A Primer-/Sondenset B
– Konventionelle Quantifizierung
– RT qPCR
– Verschiedene Targets und Systeme
• Variantenanalyse
– ddPCR
– Schmelzkurvenanalysen
• Sequenzierung
– „Targetanalysen“ – Variants of Concearn
– „nontarget“ – HG Sequenzanalysen
Aqua Urbanica 2021 - Kreuzinger - Innsbruck 13.9.2021
Bezugsgrößen Messignal
• Rohsignal aus qPCR in GC#/mL
• Idente Thematik zu konventionellen
Parametern (C/N/P)
– Abhängig vom Kanalystem
– Verdünnung durch Mischwasserereignisse
– Abhängigkeit vom Wasserverbrauch im EZG
• Fracht vrs. Konzentration
• „Normierung“ auf Bezugsgrößen
– routinemäßige abwasserchemische Parameter
zB. CSB / TN / NH4 (Indirekteinleiter!)
– chemische Anthropogenmarker
zB. Cotinin (Abbauprodukt Nikotin); Koffein
– mikrobielle humane Fäkalmarker
zB. PMMoV (Pepper mild mottle virus);
CrAssphage (cross-assembly phage)
Aqua Urbanica 2021 - Kreuzinger - Innsbruck 13.9.2021
Beispiele Ergebnisse konventionelle qPCR
600
Aktiv erkrankt geschaetzt / 100.000 EW
500
1000
400
#/ml (Rohdaten!)
100
300
200
10
100
0 1
.
.
.
.
.
2
3
3
4
4
5
.0
.0
.0
.0
.0
.0
3
8
2
5
9
3
.-2
.-0
.-2
.-0
.-1
.-0
02
03
03
03
04
04
7.
2.
6.
0.
3.
7.
:1
:0
:1
:3
:1
:2
0
0
0
0
0
0
/2
/2
/2
/2
/2
/2
08
10
12
14
16
18
KW
KW
KW
KW
KW
KW
áktiv Erkrankte im Kanaleinzugsgebiet der ARA / 100.000 EW
Zulauf Kläranlage
Kanal - Region
Kanal - Gebiet regionaler Lockdown
Aqua Urbanica 2021 - Kreuzinger - Innsbruck 13.9.2021 Unpublished own dataBeispiele Ergebnisse Sequenzierung
Aqua Urbanica 2021 - Kreuzinger - Innsbruck 13.9.2021 Unpublished own dataBeispiele Ergebnisse Sequenzierung
1,6x1014
100%
1,4x1014
Virenfracht (Genkopien pro Tag)
1,2x1014
1014
8,0x1013
6,0x1013
4,0x1013 100%
93%
2,0x1013
70% 80% 80% 89%
4% 7% 43%
.
.
.
5.
6.
6.
6.
7.
7.
7.
.6
.7
.8
0.
3.
0.
7.
1.
5.
5.
-6
-4
-1
-3
-1
-2
-2
-1
-1
-2
23
27
31
22
24
25
26
28
29
30
KW
KW
KW
KW
KW
KW
KW
KW
KW
KW
Gesamtvirenfracht im Zulauf der Kläranlage
LSK (4000) - Fracht MW (Anteil L452R & N501N)
RHSK (3000) - Fracht MW (Anteil L452R & N501N)
LHSK (2000) - Fracht MW (Anteil L452R & N501N)
LDS (1000) - Fracht MW (Anteil L452R & N501N)
Aqua Urbanica 2021 - Kreuzinger - Innsbruck 13.9.2021 Unpublished own dataUntersuchung Kanal-Teileinzugsgebiete
• Ziele
– Identifikation von „hot spots“
– „Clustertracing“ in Situation niedriger Prävalenz / Inzidenz
– Überprüfung „sensibler“ Bereiche bzw. interessierender Punkte
– Für WT und einzelne Varianten
• Beispiel Wien
– Beprobungen
• Iteration 0
– 1x pro Woche seit August 2020
– Endpunkte 4 Hauptsammler
• Iteration 1
– 1 x pro Woche seit Februar 2021
– 9-22 Teileinzugsgebiete („Iteration1“)
– 1x pro Woche seit August 2020
• Iteration 2-x
– Mit Gesundheitsbehörde abgestimmte Detailuntersuchungen
– Analytik
• RT qPCR
• „Mutantenscreening“
• Ganzgenomsequenzierung
Aqua Urbanica 2021 - Kreuzinger - Innsbruck 13.9.2021Untersuchung Kanal-Teileinzugsgebiete
• Beispiel Hot-Spot Identification mit qPCR
T 21
# / ml roh
1 800
1 600
P 109 L 133 1 400
1 200
1 000
800
600
400
200
-
HKA Zu I5 I 19 L 133 P 109 T 21
I5
I 19
# / mg TN
45 000
40 000
35 000
30 000
25 000
L 133 20 000
ohne T 21 15 000
10 000
5 000
-
HKA Zu I5 I 19 L 133 P 109 T 21
I 19
Verdachtsflächen 500m
Aqua Urbanica 2021 - Kreuzinger - Innsbruck 13.9.2021Untersuchung Kanal-Teileinzugsgebiete
• Beispiel Hot-Spot • Mittlerweile weitergehende Auswertungen
• Frachtbetrachtungen zur Bilanzierung eines
(Teil-) Einzugsgebiets
– Validierung / Plausibiliserung Messwerte /
Berechnung Bilanzfehler für N & CoV
– Identifikation Anteil Abwasseranfall und Anteil
Virenmenge im (Teil-)EZG bezogen zur
Systemgrenze (Zulauf Kläranlage oder
– Berechnung eines Faktors (FV/A):
Anteil Virenfracht im (Teil-)EZG / Anteil Abwasseranfall
Bezugsgröße = Systemgrenze
• Faktor > 1: Mehr Virenanfall im EZG als im Mittel
innerhalb der Systemgrenzen
• Faktor = 1: Virenanfall im System entspricht mittlerem
Anfall im System
• Faktor < 1: Weniger Virenanfall im EZG als im Mittel
innerhalb der Systemgrenzen
Aqua Urbanica 2021 - Kreuzinger - Innsbruck 13.9.2021Beispiel Datennutzung
• Beispiele Darstellung Kanalinfo Bereich Auswahl Kanal-Information
bei Gesundheitsbehörde – E484K positiv
– E484K positiv und N417 negativ
– K417N positiv
– …
Bereich Elemente für die Visualisierung
– Kontakte (Datenpunkte der Oberfläche)
– Entnahmestellen
– Kanalsystem
– Straßennetz
Datum für Kanalinfo
Datum für Oberflächeninfo
Auswahl Info Oberfläche
Bewußte „nonsense“ Darstellung … Legende für Farbcodierung
Bereich Datendarstellung
Aqua Urbanica 2021 - Kreuzinger - Innsbruck 13.9.2021Zusammenfassung Erfahrungen
• Trotz zahlreicher methodischer • Auch Mutanten / Varianten gut nachweisbar
Einschränkungen funktioniert das und quantifizierbar
Abwassermonitoring sehr gut • Einstellung der Gesundheitsbehörden
• Zentraler Vorteil ist Unabhängigkeit von – ambivalent von extrem angetan bis „reserviert“
Teststrategie an der Oberfläche und = Funktion einer gemeinsamen Diskussion
Darstellung einer „realen“ Situation – rasche Info und Bereitstellung neuer Informationen
hilft für Akzeptanz
• Zunahme / Abnahme Signal im Abwasser
• Anfängliche Aufregung (zB. Auftreten B.1.1.7)
zwischen 4 und 10 Tagen vor Signaländerung an
zum Thema hat sich gelegt.
der Oberfläche
• Detailbeschäftigung mit Abwassersignalen
• Potential und Aussagekraft unter den jetzigen
offenbart Problematik der Oberflächendaten
pandemischen Bedingungen und im Herbst
(Datenhandling; Zahlen; Auswertungen, …)
besonders hoch
• Abwasserreinigung hat nachhaltig eine
• Auch mit Untersuchungen 1x pro Woche
zusätzliche Bedeutung erlangt
zahlreiche Aussagen möglich, wenn Info rasch
verfügbar.
Aqua Urbanica 2021 - Kreuzinger - Innsbruck 13.9.2021Zusammenfassung Erfahrungen
• Probleme • Mut zu methodischen Unzulänglichkeiten und
– Oberflächendaten werden als „richtig“ postuliert pragmatischer Ansatz gefordert
– Zuordnung von Infektionsfällen (zu • Fragestellungen, Themen und Inhalte haben
Hauptwohnsitz) ist nicht notwendiger Weise sich in den Monaten deutlich erweitert
ident mit Ort der Ausscheidung – Beginn
– Die „offiziellen“ Prävalenzen (Erkrankte pro • #/mL im zeitlichen Verlauf
100.000) führen bei kleinen Anlagen zu massiven • Frühwarnfunktion
Sprüngen in Zahlen (Oberfläche und Abwasser)
– Heute zusätzlich
– Nicht linearer Zusammenhang zwischen Kopien • Verständnis der Pandemieentwicklung
im Abwasser und Anzahl der Ausscheider
• Überprüfung epidemiologischer Kenndaten
– „gelöst / gesamt“ Thematik • Varianten und Mutationen
– Länge/Aufenthaltsdauer Kanal und Verhalten im • POI Monitoring und Detailfragestellungen
Kanal haben deutlichen Einfluss auf Signal • Überwachung Maßnahmen
– Beprobung kleinerer Anlagen
(wird Signal erwischt?)
Aqua Urbanica 2021 - Kreuzinger - Innsbruck 13.9.2021Danke für die Aufmerksamkeit
und ..
• Den Finanzgebern für die finanzielle Unterstützung
• Dem Coron-A Team für die Zusammenarbeit
• Den beteiligten Anlagenbetreibern für die Unterstützung!
• Meinem Team für die immense Laborarbeit
Norbert Kreuzinger – TU Wien
Technische Universität Wien
Institute for Water Quality and Ressources Management
Karlsplatz 13/ 226-1
1040 Vienna - Austria
norbkreu@iwag.tuwien.ac.at
Aqua Urbanica 2021 - Kreuzinger - Innsbruck 13.9.2021Sie können auch lesen
