Die Wirkung von Propionat auf die Laurat-vermittelte Exazerbation der Neuroinflammation - OPUS 4
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Die Wirkung von Propionat auf die Laurat-vermittelte Exazerbation
der Neuroinflammation
Neuroimmunologie / Neurologische Klinik
Der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades Dr. med.
vorgelegt von
Jonas Mathias Mäurer
Als Dissertation genehmigt von der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. med. Markus Neurath
Gutachter: PD Dr. De-Hyung Lee
Gutachter: Prof. Dr. Ralf Linker
Tag der mündlichen Prüfung: 16. November 2021
Inhaltsverzeichnis
1 Summary ...................................................................................................................................................... 1
1.1 Background ........................................................................................................................................... 1
1.2 Methods .................................................................................................................................................. 1
1.3 Results..................................................................................................................................................... 1
1.4 Conclusion ............................................................................................................................................. 2
2 Zusammenfassung ................................................................................................................................... 3
2.1 Hintergrund und Ziele...................................................................................................................... 3
2.2 Methoden ............................................................................................................................................... 3
2.3 Ergebnisse ............................................................................................................................................. 3
2.4 Schlussfolgerungen ........................................................................................................................... 4
3 Einleitung ..................................................................................................................................................... 5
3.1 Multiple Sklerose - Epidemiologie und klinische Aspekte ............................................... 5
3.2 Ätiologie und Pathogenese der Multiplen Sklerose ............................................................ 5
3.3 Modell der Experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis .................................... 7
3.4 Die Bedeutung der „Westlichen Diät“ ....................................................................................... 7
3.5 Zielsetzung der Arbeit ....................................................................................................................10
4 Materialien und Methoden .................................................................................................................11
4.1 Materialien ..........................................................................................................................................11
4.1.1 Antikörper für die Immunhistochemie .....................................................................11
4.1.2 Sekundär Antikörper .........................................................................................................11
4.1.3 Biologische Reagenzien ....................................................................................................12
4.1.4 Chemikalien ...........................................................................................................................12
4.1.5 Kits.............................................................................................................................................13
4.1.6 Versuchstiere ........................................................................................................................13
4.1.7 Verbrauchsmaterial ...........................................................................................................13
4.1.8 Instrumente und Software ..............................................................................................14
4.1.8.1 Instrumente ......................................................................................................................14
4.1.8.2 Software .............................................................................................................................15
4.2 Methoden .............................................................................................................................................16
4.2.1 Versuchstiere ........................................................................................................................16
4.2.2 Induktion und Analyse der EAE ....................................................................................16
4.2.3 Tierexperimente ..................................................................................................................18
4.2.4 Perfusion und Gewebepräparation .............................................................................18
4.2.5 Histologische Methoden...................................................................................................19
4.2.5.1 Immunhistochemische Färbungen .........................................................................20
4.2.5.2 Standardprotokoll der Immunhistochemie ........................................................21
4.2.5.3 Klüver PAS/ Luxol Fast Blue-Färbung ..................................................................22
4.2.5.4 Silberfärbung nach Bielschowsky ...........................................................................23
4.2.5.5 Nisslfärbung mit Kresylviolett .................................................................................24
4.2.5.6 Mikroskopie und Datenanalyse ...............................................................................24
4.2.6 Statistik und Darstellung der Daten............................................................................26
5 Ergebnisse .................................................................................................................................................27
5.1 Auswirkungen einer Diät reich an langkettigen Fettsäuren auf den Verlauf der
EAE 27
5.1.1 Auswirkungen einer Diät reich an langkettigen Fettsäuren auf die ZNS-
Inflammation ............................................................................................................................................28
5.1.2 Auswirkungen einer Diät reich an langkettigen Fettsäuren auf ZNS
residente Zellen .......................................................................................................................................33
5.2 Auswirkungen einer zusätzlichen Propionat-Gabe auf den EAE-Verlauf unter
einer Diät reich an langkettigen Fettsäuren ....................................................................................42
5.2.1 Auswirkungen einer zusätzlichen Propionat-Gabe auf die ZNS-
Inflammation unter einer Diät reich an langkettigen Fettsäuren .....................................43
5.2.2 Auswirkungen einer zusätzlichen Propionat-Gabe auf ZNS residente Zellen
unter einer Diät reich an langkettigen Fettsäuren ...................................................................47
6 Diskussion..................................................................................................................................................54
6.1 Einleitung ............................................................................................................................................54
6.2 Effekte von langkettigen Fettsäuren ........................................................................................55
6.3 Effekte von kurzkettigen Fettsäuren .......................................................................................56
6.4 Translation zur Multiplen Sklerose ..........................................................................................57
7 Literaturverzeichnis ..............................................................................................................................59
8 Appendix ....................................................................................................................................................65
Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................................................65
8.1 Abbildungsverzeichnis ..................................................................................................................67
8.2 Tabellenverzeichnis ........................................................................................................................68
1 Summary
1.1 Background
Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous
system (CNS). While the cause of MS is not known, environmental factors and
genetic disposition are considered to increase the risk of acquiring the disease.
Previous studies have shown that a 'western diet', rich in salt and saturated long
chain fatty acids (LCFA) enhances the pro-inflammatory immune responses in
experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). The LCFA lauric acid (LA) leads
to an enhanced differentiation and proliferation of TH1/TH17 cells and worsened
clinical course of EAE. In contrast, the short chain fatty acid propionate (PA)
ameliorated EAE, via an increased Treg differentiation in the gut. This study
investigated the harmful effects of LA and the potential therapeutic effects of PA on
the course of EAE during feeding a LA rich diet.
1.2 Methods
MOG-EAE was induced in C57BL/6 mice fed a normal diet (ND) or LA-rich diet
starting four weeks before immunization. In another experiment LA-fed mice received
additionally PA or water as a control via oral gavage starting at the day of
immunization.
Mice were clinically evaluated; spinal cord cross sections were stereologically
analyzed after staining for demyelination (Luxol Fast Blue), infiltrating immune cells
(CD3, Mac3), glial cells (GFAP, Olig2, NogoA), neurons (Kresyl-Violett) and axons
(Bielschowsky silver staining) at the maximum and the long-term course of disease.
1.3 Results
Mice fed a LA-diet showed a more severe EAE course compared to ND-fed mice.
The deleterious clinical effect of LA diet was reversed by oral gavage of PA after
immunization. The clinical effect was paralleled by a significantly reduced T cell
infiltration and reduced number of macrophages in the spinal cord at the maximum of
1
EAE. In addition, PA treated mice showed less pronounced demyelination, reduced
axonal loss, and diminished astrogliosis.
1.4 Conclusion
In conclusion propionate treatment reverts the deleterious effect of a LA diet.
Therefore, a propionate therapy may serve as a safe and effective immune-
regulatory add-on therapy in multiple sclerosis.
2
2 Zusammenfassung
2.1 Hintergrund und Ziele
Die Multiple Sklerose (MS) ist eine chronisch-entzündliche Erkrankung des zentralen
Nervensystems (ZNS). Die Ursache der MS ist bislang nicht bekannt. Es wird ein
Zusammenspiel aus genetischer Prädisposition und Umwelteinflüssen vermutet.
Vorausgegangene Untersuchungen kamen zu dem Ergebnis, dass die fett- und
salzreiche westliche Diät die autoimmune Reaktion der Experimentellen
autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) verstärkt. Die langkettige Fettsäure Laurat
(LA) verschlechtert über eine Zunahme von TH1/TH17 Zellen den klinischen Verlauf
der EAE. Im Gegensatz dazu hat die kurzkettige Fettsäure Propionat (PA) über eine
verstärkte Differenzierung regulatorischer T-Zellen im Magen-Darm-Trakt einen
günstigen Einfluss auf den EAE-Krankheitsverlauf. Gegenstand dieser Arbeit, war es
die schädlichen Effekte von LA und den potentiellen therapeutischen Effekt von PA
unter einer LA-reichen Diät auf den EAE-Verlauf zu untersuchen.
2.2 Methoden
Vier Wochen vor Induktion der MOG-EAE wurden C57BL/6 Mäuse mit einer
normalen oder einer LA-reichen Diät gefüttert. In einem weiteren Versuch wurde mit
Beginn der EAE-Induktion, Versuchstieren unter eine LA-reichen Diät zusätzlich PA
oder Wasser zur Kontrolle oral verabreicht.
Die Versuchstiere wurden klinisch beurteilt und das Rückenmark histologisch
untersucht. Hierfür dienten Färbungen zur Erfassung der Demyelinsierung (Luxol
Fast Blue), Immunzellen (CD3, Mac3), Gliazellen (GFAP, Olig2, NogoA), Neurone
(Kresyl-Violett) und Axone (Silberfärbung nach Bielschowsky).
2.3 Ergebnisse
Die LA-reiche Diät führte im Vergleich zur Normaldiät zu einem schweren EAE-
Krankheitsverlauf. Der schädliche Effekt einer LA-reichen Diät konnte durch die
zusätzliche orale PA-Gabe verringert werden. Dementsprechend zeigte sich am
Maximum der Erkrankung eine verminderte Infiltration von T-Zellen und
3
Makrophagen innerhalb des Rückenmarks. Des Weiteren zeigten PA-behandelte
Versuchstiere einen geringen Grad der Demyelinisierung, einen reduzierten
Axonverlust und eine verminderte Astrogliose.
2.4 Schlussfolgerungen
Die orale Gabe von PA konnte somit den schädlichen Effekt einer LA-reichen Diät
verringern. PA könnte daher als sichere und effektive immunmodulatorische Add-on
Therapie der MS dienen.
4
3 Einleitung
3.1 Multiple Sklerose - Epidemiologie und klinische Aspekte
Die Multiple Sklerose (MS) ist eine chronisch-entzündliche Erkrankung des zentralen
Nervensystems (ZNS), die vor allem bei jungen Erwachsenen auftritt und zu
erheblichen körperlichen und kognitiven Einschränkungen führen kann (Compston
und Coles, 2008). In Deutschland sind nach neueren Erhebungen wahrscheinlich
mehr als 200.000 Menschen von der Erkrankung betroffen (Petersen et al., 2014).
Die MS tritt meist zwischen dem 20. und 40. Lebensjahr erstmalig auf und führt durch
eine autoimmune Entzündung im ZNS zu neurologischen Ausfällen (Mattle, 2005).
Da die Entzündung prinzipiell überall im ZNS auftreten kann, ist das Krankheitsbild
der MS sehr vielgestaltig (Nylander und Hafler, 2012). Die Betroffenen klagen u.a.
über Sensibilitätsstörungen, Lähmungen, Sehstörungen und Koordinationsstörungen
(Jadidi-Niaragh und Mirshafiey, 2011).
Bei den meisten Patienten (> 85%) verläuft die Erkrankung zu Beginn schubförmig.
Die Schubsymptome bilden sich v.a. in den frühen Erkrankungsphasen häufig noch
vollständig zurück. Man bezeichnet dieses Stadium daher auch als schubförmig
remittierenden Verlauf (RRMS). Die RRMS kann im weiteren Verlauf – v.a. bei
unzureichender Behandlung – in einen sekundär-chronisch progredienten Verlauf
(SPMS) übergehen. Diese Phase ist durch eine progrediente Verschlechterung der
Symptome mit zunehmender Behinderung charakterisiert. Schübe können zwar noch
vorkommen, stehen aber eher im Hintergrund (Compston und Coles, 2008).
Von dieser schubförmig beginnenden Erkrankung kann die sogenannte primär
chronisch progrediente Verlaufsform der MS (PPMS) abgegrenzt werden, die ca. 10
– 15% der Patienten betrifft. Hier ist die Erkrankung von Beginn an durch eine
progrediente Symptomverschlechterung gekennzeichnet (Lublin et al., 2014).
3.2 Ätiologie und Pathogenese der Multiplen Sklerose
Die genaue Ursache der MS ist trotz intensiver Forschung nicht bekannt.
Die derzeit gültige Hypothese ist, dass eine Kombination aus genetischer
Prädisposition und externen Faktoren (Umwelteinflüssen) zu einer Dysregulation des
Immunsystems und damit letztlich zur Entstehung von Autoimmunität gegen das
zentrale Nervensystem führt (Compston und Coles, 2008). In letzter Zeit kommt vor
allem der Untersuchung der Bedeutung verschiedener Umwelteinflüsse wie
5
Rauchen, Ernährung, Infektionskrankheiten, Sonnenexposition oder Vitamin D eine
große Bedeutung zu.
Im Gegensatz zur Ätiologie ist die Pathogenese der MS in einigen Aspekten relativ
gut verstanden. Nach derzeitiger Auffassung ist die MS ist eine primär T-Zell
vermittelte Autoimmunerkrankung. ZNS-spezifische autoreaktive T-Zellen, deren
Selbsttoleranz gegenüber Bestandteilen des ZNS gestört ist, werden in der
Peripherie aktiviert, wandern im Rahmen der Immunüberwachung in das ZNS ein,
erkennen hier ihr Autoantigen und rufen zusammen mit B-Zellen,
Monozyten/Makrophagen und ortsständiger Mikroglia eine lokale Entzündung hervor
(Wekerle, 2017). Die primäre immunologische Attacke richtet sich bei der MS
vermutlich gegen die Myelinscheide. Nicht selten werden aber bei der
immunologischen Attacke auf die Myelinschicht die Axone in Mitleidenschaft
gezogen und zerstört (Lassmann et al., 2007). Dieser axonale Verlust ist
wahrscheinlich das Korrelat bleibender Behinderung bei der MS.
Anfangs wurden v.a. ZNS-spezifische IFN- γ produzierende T-1-Helferzellen (TH1)
als Hauptakteure in der Pathogenese beschrieben, jedoch konnte die Beteiligung
weiterer Immunzellen nachgewiesen werden (Murphy et al., 2010). Jüngst rückten T-
17-Helferzellen (TH17) in den Mittelpunkt der MS Forschung. Eine Beteiligung der
TH17 Zellen wird bei diversen Autoimmunerkrankungen vermutet (Kleinewietfeld et
al., 2013).
Neben den T-Helferzellen spielen aber auch regulatorische T-Zellen (Treg) eine
wichtige Rolle. Im Gegensatz zu den proinflammatorischen TH1 und TH17 Zellen
besitzen regulatorische T-Zellen antiinflammatorische Eigenschaften, weswegen den
Treg wichtige immunmodulierende Funktionen bei Autoimmunerkrankungen
zugesprochen werden. Das Ungleichgewicht zwischen proinflammatorischen
TH1/TH17 Zellen und antiinflammatorischen regulatorischen T-Zellen gilt somit als ein
wichtiger Faktor für die Entstehung der autoimmunen Entzündung bei MS
(Kleinewietfeld und Hafler, 2014). Mögliche Therapieansätze bestehen demnach
darin, TH1/TH17 Zellen zu unterdrücken und/oder vermehrt Treg Zellen zu generieren
bzw. deren Funktion zu stärken (Haghikia et al., 2013).
Nun finden sich autoreaktive T-Zellen auch bei gesunden Menschen, sie unterliegen
jedoch strengen Kontrollmechanismen und weisen im Gegensatz zu denen der MS
Patienten eine geringere Aktivität auf (Zhang et al., 1994).
6Experimentelle Modelle legen nahe, dass die Aktivierung dieser autoreaktiven T-
Zellen möglicherweise im Darm stattfindet (Esplugues et al., 2011). Im Darm
präsentieren dendritische Zellen mikrobielle Antigene mit struktureller Ähnlichkeit zu
ZNS-Antigenen und aktivieren so diese potentiell autoreaktiven T-Zellen
(Wucherpfennig und Strominger, 1995). Aufgrund dessen kommt dem Darm eine
zunehmende Bedeutung in der Ätiologie und Pathogenese der MS zu – und damit
auch Fragen zur Ernährung und der Beeinflussung des Mikrobioms durch die
Ernährung.
3.3 Modell der Experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis
Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein Tiermodell, das zur
Erforschung entzündlicher Autoimmunerkrankungen des ZNS dient. Zahlreiche
Erkenntnisse über die Ätiologie und Pathogenese der MS konnten hierdurch
gewonnen werden. Durch das Injizieren ZNS-spezifischer Proteine wird bei der EAE
eine Autoimmunreaktion innerhalb des ZNS des Versuchstieres ausgelöst (Wekerle,
1993). Infolge der Immunreaktion kommt es, ähnlich wie bei der MS, zur Zerstörung
von Myelinscheiden, Axonen und Nervenzellen durch körpereigene Abwehrzellen.
Am häufigsten dienen Nagetiere, wie Mäuse oder Ratten als Versuchstiere (Mix et
al., 2010). In Abhängigkeit vom ausgewählten Modell (Versuchstier, Agens) können
unterschiedliche Verlaufsformen und Charakteristika nachgeahmt werden.
Die EAE stellt im Gegensatz zur MS zumeist eine akut monophasisch verlaufende
demyelinisierende Erkrankung dar, deren CD4+T-Zell-vermittelte Entzündung sich
vorwiegend im Rückenmark abspielt (Gold et al., 2006b).
Trotz der Unterschiede zur humanen Erkrankung konnten zahlreiche Erkenntnisse
zur MS aus der Erforschung des EAE-Modells gezogen werden. Nicht selten dienten
diese als Grundlage für Therapieansätze der MS und fanden Einzug in die klinische
Praxis (Baxter, 2007).
3.4 Die Bedeutung der „Westlichen Diät“
Die Zunahme von Autoimmunerkrankungen in hochentwickelten westlichen
Industrieländern lässt auf eine Beteiligung des dort vorherrschenden Lebensstils
schließen (Manzel et al., 2014).
Diese Theorie, wird durch den Anstieg von Autoimmunerkrankungen in ehemaligen
Niedrigprävalenz-Ländern, wie Japan, bestärkt (Houzen et al., 2012). Während die
7Gene einer Population recht konstant bleiben, können sich Umweltfaktoren, wie
beispielsweise der Lebensstil rasch ändern.
Die Zunahme von Autoimmunerkrankungen könnte somit durch eine
„Verwestlichung“ des Lebensstils erklärt werden (Koch-Henriksen und Sorensen,
2010).
Der westliche Lebensstil ist durch hohe Hygienestandards, den Konsum von
Genussmitteln, wie Nikotin oder Alkohol, Bewegungsmangel und eine „westliche
Ernährung“ geprägt.
Die „westliche Ernährung“ kennzeichnet sich durch einen hohen Konsum an Fleisch,
Softdrinks, Fast Food und Fertigprodukten (Halton et al., 2006). Sie ist stark
reichhaltig an Zucker, Salz und Fetten. Meeresfrüchte, Obst, Gemüse, Hülsenfrüchte
und im Allgemeinen Ballaststoffe machen nur einen geringen Teil der „westlichen
Diät“ aus (Bloomfield et al., 2015).
Diese hochkalorische, fett- und salzreiche westliche Diät gilt als Risikofaktor für
metabolische, kardiovaskuläre und Autoimmunerkrankungen (Manzel et al., 2014).
Epidemiologische Studien bezüglich Ernährung und MS sehen eine kalorienarme
fisch-, gemüse- und ballaststoffreiche Diät als protektiv an (Lauer, 1997). Im
Gegensatz dazu ist ein hoher Konsum von Milch-, Fleischprodukten und tierischem
Fett mit einer erhöhten Prävalenz der MS assoziiert (Agranoff und Goldberg, 1974).
Der Darm spielt bei der Verdauung oral aufgenommener Substanzen, eine
besondere Rolle. Im Darmlumen besiedeln zahlreiche verschiedene
Mikroorganismen die Darmoberfläche. Die Gesamtheit der Mikroorganismen im
Darm wird als Mikrobiom bezeichnet (Marchesi und Shanahan, 2007). Die
Zusammensetzung ist individuell sehr unterschiedlich und von verschiedenen
Faktoren abhängig. Veränderungen des Mikrobioms können beispielsweise durch die
Einnahme von Antibiotika oder eine fettreiche Ernährung entstehen (Hildebrandt et
al., 2009). Infolgedessen kann es zu einem Ungleichgewicht zwischen
symbiontischen und pathologischen Erregern kommen (Kau et al., 2011). Ein solches
Ungleichgewicht wird als Dysbiose bezeichnet und steht im Verdacht, eine
Dysregulation des Immunsystems zu begünstigen (vgl. Abbildung 1) und ist zum
Beispiel mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und Asthma assoziiert
(Macia et al., 2012), (Trompette et al., 2014). Ein Zusammenhang zwischen Diät,
Fettleibigkeit, dem Mikrobiom und Autoimmunerkrankungen wird daher vermutet
(Brown et al., 2013), (Clemente et al., 2012).
8Abbildung 1: Autoimmunität und der Einfluss Westlicher Diät auf das Immungleichgewicht. Modifiziert
nach Joerg et al., 2016a.
Die Abbildung stellt die vermutete Ätiologie von Autoimmunerkrankungen mit Augenmerk auf die Westliche Diät
und das Mikrobiom dar. Genetische Faktoren und Umweltfaktoren werden im Zusammenspiel als Auslöser für
Autoimmunerkrankungen, wie zum Beispiel für die MS, diskutiert. Die Westliche Diät kann direkt oder indirekt
über Veränderungen des Mikrobioms (Dysbiose) einen Einfluss auf das Immunsystem nehmen. So führte eine
fettreiche Diät im Tiermodell der Multiple Sklerose zu einem Überwiegen von proinflammatorischen TH1 und TH17
Zellen. Ein solches Ungleichgewicht fördert die Entstehung von Autoimmunität.
Eine Diät, reich an mittel- und langkettigen Fettsäuren, führt über Veränderungen im
Mikrobiom und einer gesteigerten Differenzierung von proinflammatorischen
TH1/TH17 Zellen zu einer Verschlechterung des Verlaufes eine experimentellen
autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), einem Tiermodell der MS. Es konnte gezeigt
werden, dass Versuchstiere unter einer Diät, reich an langkettigen Fettsäuren
(LCFA), einen schwereren Krankheitsverlauf zeigten, als Mäuse, die eine Normaldiät
mit einem geringeren Fettanteil erhielten. Begleitet wurde diese Beobachtung durch
eine vermehrte Anzahl von TH17 Zellen in der Milz und im ZNS (Haghikia et al.,
2015).
Kurzkettige Fettsäuren (SCFA) besitzen im Gegensatz zu LCFA anti-
inflammatorische Eigenschaften (Haghikia et al., 2015). In vitro induzieren SCFA
regulatorische T-Zellen und unterdrücken die Entstehung proinflammatorischer TH17
Zellen (Furusawa et al., 2013). Das größte immunregulatorische Potenzial besitzt
Propionat (PA), mit einer Kettenlänge von drei Kohlenstoffatomen (Haghikia et al.,
2015). Im EAE-Modell zeigte die Behandlung von Mäusen mit Propionat ab dem Tag
der Immunisierung neben der Zunahme von Treg im Darm, in der Milz und im
Rückenmark einen vorteilhaften Effekt auf den Krankheitsverlauf. Der mildere
klinische Krankheitsverlauf wurde zusätzlich von einer Reduktion der Entmarkung,
9einem geringeren Axonschaden und einer reduzierten Entzündungszellinfiltration
begleitet (Haghikia et al., 2015).
SCFA sind Bestandteile der Nahrung und werden zum Beispiel als
Konservierungsmittel eingesetzt. Die Hauptquelle der kurzkettigen Fettsäuren stellen
jedoch Darmbakterien, wie Prevotellace und Bacteriodes dar, die SCFA bei der
Metabolisierung unverdaulicher Kohlenhydrate produzieren (Haase et al., 2018). Die
Gesamtzahl SCFA-produzierende Bakterien kann durch eine LCFA-reiche Diät
reduziert werden. Eine Untersuchung des Mäuse Faeces unter einer LCFA-reichen
Diät zeigte dementsprechend eine geringere Konzentration an SCFA. Der günstige
Einfluss der SCFA wird also durch eine LCFA-reiche Diät reduziert (Haghikia et al.,
2015).
Fettsäuren besitzen einen Einfluss auf das Immunsystem und stellen somit einen
interessanten Umweltfaktor in der Pathogenese der MS dar. Dabei entscheidet die
Kettenlänge gesättigter Fettsäuren über einen schädlichen oder nützlichen Einfluss
auf das Tiermodell der MS.
3.5 Zielsetzung der Arbeit
Aufgrund ihrer immunmodulierenden Eigenschaften, des natürlichen Vorkommens
und des guten Nebenwirkungsprofils stellen kurzkettige Fettsäuren eine mögliche
Add-on Therapie zu den etablierten Immuntherapien der MS und/oder eine
allgemeine Nahrungsempfehlung dar (Haase et al., 2018).
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, Erkenntnisse über den Einfluss der Ernährung auf
die MS zu sammeln, um zum einen Risikofaktoren zu identifizieren, zum anderen
aber auch neue Therapiemöglichkeiten zu überprüfen.
In diesem Projekt wurde der schädliche Effekt einer fettreichen Diät auf den
Krankheitsverlauf der EAE quantifiziert und untersucht, ob die kurzkettige Fettsäure
Propionat mit ihren immunregulatorischen Eigenschaften den schädlichen Einfluss
einer fettreichen Diät im Tiermodell der MS umkehren kann.
Ziel dieser Arbeit ist es somit, das therapeutische Potential von Propionat weiter zu
charakterisieren.
104 Materialien und Methoden
4.1 Materialien
4.1.1 Antikörper für die Immunhistochemie
Anti-Maus Antikörper Klon Firma
CD3 (#MCA1477) Monoklonaler Antikörper Bio-Rad Laboratories,
(Ratte, IgG) Hercules (Kalifornien,
USA)
GFAP (#Z0334) Polyklonaler Antikörper Dako, Glostrup
(Kaninchen, IgG) (Dänemark)
Mac-3 (#550292) Monoklonaler Antikörper BD Biosciences
(Ratte, IgG) Pharmingen, Franklin
Lakes (New Jersey, USA)
NogoA (#sc-25660) Polyklonaler Antikörper Santa Cruz
(Kaninchen, IgG) Biotechnology, Dallas
(Texas, USA)
Olig-2(MABN50) Monoklonaler Antikörper Merck Milipore, Darmstadt
(Maus, IgG) (Deutschland)
Olig-2 (#AB9610) Polyklonaler Antikörper Merck Milipore, Darmstadt
(Kaninchen, IgG) (Deutschland)
Tabelle 1: Primäre Antikörper für die Immunhistochemie
4.1.2 Sekundär Antikörper
Biotinylierter Anti-Ratte-Antikörper Vector laboratories, Burlingame
(Hase, IgG, #BA-4001) (Kalifornien, USA)
Biotinylierter Anti-Kaninchen-Antikörper Vector laboratories, Burlingame
(Ziege, IgG, #BA-1000) (Kalifornien, USA)
Biotinylierter Anti-Maus-Antikörper Vector laboratories, Burlingame
(Ziege, IgG, #BA-9200) (Kalifornien, USA)
Tabelle 2: Sekundäre Antikörper für die Immunhistochemie
114.1.3 Biologische Reagenzien
Bovines Serumalbumin Fraktion V Carl Roth KG, Karlsruhe (Deutschland)
Myelin Oligodendrozyten Glykoprotein Charité Berlin, Berlin (Deutschland)
35-55 (MOG35-55)
Pertussis-Toxin List Biological Laboratories via
Quadratech, Epsom (UK)
Komplettes Freund’sches Adjuvans Difco, Detroit (Michigan, USA)
3,3’-Diaminobenzidin (DAB) Merck KgaA, Darmstadt (Deutschland)
Puffertabletten
Entellan Merck KgaA, Darmstadt (Deutschland)
Luxol Fast Blue Lösung (LFB) Sigma-Aldrich Life Science, St. Louis
(Missouri, USA)
Triton X-100 Sigma-Aldrich Life Science, St. Louis
(Missouri, USA)
Kresylviolett Sigma-Aldrich Life Science, St. Louis
(Missouri, USA)
Tabelle 3: Biologische Reagenzien
4.1.4 Chemikalien
Essigsäure 100% Carl Roth KG, Karlsruhe (Deutschland)
Ammoniak 25% Merck KgaA, Darmstadt (Deutschland)
Citronensäure-Monohydrat PanReac AppliChem, Darmstadt
(Deutschland)
Di-Natriumhydrogenphosphat Dihydrat Merck KgaA, Darmstadt (Deutschland)
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) Merck KgaA, Darmstadt (Deutschland)
Ethanol 96% vergällt Carl Roth KG, Karlsruhe (Deutschland)
Ethanol absolut Th.Geyer, Renningen (Deutschland)
Hämalaunlösung sauer nach Mayer Carl Roth KG, Karlsruhe (Deutschland)
Salzsäure 32% reinst Carl Roth KG, Karlsruhe (Deutschland)
Wasserstoffperoxid Carl Roth KG, Karlsruhe (Deutschland)
Lithiumcarbonat Merck KgaA, Darmstadt (Deutschland)
Methanol Merck KgaA, Darmstadt (Deutschland)
12Natriumthiosulfat-Pentahydrat Merck KgaA, Darmstadt (Deutschland)
Paraformaldehyd (PFA) VWR Prolabo, Leuven (Niederlande)
Perjodsäure Merck KgaA, Darmstadt (Deutschland)
Kalium Chlorid VWR Prolabo, Leuven (Niederlande)
Kaliumdihydrogenphosphat Merck KgaA, Darmstadt (Deutschland)
Kaliumdisulfit Merck KgaA, Darmstadt (Deutschland)
Schiff’sches Reagenz Carl Roth KG, Karlsruhe (Deutschland)
Silber-Hydroxid-Lösung Carl Roth KG, Karlsruhe (Deutschland)
Silbernitrat Carl Roth KG, Karlsruhe (Deutschland)
Natriumazid Merck KgaA, Darmstadt (Deutschland)
Natrium Chlorid Carl Roth KG, Karlsruhe (Deutschland)
Xylol (Isomere) >98% Carl Roth KG, Karlsruhe (Deutschland)
Tabelle 4: Chemikalien
4.1.5 Kits
Vectastain ABC HRP Kit Elite Vector laboratories, Burlingame
(Peroxidase, Standard) (Kalifornien, USA)
4.1.6 Versuchstiere
C57BL/6 Wildtyp Mäuse Charles River, Sulzfeld (Deutschland)
4.1.7 Verbrauchsmaterial
Dako Stift Dako, Glostrup (Denmark)
Mikropipette Spitzen 10, 20, 200, 1000 Sarstedt, Nümbrecht (Deutschland)
µl
Polypropylen-Röhrchen, konisch 15, 50 Sarstedt, Nümbrecht (Deutschland)
ml
Kanüle BD Microlance 3, 20 G 1 ½ BD Biosciences, Heidelberg
(Deutschland)
Mikrotom Klinge, rostfreier Stahl R35 Feather Saftey, Osaka (Japan)
13Objektträger Superfrost Plus Gerhard Menzel B.V. & Co. KG,
Braunschweig (Deutschland)
Deckgläser 24x60mm, 18x18 mm Gerhard Menzel B.V. & Co. KG,
Braunschweig (Deutschland)
Chirurgische Klinge Feather Saftey, Osaka (Japan)
Omnifix 20 ml luer lock solo, Kanüle B. Braun Melsungen AG, Melsungen
(Deutschland)
Spritzenfilter Filtropur S 0.2, 0,20 µm Sarstedt, Nümbrecht (Deutschland)
steril
Siedesteine J.P. Pöllath, Bamberg (Deutschland)
Filterpapier MN 615 ¼ 185mm Mackery-Nagel, Düren (Deutschland)
Parafilm Bemis, Neenah (Wisconsin, USA)
Biopsie Schaumstoffpolster Simport, Beloeil (Quebec, Kanada)
Histosette Simport, Beloeil (Quebec, Kanada)
Serologische Pipetten 5ml, 10ml, 15ml Sarstedt, Nümbrecht (Deutschland)
Tabelle 5: Verbrauchsmaterialen
4.1.8 Instrumente und Software
4.1.8.1 Instrumente
Dampfgarer Multigourmet Braun, Kronberg im Taunus
(Deutschland)
Laborabzug Wesemann Laboreinrichtungen, Syke
(Deutschland)
Mikrotom Olympus Cut 4055 Olympus, Center Valley (Pennsylvania,
USA)
Wasserbad MICROM International, Walldorf
(Deutschland)
Kühlschränke 4 Grad Liebherr Profi Line Liebherr,
Bulle (Schweiz)
- 20 Grad Liebherr NoFrost Liebherr,
Bulle (Schweiz)
Minizentrifuge Eppendorf Minispin, Eppendorf AG, Hamburg (Deutschland)
Eppendorf Pipette 10, 20, 200, 1000 µl Eppendorf AG, Hamburg (Deutschland)
14Autoklav Varioklav H+P Thermo Scientific, Langenselbold
(Deutschland)
Elektronische Waage 440-49N Kern & Sohn, Balingen (Deutschland)
Elektronische Waage BP2215 Sartorius, Göttingen (Deutschland)
Feine Pinzette, Feine Schere Fine science tools, Heidelberg
(Deutschland)
Glas- und Plastikmaterialien (Flaschen, Schott/Brand via VWR, Ismaning
Erlenmeyer Kolben, Zylinder, Trichter) (Deutschland) and Omnilab, München
(Deutschland)
Trockenschrank HeraCell Heraeus, Hanau (Deutschland)
Magnetrührer IKA-Werke, Staufen (Deutschland)
Auflichtmikroskop Olympus BX51 Olympus, Center Valley (Pennsylvania,
USA)
Mikroskop BH2 Olympus, Center Valley (Pennsylvania,
USA)
Reagenzglasschüttler Vortex Genie 2 Bender & Hobein AG, Zurich (Schweiz)
pH-Titriergerät Schott AG/SI Analytics, Mainz
(Deutschland)
Brand Färbetröge aus Kalknatronglas Fisher scientific, Schwerte
mit Einsatz (Deutschland)
Färbebank VWR, Darmstadt (Deutschland)
Latex Handschuhe Sempermed, Wien (Österreich)
Messzylinder 500 ml VWR, Darmstadt (Deutschland)
Messzylinder 100 ml VWR, Darmstadt (Deutschland)
Tabelle 6: Instrumente
4.1.8.2 Software
MS Office 2010 Microsoft Corp. Redmont (Washington,
USA)
Graph Pad Prism 9 GraphPad Software Inc., San Diego
(Kalifornien, USA)
Soft imaging System analysis 3.0 cell^P Olympus, Center Valley (Pennsylvania,
USA)
Tabelle 7: Software
154.2 Methoden
4.2.1 Versuchstiere
C57BL/6 Mäuse wurden von der Firma Charles River (Sulzfeld, Deutschland)
bezogen. Die Tiere waren tierschutzgerecht unter standardisierten
Umweltbedingungen im Tierstall der Universitätsklinikum Erlangen-Nürnberg
untergebracht. Die Tierversuche standen im Einklang mit den deutschen
Tierschutzrichtlinien und wurden durch die Regierung von Unterfranken genehmigt
(Antragsnummer: 55.2 DMS 2532-2-27).
4.2.2 Induktion und Analyse der EAE
Zur Induktion der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) wurde eine
Emulsion aus dem Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein Peptid 35-55 (MOG 35-55)
und kompletten Freundschen Adjuvans verwendet. Die 10-12 Wochen alten Mäuse
wurden vor der Immunisierung mit einer Lösung aus Ketamin/Xylazin (80mg pro
kg/8mg pro kg) anästhesiert. Insgesamt wurden den Mäusen 200 µg MOG 35-55 und
200 µg des kompletten Freundschen Adjuvans durch zwei Injektionen á 50 µl rechts
und links der Schwanzbasis subkutan appliziert. Zur Verstärkung der
Krankheitsentwicklung wurde jeder Maus am Tag der Immunisierung (Tag 0 p.i.) und
48 Stunden später (Tag 2 p.i.) zusätzlich 200 ng Pertussis Toxin (PTX; aufgelöst in
200 µl Kochsalzlösung) intraperitoneal injiziert (Jorg et al., 2016). Die Versuchstiere
wurden jeden Tag gewogen und klinisch anhand des EAE Scores, welcher 10
Schweregrade umfasst, beurteilt (Tabelle 8). Mäuse mit einem Wert von 7 oder
höher wurden entsprechend den Tierschutzrichtlinien artgerecht getötet (Lee, 2008).
16EAE-Score Klinische Symptome
0 keine
1 läuft normal, proximale 2/3 des Schwanzes waagrecht,
Schwanzspitze schleift am Boden
2 läuft normal, gesamter Schwanz schleift am Boden
3 zusätzlich breitbeiniger Gang, geringe Ataxie
4 breitbeiniger ataktischer Gang, Hinterbeine nicht mehr ganz
durchgestreckt, Hinterteil niedriger als bei EAE Score 3
5 klappt zusätzlich beim Laufen teilweise oder permanent ein
Hinterbein nach hinten weg, kann aber noch für den nächsten
Schritt vollständig nach vorne gebracht werden (leichte
Paraparese der Hinterbeine)
6 ein Bein konstant paretisch, kann für den Schritt nicht mehr
unter den Körper gezogen werden; oder beide Beine inkonstant
hinten, könnten noch unter den Körper gezogen werden; oder
seitliches Wegrutschen beider Beine, Gang im Spagat
7 beide Hinterbeine fast oder völlig gelähmt (schwere Paraparese
oder Paraplegie); Fortbewegung nur durch die Vorderbeine
gewährleistet
8 zusätzliche Schwäche der Vorderbeine, zieht sich nicht mehr
gerade und flott mit den Vorderbeinen voran; Aufstützen des
Oberkörpers nur auf die Unterarme (Tetraparese)
9 Tetraparese und Atemnot, moribund
10 Wegen Zustandes verstorben, Tod
Tabelle 8: Übersicht EAE Score (Lee, 2008)
174.2.3 Tierexperimente
Die Versuchstiere erhielten entweder eine Hochfettdiät (HFD) mit einem Rohfettanteil
von 30,9 Prozent, reich an mittel- und langkettigen Fettsäuren (C12:0 Laurat,
13,47%) oder eine Normaldiät (ND) mit einem Fettanteil von 4,2 Prozent.
Vor Induktion der EAE wurden die Versuchstiere über vier Wochen an die jeweilige
Diät adaptiert.
Eine weitere Versuchsgruppe (HFD+PA) erhielt täglich ab dem Tag der
Immunisierung zusätzlich zur fettreichen Diät 200 µl Propionat (150mM).
Das Propionat wurde oral appliziert. Um sicherzustellen, dass die orale Applikation
keinen Einfluss auf den Verlauf nimmt, wurde einer weiteren HFD Gruppe 200 µl des
Lösungsmittels (Wasser) zur Kontrolle oral appliziert. Somit ergeben sich folgende
Versuchsgruppen: Normaldiät- (ND), Hochfettdiät- (HFD) und Hochfettdiät-Propionat-
Gruppe (HFD+PA).
Nach Krankheits-Induktion wurden die Tiere klinisch mittels des EAE Scores
evaluiert. Zu vier unterschiedlichen Zeitpunkten, am Maximum der Erkrankung an
Tag 15 und 16, sowie im späteren Krankheitsverlauf an Tag 51 und 56 wurden
Rückenmarksquerschnitte angefertigt und anschließend mit (immun)histochemischen
Methoden gefärbt und analysiert. Demyeliniserung, Axonuntergang,
Entzündungszellen, Neurone und Gliazellen wurden histologisch untersucht.
4.2.4 Perfusion und Gewebepräparation
Die Versuchstiere wurden mittels Isoflurannarkose tierschutzgerecht getötet und
anschließend mit 4%igem in Phosphatgepufferten-Salzsäure (PBS) gelösten
Paraformaldehyd (4% PFA/PBS) fixiert (Bohlen und Halbach, 1999).
Der Blutkreislauf der Maus wurde für die Fixierung zuerst mit 4%PFA/PBS durchspült
um jedes Organ über die organeigenen Versorgungsgefäße zu infiltrieren. Hierfür
wurde die Maus auf einem Präparationsstyropor fixiert. Die Maus wurde
anschließend mit 70%-Ethanol desinfiziert. Daraufhin wurde der Brustkorb auf Höhe
des Sternums eröffnet und das Herz freigelegt. Anschließend wurde der Herzbeutel
eröffnet, die linke Herzkammer aufgesucht und eine Kanüle in den linken Ventrikel in
Richtung des linken Vorhofs injiziert. Über die Kanüle wurden vorsichtig 20 ml 4%
PFA/PBS langsam, über mehrere Minuten kontinuierlich unter nicht allzu starkem
Druck infundiert. Unter steigendem Druck im Blutkreislauf wurde der rechte Vorhof
18am Herzohr eröffnet, um das Blut und die Perfusionslösung aus dem Kreislauf
entweichen zu lassen. Dieses Verfahren wird Perfusionsfixation genannt und wurde
bei Raumtemperatur unterhalb einer Abzugseinrichtung durchgeführt. Anschließend
wurden die Milz und das zentrale Nervensystem (Gehirn und Rückenmark) vorsichtig
aus der Maus entnommen und es folgte die Immersionsfixierung, bei der die Organe
unverändert als Ganzes über mehrere Stunden im selben Fixativ (4% PFA/PBS)
verbleiben (Bohlen und Halbach und Dermietzel, 1999).
Nach vier Stunden wurde das Gewebe für die Entwässerung weiterverarbeitet.
Das Rückenmark wurde vom Gehirn abgesetzt und mit dem Skalpell in jeweils drei
zervikale, drei thorakale und drei lumbale Rückenmarks-Abschnitte unterteilt.
Zusammen mit einem Teil der Milz (Positivkontrolle für Entzündungszellen) wurden
die insgesamt neun Rückenmarksquerschnitte in gleichbleibender Reihenfolge in
eine mit Schaumstoff ausgelegte Histosette positioniert und in einem mit PBS
gefülltem Becherglas aufbewahrt.
Das Gewebe wurde daraufhin in einem Gewebeinfiltrationsautomaten
(Neuropathologisches Institut, Universitätsklinikum Erlangen) stufenweise entwässert
und in heißes Paraffin eingebettet. Durch Abkühlung entstanden ausgehärtete
Paraffinblöcke.
Mit Hilfe eines Mikrotoms wurden zur weiteren histologischen Verarbeitung des
Gewebes vier µm dicke Gewebeschnitte angefertigt.
Anschließend wurde der Gewebeschnitt mit zwei Pinseln mobilisiert und auf einen
Objektträger gelegt. Bevor man den Gewebeschnitt in dem 54 Grad Celsius warmen
Wasserbad streckte, wurde dieser mittels Einmalpipette mit 40% Ethanol unterspült,
damit sich der Gewebeschnitt besser vom Objektträger löste. Nachdem sich die
Gewebeschnitte im Wasser strecken konnten, wurden sie auf einen beschichteten
Objektträger zum Trocknen aufgebracht.
Die Rückenmarksquerschnitte konnten im Anschluss mit histologischen und
immunhistochemischen Methoden gefärbt und analysiert werden.
4.2.5 Histologische Methoden
Die histologischen Färbungen dienen der Darstellung von Entzündungszellen,
Gliazellen, Neurone, der Demyelinisierung und des axonalen Schadens im
Rückenmark.
19Die Färbungen wurden entsprechend der Färbeprotokolle des Neurologischen
Forschungslabors durchgeführt.
4.2.5.1 Immunhistochemische Färbungen
Mittels immunhistochemischer Färbemethoden wurden unterschiedliche
Oberflächenantigene angefärbt.
Für den Antigen-Nachweis wurde die indirekte Biotin-Streptavidin-Methode
verwendet. Diese Methode beruht darauf, dass das Glykoprotein Avidin mit hoher
Affinität Biotin bindet. Ein primärer Antikörper bindet zunächst spezifisch an sein
Antigen. Ein sekundärer Antikörper, der mit Biotin gekoppelt ist, bindet anschließend
an den primären Antikörper. An das Biotin des Sekundärantikörpers kann im
nächsten Schritt ein mit dem Enzym Peroxidase gekoppelter Streptavidin-Komplex
(SAvHRP), binden. Die Visualisierung des Antikörper-Peroxidase-Komplexes erfolgt
über das kanzerogene Chromogen DAB (3’-3’-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid),
ein Substrat der Peroxidase. Die Peroxidase katalysiert die Umwandlung von DAB in
ein bräunliches Endprodukt. Diese Reaktion macht das markierte Antigen durch eine
Braunfärbung sichtbar.
Die Fixierung von Gewebe mit Paraformaldehyd führt durch Proteinvernetzungen zu
einer Maskierung von Antigenstrukturen. Damit die Antigene in
immunhistochemischen Färbungen nachgewiesen werden können, müssen sie durch
den Vorgang der hitzeinduzierten Antigendemaskierung für den Antikörper wieder
zugänglich gemacht werden (Bohlen und Halbach und Dermietzel, 1999).
Die Rückenmarksinfiltrate wurden mit verschieden Antikörper-Färbungen analysiert.
Die Bestimmung des Ausmaßes der entzündlichen Läsion und Differenzierung der
einzelnen Entzündungszellen spielte dabei eine wichtige Rolle. T-Zellen wurden
mittels Antiköper gegen das Oberflächenprotein CD3 (Anti-CD3-Antikörper)
identifiziert. Antikörper gegen das Oberflächenprotein Mac3 detektierten
Makrophagen und Mikroglia.
Des Weiteren wurden Gliazellen innerhalb der Infiltrate betrachtet. Das
Strukturprotein der Astrozyten, GFAP (glial fibrillary acidic protein) kann mittels Anti-
GFAP-Antikörper angefärbt werden. Olig-2 und Nogo-A sind spezifische Marker für
oligodendrogliale Zellen und lassen sich ebenfalls durch Antikörper anfärben. Eine
Übersicht über die verwendeten Antikörper zeigt Tabelle 9.
20Primärantikörper Sekundärantikörper
CD3 Antikörper (Ratte anti-Maus Biotinylierter Kaninchen anti-Ratte
Antikörper) Antikörper
1:200 1:200
Mac-3 Antikörper (Ratte anti-Maus Biotinylierter Kaninchen anti-Ratte
Antikörper) Antikörper
1:200 1:200
GFAP Antikörper (Kaninchen anti-Maus Biotinylierter Ziege anti-Kaninchen
Antikörper) Antikörper
1:1000 1:200
Besonderheit: keine
Antigendemaskierung
Olig-2 Antikörper (Maus anti-Maus Biotinylierter Ziege anti-Maus Antikörper
Antikörper) 1:200
1:200
NogoA Antikörper (Kaninchen anti-Maus Biotinylierter Ziege anti-Kaninchen
Antikörper) Antikörper
1:200 1:200
Tabelle 9: Übersicht über die verwendeten Primär- und Sekundärantikörper
4.2.5.2 Standardprotokoll der Immunhistochemie
Zu Beginn wurden die Gewebeschnitte entparaffiniert und rehydriert (2x 10 Minuten
Xylol, jeweils 3 Minuten absteigende Alkoholreihe 100%-96%-90%-80%-70%-60%-
50%-destilliertes Wasser).
Es folgte die hitzeinduzierte Antigendemaskierung in EDTA-Puffer im Dampfgarer für
38 Minuten. Im Anschluss kühlten die Paraffinschnitte 15 Minuten im Puffer ab. Es
folgten mehrere Waschschritte mit destilliertem Wasser. Anschließend wurden die
Gewebschnitte mit Phosphatgepufferten-Salzsäure (PBS) dreimal für fünf Minuten
gewaschen. Die Gewebeschnitte wurden im nächsten Schritt bei Raumtemperatur
mit 10% BSA/PBS (Bovines Serumalbumin gelöst in PBS) für 45 Minuten geblockt,
um unspezifische Antikörper Bindungen zu reduzieren.
21Als nächstes wurde der Primärantikörper gelöst in 1% BSA/PBS bei vier Grad
Celsius über Nacht hinzugegeben. Ein zusätzlicher Gewebeschnitt wurde mit 1%
BSA/PBS ohne Primärantikörper inkubiert. Dieser Gewebschnitt diente als
Negativkontrolle.
Es folgten drei Waschschritte á fünf Minuten mit PBS. Zur Inaktivierung endogener
Peroxidasen folgte ein 13-minütige POD-Block (Methanol, 2M Natriumazid, 3%
Wasserstoffperoxid) bei Raumtemperatur. Es folgten drei Waschschritte á fünf
Minuten mit PBS. Anschließend wurde der biotinylierte Sekundärantikörper für 60
Minuten hinzugegeben, um bei Raumtemperatur an den Primärantikörper binden zu
können. Es folgten drei Waschschritte á fünf Minuten mit PBS. Im nächsten Schritt
wurde Peroxidase-Streptavidin (SAvHRP 1:100 in PBS) auf die
Rückenmarksquerschnitte pipettiert (35 Minuten, Raumtemperatur). Nach
dreimaligem PBS-Waschen folgte die lichtmikroskopisch-kontrollierte Entwicklung mit
DAB, welches vorher mit 3% Wasserstoffperoxid aktiviert wurde. Es folgte
mehrmaliges Waschen mit destilliertem Wasser. Im Anschluss wurde mit Hämalaun
gegengefärbt. Nach mehrmaligem Waschen mit destilliertem Wasser, erfolgte
anschließend zehnminütiges Wässern mit Leitungswasser. Nach der aufsteigenden
Alkoholreihe (je 3 Minuten destilliertes Wasser. 50%-60%-70%-80%-90%-96%-100%
Ethanol, 2x 10 Minuten Xylol) wurden die Objektträger mit Entellan eingedeckelt.
4.2.5.3 Klüver PAS/ Luxol Fast Blue-Färbung
Luxol-Fast-Blue (LFB), ein Kupfer-Phthalocyanin, bindet mit hoher Affinität an das
von Oligodendrozyten synthetisierte Neurokeratin, ein Bestandteil der Myelinscheide.
LFB stellt somit myelinisierte Nervenfasern in der histologischen Mikroskopie dar.
Klüver-PAS dient als Gegenfärbung (Bohlen und Halbach und Dermietzel, 1999).
Eine Beurteilung der Demyelinisierung von Rückenmarksquerschnitten ist in dieser
Übersichtsfärbung möglich.
Das Gewebe wurde hierfür mittels absteigender Alkoholreihe bis 96% Ethanol
entparaffiniert. Im Anschluss verblieben die Objektträger über Nacht bei 56 Grad
Celsius in 0,1 % LFB-Lösung. Nach zwei Waschschritten mit 96% Ethanol und
destilliertem Wasser wurden die Rückenmarksquerschnitte in 1% Lithiumcarbonat
differenziert, bis sich der Hintergrund entfärbte und nur noch die Myelinscheiden
türkis-blau sichtbar waren. Die Kontrolle der Entfärbung erfolgte mit dem
Lichtmikroskop BH2. Bei nicht ausreichendem Ergebnis konnten die Schritte der
22Differenzierung wiederholt werden. Danach wurden die Gewebeschnitte mit 70%
Ethanol gespült und in destilliertem Wasser gesammelt. Im Anschluss wurden die
Rückenmarksquerschnitte mit Perjod Schiffsäure Reagenz gegengefärbt. Zuerst
wurden die Rückenmarksquerschnitte bei Raumtemperatur für zehn Minuten in 0,8%
Perjodsäure inkubiert. Daraufhin folgte die Inkubation für 20 Minuten in Schiff’schem
Reagenz. Nach dreimaligem Sulfit-waschen für jeweils zwei Minuten, folgte das
Wässern mit Leitungswasser, die aufsteigende Alkoholreihe und anschließendes
Eindeckeln der Objektträger mit Entellan.
4.2.5.4 Silberfärbung nach Bielschowsky
Die Silberfärbung dient der Darstellung von Axonen und Dendriten der Nervenzellen,
indem sie Neurofibrillen schwarz anfärbt und das restliche Rückenmarksgewebe
hellbraun erscheinen lässt (Bohlen und Halbach und Dermietzel, 1999).
Als erstes wurden die Rückenmarksquerschnitte entparaffiniert Die Gewebeschnitte
wurden anschließend für 15 Minuten in 37 Grad Celsius vorgewärmter
Silbernitratlösung (20%) gestellt. Es folgte gründliches Waschen mit destilliertem
Wasser. Die Silbernitratlösung wurde daraufhin durch tropfenweise Zugabe von 25%
Ammoniak (NH3) in ammoniakalische Silberlösung (Ag-Hydroxid) umgewandelt.
Diese Umwandlung wurde durch die Entstehung eines braunen Niederschlags
angezeigt, der sich nach weiterer Zugabe von NH3 wieder auflöste. Für zehn
Minuten folgte die lichtgeschützte Inkubation der Gewebeschnitte in der Silber-
Hydroxid-Lösung bei 37 Grad Celsius. Daraufhin wurden die Gewebeschnitte
zweimal mit 0,1% NH3 gewaschen. Anschließend folgte die Zugabe von ca. 10
Tropfen Entwicklerlösung zur Silber-Hydroxid-Lösung. In dieser Lösung wurden die
Gewebeschnitte für ca. vier Minuten reduziert. Das Ergebnis wurde
lichtmikroskopisch kontrolliert. Zeigten sich unter dem Lichtmikroskop schwarze
Fasern und ein gelblicher Hintergrund, so wurde der überschüssige Niederschlag
vom Objektträger abgewischt und es folgten zwei Waschschritte mit 0,1% NH3 und
anschließend ein Waschschritt mit destilliertem Wasser. Die Gewebeschnitte wurden
daraufhin für drei Minuten mit 5% Natriumthiosulfat fixiert. Anschließend wurden die
Gewebeschnitte mit destilliertem Wasser gewaschen und mit Leitungswasser
gewässert. Nach aufsteigender Alkoholreihe und zweimal fünf Minuten Xylol folgte
das Eindeckeln mit Entellan.
234.2.5.5 Nisslfärbung mit Kresylviolett
Mit der Kresylviolett Färbung lassen sich Zellkörper von Neuronen ohne Dendriten
und Axone darstellen. Grundlage dieser Färbemethode ist, dass Nervenzellen große
Mengen an Nisslschollen (endoplasmatisches Retikulum) besitzen, die sich mit
Kresylviolett anfärben lassen. Zu Beginn einer Nisslfärbung findet eine Überfärbung
des Gewebschnittes mit Kresylviolett statt. Anschließend folgt das Auswaschen des
Farbstoffüberschusses, wobei sich Fasern (Dendriten und Axone) schneller als
Zellbestandteile, wie zum Beispiel Nisslschollen, entfärben. Als Ergebnis erhält man
intensiv gefärbte Zellen auf einem farblosen Hintergrund (Bohlen und Halbach und
Dermietzel, 1999).
Zuerst wurden die Gewebeschnitte mit der absteigenden Alkoholreihe entparaffiniert.
Anschließend folgte die Inkubation für 13 Minuten in Kresylviolett (0,2%) bei
Raumtemperatur, welches vorher filtriert wurde. Nachdem die Gewebeschnitte
daraufhin gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen wurden, wurden sie für fünf
Minuten in Ethanol absolut gestellt. Anschließend folgte zweimal zehn Minuten ein
Xylol-Bad und Eindeckeln mit Entellan.
4.2.5.6 Mikroskopie und Datenanalyse
Die Auswertung der Rückenmarksquerschnitte erfolgte verblindet unter dem
Lichtmikroskop Olympus BX51.
Neun Rückenmarkquerschnitte eines Versuchstiers, jeweils drei aus dem cervikalen,
thorakalen und lumbalen Rückenmark, gingen in die statistische Auswertung mit ein.
Entzündungszellen, T-Zellen und Makrophagen, wurden bei vierzigfacher
Vergrößerung in den Entzündungsinfiltraten der weißen Substanz mit einem
Zählgitter (0,0625 mm2) ausgezählt und die Anzahl der Zellen mit dem Faktor 16 auf
mm2 umgerechnet. Ein braunes Signal, als Ergebnis der immunhistochemischen
Antikörper Färbung, wurde als positive Entzündungszelle gewertet. Die Werte der
ausgezählten Infiltrate der neun Rückenmarksquerschnitte jedes Versuchstieres
gingen in die Auswertung mit ein.
Die LFB Färbung wurde mit Hilfe der Software Cell P ausgewertet. Hierfür wurde ein
Rückenmarksquerschnitt in zehnfacher Vergrößerung fotografiert. Anschließend
wurde die Fläche für den gesamten Querschnitt und für die graue Substanz
bestimmt.
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