Pathway of the Anorexia during Bacterial tnfectlor" Involvement of CD14, Toll-like receptors and Serotonin

Diss. ETH No. 14977

 Pathway of the Anorexia during Bacterial tnfectlor»
Involvement of CD14, Toll-like receptors and Serotonin

                  A Dissertation subrnitted to the
           SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY
                         For the degree of
                     Doctor of Natural Science

                           presented by
                    Claudia von Meyenburg
             Engineer in Food Technology (ETH Zürich)
                Born November 13, 1972, Denmark

               Accepted on the recommendation of
              Prof. Dr. Wolfgang Langhans, examiner
               Dr. Alessandro Laviano, coexaminer
                 Dr. Brian J. Hrupka, coexaminer

                           Zürich 2002

Summary                                                                               1

1       Summary

        Animals react to infectious pathogens or injury with a variety of immune,
endocrine, metabolic, and behavioral responses.       These nonspecific responses are
part of the host's defense reaction commonly called the 'acute phase response'
(APR). Lipopolysaccharide (LPS), a gram-negative bacterial cell wall component, and
muramyl dipeptide (MDP), a gram-positive bacterial cell wall component, are
released in the body during an infection and are commonly used to model gram-
negative and gram-positive bacterial infection.     LPS and MDP reduce food intake
after intraperitoneal (IP) or intracerebroventricular (ICV) administration in animals.
This food intake reduction is supposed to be mediated by cytokines which are
released from immune cells in response to LPS and MDP.              In this thesis we
investigated some aspects of the mechanisms mediating the anorectic effects of LPS
and   MDP':~~More   specifically, we examined the role of immune cell surface molecules
in the feeding suppressive effects of LPS and MDP, and addressed the role of
serotonin (5-HT) in the neurochemical mediation of the anorexia in response to LPS.

        In the first set of experiments we investigated the involvement of CD14 as
weil as the toll-Iike receptors-2 and 4 (TLR2 and TLR4) in the anorectic response to
peripheral LPS, MDP or interleukin-1ß (IL-1ß) administration by using mice
genetically deficient in CD14, TLR2 or TLR4 and corresponding wild-type (WT) mice.
CD14, TLR2 and TLR4 are implicated in several responses to bacterial products. In
the following two sets of experiments, the role of several 5-HT receptor subtypes in
the anorectic response following IP LPS and ICV LPS, IL-1ß or leptin injections in rats
were investigated.

        LPS (2 and 40J..lgjmouse) injected IP at Iights off reduced food intake in WT
mice of all genotypes and in TLR2-knockout (KO) mice, but failed to do so in CD14-
KO and in TLR4-deficient (DEF) mice. The anorexia lasted for several days after the
administration of the high LPS dose. MDP (10 mgjkg, IP) reduced food intake in WT
mice of all genotypes and in TLR4-DEF mice, but failed to do so in CD14-KO and
TLR2-KO mice. IL-1ß (150 ngjmouse) reduced food intake similarly in all genotypes

Summary                                                                                  2

tested.   These results indicate that CD14 is involved in mediating the anorectic
effects of both LPS and MDP, that TLR4 is specifically involved in LPS-induced
anorexia, and that TLR2 mediates the feeding suppressive effect of MDP. Further,
the results suggest that pathways downstream of cytokine release are still
functioning in all KOjDEF mice.

       In all experiments which addressed the role of 5-HT receptor subtypes in LPS
induced anorexia, rats were injected with LPS (100    ~gjkg   BW IP) at Iights out (hr 0),
and antagonists were administered peripherally at 4 h, shortly after onset of
anorexia, which corresponds to the period of enhanced cytokine production. The 5-
HT receptor antagonists cyanopindolol and SB 224289 (5-HT1S), ketanserin (5-HT2A),
RS-l02221 (5-HT2c), and metoclopramide (5-HT3) failed to attenuate LPS-induced
anorexia. In contrast, both ritanserin (5-HT2A/creceptor antagonist) (0.5 mgjkg BW)
and SB 242084 (5-HT2c) (0.,3 mgjkg BW) attenuated LPS-induced anorexia at doses
that did not alter food intake in non-LPS-treated rats. These results suggest that at
least part of the anorexia following peripheral LPS administration ls mediated through
an enhanced 5-HTergic activity and the 5-HT2c receptor.

      In the third series of experiments we investigated whether the 5-HT1A
autoreceptor agonist 8-0H-DPAT (125     ~gjkg)   or the 5-HT2c receptor antagonist SB
242084 (0.3 mgjkg) would also attenuate the food intake reduction after ICV
injections of LPS (20 ng), IL-1ß (10 ng) or leptin (1 ~g) at Iights out. SB 242084
significantly attenuated the food intake reduction caused by all compounds. IP 8-
OH-DPAT attenuated ICV IL-1ß-induced anorexia. Also, to test the involvement of
the median raphe 5-HT1A receptors in peripheral LPS and IL-1ß-induced anorexia,
rats were injected IP with either LPS (100 ~gjkg) or IL-1ß (2 ~gjkg) at Iights out,
and 8-0H-DPAT (4 nmol) was administered directly into the median raphe nucleus at
the onset of anorexia.      Midbrain raphe injections of 8-0H-DPAT significantly
attenuated both IP IL-1ß and LPS-induced anorexia. These results implicate the 5-
HT2C receptors in the mediation of central LPS, IL-1ß and leptin-induced anorexia.
Further, the results suggest that the median raphe nucleus plays a role in mediating
the anorectic response to peripheral LPS and IL-1ß.

Summary                                                                      3

       In sum, the experiments conducted for this thesis advance our knowledge
concerning the involvement of CD14, TLR2, 4, 5-HT, and 5-HTergic receptors in
anorexia during bacterial infection.

Zusammenfassung                                                                      4

2     Zusammenfassung

      Im Verlauf von Infektionskrankheiten kommt es normalerweise zu einer
Verzehrsdepression,   die Bestandteil   der als Akutphasenantwort       bezeichneten
generalisierten Abwehrreaktionen des Organismus ist. Lipopolysaccharide (LPS) und
Muramyl-Dipeptid (MDP) sind Bestandteile der Zellwand von Gram-negativen bzw.
gram-positiven Bakterien, die im Verlauf einer bakteriellen Infektion im Körper
freigesetzt werden. LPS und MDP führen nach intraperitonealer (IP) wie auch nach
intracerebroventrikulärer (ICV) Applikation bei Versuchstieren zu einer Reduktion der
Nahrungsaufnahme. Die Anorexie dürfte vorwiegend aus der Freisetzung von
Zytokinen resultieren, welche von Immunzellen als Antwort auf LPS und MDP
freigesetzt werden. In dieser Dissertation untersuchten wir Mechanismen der
Verzehrsdepression als Antwort auf die Injektion von LPS und MDP. Insbesondere
wurde qeprüft, welche Moleküle auf der Zelloberfläche von Immunzellen für den
verzehrsreduzierenden Effekt von LPS und MDP essentiell sind und ob Serotonin (5-
HT) an der neurochemischen Vermittlung der LPS-induzierten Anorexie beteiligt ist.

      In der ersten Serie von Experimenten untersuchten wir die Rolle des
Glykoproteins CD14 oder der Toll-ähnlichen Rezeptoren-2 und 4 (TLR2 und TLR4)
beim verzehrsreduzierenden Effekt von LPS und MDP. Dazu wurden Mäuse mit einer
genetisch bedingten Defizienz der betreffenden Moleküle sowie entsprechende
Kontroll-Tiere (WT) verwendet. CD14, TLR2 und TLR4 werden mit unterschiedlichen
Effekten von LPS und MDP in Zusammenhang gebracht. In zwei weiteren Serien von
Experimenten überprüften wir die Rolle einiger 5-HT-Rezeptor-Subtypen bei der
durch IP    LPS   oder   ICV LPS,    IL-1ß   oder   Leptin-Applikation verursachten
Verzehrsdepression. LPS (2 oder 40 JlgjMaus, injiziert am Beginn der Dunkelphase)
reduzierte die Futteraufnahme bei den WT-Mäusen aller Genotypen sowie bei TLR2-
Knockout (KO)-Mäusen, nicht aber bei CD14-KO oder TLR-4-defizienten (DEF)
Mäusen. Nach Injektion der hohen LPS-Dosis hielt die Verzehrsdepression einige
Tage an. MDP (10 mgjkg), IP) reduzierte die Futteraufnahme bei den WT-Mäusen
aller Genotypen sowie bei den TLR-4-DEF Mäusen, nicht aber bei den CD14-KO und
TLR2-KO-Mäusen. IL-1ß (150 ngjMaus) reduzierten die Futteraufnahme unabhängig

Zusammenfassu ng                                                                     5

vom Genotyp bei allen Mäusen ähnlich stark. Diese Resultate zeigen, dass CD14 den
anorektischen Effekt von LPS und MDP vermittelt, dass TLR2 spezifisch am
diesbezüglichen Effekt von MDP beteiligt ist und dass TLR4 wichtig ist für die
Vermittlung des anorektischen Effekts von LPS. Die Ergebnisse sprechen ferner
dafür, dass die Signalmechanismen nach der Freisetzung von Zytokinen bei den KO-
und DEF-Mäusen normal funktionieren.

       In allen Experimenten, welche die Rolle der 5-HT-Rezeptor-Subtypen beim
verzehrsreduzierenden Effekt von LPS untersuchten, erhielten Ratten am Beginn der
Dunkelphase (0 h) LPS (100 J-lgjkg Körpergewicht, IP) und 4 h danach den jeweiligen
Antagonisten IP injiziert, d.h. zu einer Zeit, zu der die mit LPS injizierten Tiere
signifikant weniger frassen. Die 5-HT Rezeptor-Antagonisten Ritanserin (5-HT 2A, 0.5
mgjkg) und SB 242084 (5-HT2c, 0.3 mgjkg) schwächten den verzehrsreduzierenden
Effekt von LPS ab, beeinflussten alleine die Nahrungsaufnahme jedoch nicht.
Cyanopindolol und SB 224289 (5-HT1B), Ketanserin (5-HT2A), RS-l02221 (5-HT2C)
und Metoclopramide (5-HT3) hatten keinen Einfluss auf den verzehrsreduzierenden
Effekt von LPS. Nach diesen Resultaten wird die Anorexie nach peripherer LPS-
Injektion zum Teil durch erhöhte 5-HTerge Aktivität und spezifisch durch den 5-HT2C
Rezeptor vermittelt.

       In   weiteren   Experimenten    überprüften   wir,   ob   8-0H-DPAT (5-HT1A
Autorezeptor-Agonist, 125 J-lgjkg) oder SB 242084 (5-HT2C Rezeptor Antagonist, 0.3
mgjkg) auch die durch ICV Injektion von LPS (20 ng), IL-1ß (10 ng) und Leptin (1
J-lg) am Beginn der Dunkelphase induzierte Verzehrsdepression antagonisieren. SB
242084 verminderte die Verzehrsreduktion nach LPS, IL-1ß und Leptin-Injektion,
während 8-0H-DPAT nur die durch ICV IL-1ß induzierte Anorexie abschwächen
konnte. Um die Rolle der 5-HT1A Rezeptoren im medianen Raphe Nucleus bei der
durch IP LPS (100 J-lgjkg) oder IL-1ß (2 J-lgjkg) induzierten Anorexie zu untersuchen,
wurden LPS oder IL-1ß am Beginn der Dunkelphase IP injiziert und 8-0H-DPAT
wurde 4h später direkt in den medianen Raphe Nucleus gespritzt. Dabei schwächte
8-0H-DPAT die durch IP LPS oder IP IL-1ß induzierte Anorexie signifikant ab. Diese
Resultate sprechen dafür, dass der 5-HT2c Rezeptor auch für die Vermittlung der
nach ICV LPS, IL-1ß und Leptin auftretenden Anorexie essentiell ist.

Zusammenfassung                                                                   6

      Insgesamt erweitern die Resultate dieser Arbeit das Wissen über die Rolle der
Komponenten C014, TLR2 und TLR4 sowie der 5-HTergen Rezeptoren bei der im
verlauf von bakteriellen Infektionskrankheiten auftretenden Anorexie.