Laser-Laboratorium Göttingen
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Raman-basierte Techniken im Bereich
Patientensicherheit und medizinischer
Diagnostik
12. Workshop Kleine Volumenströme in der
Medizintechnik
Hainer Wackerbarth
Laser-Laboratorium Göttingen e.V.
Hans-Adolf-Krebs Weg 1
D-37077 Göttingen
www.llg-ev.de
Laser-Laboratorium Göttingen
Gegründet 1987
Förderung von Wissenschaft und Forschung
Mittlerfunktion zwischen Wissenschaft und Wirtschaft
Anwendungsorientierte Grundlagenforschung auf dem Gebiet der Optischen
Technologien
1Dr. Georgios Ctistis Vera Schalles Simon Göllner Stefan Scholz
Dr. Christoph Lenth Fabian Müller Christian Niklas Florian Wieduwilt
Entwicklung von Vor-Ort-Analyseverfahren
Anforderungen:
Einsetzbarkeit, Messgeschwindigkeit, Selektivität und Sensitivität, probenschonend
Probenvorbehandlung Detektions- Datenverarbeitung –
Trennung techniken Chemometrie
• Optische Spektroskopie
• Mikrofluidik
➢ Raman und erweiterte Raman
➢ Chromatographie • Abgleich mit Datenbanken
Verfahren (SERS)
➢ Elektrophorese • Sensorfusion
➢ IR Techniken (MIR, NIR, ATR)
➢ Lab-on-Chip Technik • Hard-Modelling
➢ Fluoreszenz, Absorbanz
• Kryo-Fokussierung • Statistische Verfahren (PCA, PLS)
➢ Plasmaspektroskopie (LIBS)
• Filtrieren
• Plasmonik / Oberflächenspektroskopie
• Aufkonzentrieren (SPME)
• Bildgebende Verfahren
• Elektrochemie
• Ionenmobilitätsspektrometrie
3Patientensicherheit Motivation
Alltag auf einer Intensivstation
5% Fehlerquote bei der Vergabe von Medikamenten
4
Motivation
Intuitiv bedienbare Überprüfung der
Spritzenpumpen mit Substanzen im Schlauch
integrierten Wirkstoff- zwischen Pumpe und
Standardkonzentrationen Speziell geschultes Strichcode und datenbanken Patient
Personal elektronische
Patientenakte
5% Fehlerquote!
„Patientensicherheit 4.0“
5Fehlerquellen
Falsche Dosierung, Wirkstärke oder Verabreichungshäufigkeit 43 %
Wirkstoff / Inhaltsstoff vergessen
21 %
Falsches Arzneimittel / falscher Wirkstoff
15 %
Falsche Menge
Falscher Verabreichungsweg
Falsches / vertauschtes / fehlendes Etikett
4,4 %
Falsche Formulierung 4,4 %
Falsche Zubereitungs- / Verabreichungsmethode 3,6 %
Falsche Zuordnung von Patient und Arzneimittel 3,6 %
Falsches / fehlendes / überschrittenes Verfalldatum 3,6 %
Falsche Lagerung 1,4 %
Andere
98,6 %
6
Quelle: BBM AG, http://www.sichereinfusionstherapie.de
Lösungsansatz
Pumpe
In Wasser gelöste Wirkstoffe
Nicht-invasives Vorgehen
Keine chemischen und thermischen
Veränderungen der Analyten und
Lösungen durch optische Verfahren Refraktometer
----------------------------------------------------------
Messzelle Schlauch ermittelt
Brechungsindex
Raman-Spektroskopie bestens geeignet
Raman-Spektrometer
Einige anorganische Salze nicht
detektierbar
Ergänzung durch Refraktometrie Patient
7Raman-Spektroskopie
Identifikation von molekularen Substanzen
Vorteile
Hohe Selektivität: Raman-Spektrum = Fingerabdruck
Zerstörungsfrei
Miniaturisierbar
Geeignet für on-line Monitoring
Kostengünstig
Keine Störung durch Wasser
Raman-Spektroskopie
Streulichtuntersuchung
Molekülschwingungspektroskopie Nachteil
Schwache Signalausbeute
Überlappung durch Fluoreszenz
8
Refraktometrie
Totalreflexion – Bestimmung der
Brechungsindex von Flüssigkeiten Hell/Dunkel-Kante auf Detektor
• Brechungsindex ist schnell und einfach zu bestimmen
• Bis auf die fünfte Nachkommastelle bestimmbar
• Temperaturkompensation muss durchgeführt werden
(0,02°C)
• Wellenlängenabhängigkeit kann auch genutzt werden
(Dispersion)
• Komplementäre Methode zur Raman-Spektroskopie
9Messtechniken
Kaliumchlorid
15%
Natriumchlorid
20%
Kaliumchlorid
7,45%
Natriumchlorid
Natriumchlorid 10%
0,9%
Raman-Spektroskopie Refraktometrie
10
Schema Funktionsmuster
ATR B von
Durchflussküvette Schmidt &
Haensch
Refraktometer
Raman-
Spektrometer
iRaman Pro von BWTEK
λ, I RI & T
CPU
UI
11Funktionsmuster
- Funktionsmuster aufgebaut
- Planung Prototyp abgeschlossen
- Multichannel-System
- 4er-Racks stapelbar
- Platzsparend
- Kostenreduzierung
12
Ergebnisse Raman-Spektroskopie
Anregung 785 nm, Messzeit 15 s (links) und 30 s (rechts)
13Analyse Raman-Spektren
Glucose
Intensität
Raman-Verschiebung [cm-1]
Erkennung der überlappenden Signale
Multi-dimensionale Identifikation
Halbwertsbreite
Intensität Signalform-
analyse Bestandteile in Mischungen erkennbar
Lage Geringe Kalkulationsbelastung
14
Datenfusion Raman und Refraktometrie
Patient Data
Management System
Datenbank- Datenbank-
Datenbank Filter Endergebnis Vergleich
Filter
Perfusor-Daten
Brechungsindex-
Raman-Verfahren
Verfahren
15Ergebnisse: Wiederkennung von Medikationen
UMG
Getestete Medikationen Trägerlösung: aqua ad iniectabilia
Glucose 40%
Insulin 1iE/ml - Glucose 40%
Insulin 2iE/ml - Glucose 40%
Insulin 4iE/ml - Glucose 40%
Insulin 8iE/ml - Glucose 40%
Insulin 15iE/ml - Glucose 40%
NaCl 20% Noradrenalin 6mg/50ml - Aqua a. i.
NaCl 10%
NaBiC 8,4%
KCl 7,46%
Medikation
Glucose 5%
Insulin 1iE/ml - Glucose 5% Noradrenalin 3mg/50ml - Aqua a. i.
Medikation
Insulin 2iE/ml - Glucose 5%
Insulin 4iE/ml - Glucose 5%
Insulin 8iE/ml - Glucose 5% Raman-inaktiv
Insulin 15iE/ml - Glucose 5%
Insulin 15iE/ml - NaCl 0,9% Raman-aktiv Aqua ad iniect.
Liquemin(Heparin) 500iE/ml - NaCl 0,9%
Insulin 8iE/ml - NaCl 0,9%
Insulin 4iE/ml - NaCl 0,9%
1,3327
1,3328
1,3329
1,3330
1,3331
1,3332
1,3333
Insulin 2iE/ml - NaCl 0,9%
Insulin 1iE/ml - NaCl 0,9%
Noradrenalin 6mg/50ml - NaCl 0,9%
Noradrenalin 3mg/50ml - NaCl 0,9%
NaCl 0,9%
Noradrenalin 6mg/50ml - Aqua a. i. Fehlerbalken: Brechungsindex
Noradrenalin 3mg/50ml - Aqua a. i.
Aqua ad iniect.
Messgenauigkeit des
Refraktometers
1,3 1,31 1,32 1,33 1,34 1,35 1,36 1,37 1,38 1,39 1,4
Brechungsindex
16
Fazit
Entwicklung eines Analyseautomats basierend auf Raman-
Spektroskopie und Refraktometrie
Auswertung von Raman-Spektren durch Signalformanalyse
Entwicklung eines Algorithmus für die Datenfusion
Untersuchungen in Universitätsmedizin Göttingen zeigen:
Analyseautomat kann Medikationen wiedererkennen
Hochverdünnte Medikationen (Noradrenalin, Insulin) können
noch nicht mittels Raman unterschieden werden
17Einleitung
Lesen von Lateral-Flow-Tests unter Nutzung des
„Surface-Enhanced Resonance Raman Scattering“-Effekts (SERRS)
Aufbau des LFTs und Stellen, an denen Raman-Messungen erfolgt sind
Anwendung: Detektion von
Zytokinen, SEB und anderen
Veterinärmedizin
Quantifizierung
C T S
Sehr niedrige
Konzentrationen
Membran MP1
Testlinie Multiplexing soll möglich sein
Membran MP2
Kontrolllinie
18
Funktionsprinzip Lateral-Flow-Test
19SERS-Spektroskopie
Elektromagnetische Theorie
• Resonanz von Oberflächenplasmonen und
Anregungswellenlänge
• Nanostrukturierte Oberfläche oder Nanopartikel (häufig Au
oder Ag)1
• Verstärkung der elektrischen Feldstärke bis Faktor 108
(Reichweite 10 nm)
Laserlicht = oszillierende elektromagnetische Welle
führt zu Ladungstrennung in metallischen
Nanopartikeln
Anregung von Oberflächenplasmonen
Verstärkung elektrisches Feld an
Nanopartikeln Resonante Anregung in elektronischen Übergang des
Feldverstärkung besonders groß an Polen und Raman-Marker – Resonanz Raman(RR) Effekt
Spitzen
Aufbau SERS-Marker mit Gold-Nanosternen: Kombination von SERS (108) und RR(103) ergibt SERRS (1011)
1) Wackerbarth H., Klar U., Günther W., Hildebrandt P., Novel time-resolved surface-enhanced (resonance) Raman spectroscopic technique for studying the dynamics of
interfacial processes: Application to the electron transfer reaction of cytochrome c at a silver electrode, Applied Spectroscopy, 53, (3) 283-291, 1999. 20
Resonanz Raman Effekt
Absorptionsspectrum von
Oxymyoglobin
0.4
Häm
absorbance
0.2
0.0
300 400 500 600 700
wave length / nm
Häm ist Sonde für:
• Oxidationszustand
• Spinzustand
• Axiale Liganden
• Lokale Umgebung
21Verwendetes Raman-System
Kaiser Optical Systems Inc. (KOSI) – Invictus 785 nm Verwendete Betriebsparameter
Laserleistung am Messpunkt: 9,5 mW
Verwendeter Spektralbereich von 250
bis 1750 cm-1 da ansonsten schlechtes
Signal- zu Rausch-Verhältnis
Systemkalibrierung:
Wellenlänge,
Intensität,
Laserwellenlänge
22
Die Testmembrane
Material:
UniSart CN 140-Membran von miprolab
Nanosterne mit 2-Nitro-5-thiobenzoat als SERRS-Farbstoffmolekül: 0,76 pM
Blutplasmaproben als künstliche Matrix
Analyte: humanes Choriongonadotropin (hCG) und Staphylokokken-
Enteroxin-B (SEB)
Membranmaterial mit
aufgetropfter
Nanosternsuspension
LFT-Teststreifen nach Trocken
23Eigenschaften der Raman-Spektren
SERRS-Marker
zeichnen sich durch
scharfe Banden aus
Überlagerung durch
Signale der
Membran
Einfluss der Matrix
bisher gering
Raman-Verschiebung in cm-1
24
Quantifizierungungsversuche:
Separation der Markersignale
1. Differenzspektrum: SERRS-Marker-Spektrum = Gesamtspektrum – a ∙ Membranspektrum; a wird
so ermittelt, dass im Differenzspektrum keine unerwarteten Extremwerte auftauchen
2. Dekompositionsverfahren: Klassisch mit Lorentz- oder Gauß-Profilen
oder mit Wavelet-Verfahren
Nanosternsuspension
in Wasser
Verfahren des
überwachten Lernens
zum Glück nicht
notwendig!
25Quantifizierungsversuche anhand definiert
aufgetropfter Nanostern-Mengen
Vergleich der aus den Flächen der 1332 cm−1-Linie
bestimmten integrierten Intensität in Abhängigkeit der
SERS-Marker-Konzentration zwischen Differenz- und
Dekompositionsverfahren.
(Lorenz-Profile)
Membranmaterial mit aufgetropfter
Nanosternsuspension nach Trocken
26
Untersuchungen mit hCG-LFTs
Quantifizierbar
1. Testlinie
Nanosterne auch
außerhalb der Test-
bzw. Kontrolllinie
Differenzverfahren
2. Membran bisher am besten
geeignet
1 2 3 3. Kontrollinie
27Untersuchungen mit SEB als Analyt:
Quantifizierung anhand der SERRS-Signale der Nanosterne
8000
Basislinienkorrigierte Spektraldichte in Zählimpulsen
Bei Miprolab durchgeführter LFT-Versuch mit
0,0 µg / l SEB
7000 SEB als Analyten:
2,5 µg / l SEB
Messungen „ganz frisch“
6000
5,0 µg / l SEB 5 µl Gold-Nanostersuspension
5000 Spektren verschiedener Analytmengen
10,0 µg / l SEB
(Staphylokokken-Enteroxin-B, SEB)
4000 25,0 µg / l SEB Basislinienkorrektur: Gerade durch die
50 ,0 µg / l SEB Minima an den Grenzen des ausgesuchten
3000 Spektralbereiches
Raman-Punktmessung bei maximaler
2000 Signalhöhe, ermittelt durch manuelles
Abrastern
1000
Fazit: Quantifizierung sehr gut möglich, aber
0 Automatisierung erstrebenswert =>
1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 hyperspektrale Messung
Wellenzahl in cm-1
28
Untersuchungen mit SEB als Analyt:
Betrachtung der Kontrolllinie
8000
Basislinienkorrigierte Spektraldichte in Zählimpulsen
0,0 µg / l SEB
7000
2,5 µg / l SEB
6000
5,0 µg / l SEB
5000 10,0 µg / l SEB
4000 25,0 µg / l SEB
50 ,0 µg / l SEB
3000
2000
1000
0
1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800
Wellenzahl in cm-1
29Lösung des Auflösungsproblems
B C A: Messkopfseite
B: Laserseite
C: Spektrometer
A
30
Fazit
Nanosternsignale sind geeigent für anvisierte Nachweisgrenzen
Nanosternsignale können von Blutplasma und Membran differenziert werden
Auswertung der Raman-Spektren durch Differenzverfahren
Intensität von spezifischen Banden der Markermoleküle korreliert mit Menge – Quantitative
Analyse
31Projekte
Projekt PPA-LFT-Reader
„Entwicklung einer hochsensitiven Auswerteeinheit und chemometrischen Verfahren
für das Lesen von Lateral-Flow Tests unter Nutzung des "surface enhanced resonance
Raman Scattering"-Effekts (SERRS),“ gefördert vom BMWi
Patiensicherheit 4.0,
NMWK, 11-76251-99-33/12, Inkubationsvorhaben
Vielen Dank
32
Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit
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Hans-Adolf-Krebs Weg 1
D-37077 Göttingen Spektroskopie
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Mikroskopie
Erzeugen kurzer Laser-Pulse
und Nano-Strukturierung
EUV-Quellen und
Strahlpropagation
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