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LABORWELT
Nr. 1/2017 – 18. Jahrgang
Zellanalyse/
Screening
t u e ll im In t e rnet:
Ak
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30_LW1_02_Molecular-Devices.indd 1 23.03.2017 14:04:22 Uhr
Intro Zellanalyse/Screening
Krankheiten per Phänotyp- den USA zeigt. Grund dafür sind oft Zelllinien,
deren Identität nicht überprüft wurde. Wie
auf Seite VII berichtet, stuft das International
Screening nachstellen Cell Line Authentication Committee fast ein
Fünftel aller Zelllinien als fehlerhaft ausge-
wiesen ein. Nur ein Drittel aller Labore screent
zudem auf Zellkultur-Kontaminationen.
Thomas Gabrielczyk, Redaktion LABORWELT
Diagnostisches Screening
Seit Nature im Jahr 2011 berichtete, dass mehr als die Hälfte aller neu zugelassenen First-in-class-
Arzneistoffe zwischen 1999 und 2008 aus Phänotyp-Screenings, aber nur ein Drittel (34%) aus Angesichts grassierender Zivilisationskrankhei-
Target-basierten Screenings stammte (Nat. Rev. Drug Discov. 10, 507–519), wächst das Interesse ten werden Studien zur Biomarkeridentifikation
an den Schrotschuss-Ansätzen wieder – besonders weil die Konkurrenz um die durch Arzneien und -validierung immer wichtiger. Denn die
ansprechbare Targets immer stärker wird und neue Methoden wie die 3D-Zellkultur, robotische Mi- Gesundheitssysteme sind finanziell nicht
kroskopie-Read-outs und immer leistungsfähigere IT verbesserte Auswertungsmethoden bieten. dazu in der Lage, die Behandlung Lebensstil-
Zwar ist der der target- und damit hypothesenbasierte Ansatz erste Wahl in der Pharmaindustrie, assoziierter und rasch zunehmender Volks-
deren Datenauswertungen daher auch genau das gegenteilige Bild ergeben, aber die Verbindung krankheiten wie Typ-2-Diabetes künftig voll
fortgeschrittener Zellbiologie mit schneller und präziser Bildgebung gewinnt an Reiz. zu finanzieren. Prävention und Früherkennung
mittels Screeningtests sind gefragt.
Ein IMI-Konsortium sucht und validiert
Dementsprechend sagen Marktprognosen Erst unlängst ist es mit Hilfe eines phänoty- derzeit mit Hilfe großer Kohortenstudien pro-
des weltgrößten Analysehauses Markets & pischen siRNA-Screens Wissenschaftlern des gnostische und Verlaufsmarker für das Stoff-
Markets dem Screeningmarkt auch ein steti- Deutschen Krebsforschungsinstitut (DKFZ) wechselleiden, wie auf Seite VI nachzulesen.
ges Wachstum von fast 8% pro Jahr bis 2021 in Heidelberg geglückt, ein Protein zu identi- Biolumineszenzassays, die die für Diabe-
voraus. Nach dem Report „High-Throughput fizieren, das die angeborene Immunreaktion tes 2 charakteristische Insulinresistenz von
Screening Market by Technology”, wächst gegen Virusinfektionen reguliert und Auto- Leber-, Muskel- und Fettzellen via Messung
der Weltmarkt im Zeitraum von 2016 bis immunreaktionen eindämmt (vgl. Interview der Glukose-Aufnahmerate genauso gut aber
2021 von derzeit 12,2 Mrd. auf 18,8 Mrd. US- Seite IV). risikoärmer diagnostizieren als radioaktive
Dollar. Allein 2,2 Mrd. US-Dollar davon soll Metastasierungsschalter, Krebsresistenz- Assays, beschreibt der Beitrag auf Seite VII.
bis 2019 allein die 3D-Zellkultur ausmachen. mechanismen etc. werden immer öfter in
Dreidimensionalen Zellklumpen (Sphäroiden) Phänotyp-Screenings gefunden und potenti-
wird nachgesagt, die bei der Entstehung elle Targets im Anschluss identifiziert – voraus- Neue Wege des Screenings
von Krankheiten relevante morphologisch- gesetzt das eingesetzte Zellmaterial stellt die
physiologische Mikroumgebung wesentlich physiologische Situation tatsächlich adäquat Auf dem Weg zu patientenorientierten Dia-
besser nachzustellen als die vielgenutzten nach und die eingesetzten Trigger stimmen. gnostikverfahren hat die Pharmind-Initiative
2D-Kulturen oder zellbasierte Assays, beson- des Bundesforschungsministeriums ganz
ders in der Krebsforschung. Erstaunliches hervorgebracht: Mikrobiologen
Welche Herausforderungen der Read-out Qualitätskontrolle wichtig der Universität Würzburg haben zusammen
bei Assays mit inhomogenen Zellklumpen mit der PolyAn GmbH einen Kaugummi entwi-
anstelle von Einzelzellen mit sich bringt und Selbst fortgeschrittene Technologien drohen ckelt, der Infektionen mit antibiotikaresisten-
wie sich diese lösen lassen, davon berichten aber oft an völlig Selbstverständlichem zu ten Bakterien über den Geschmack anzeigt.
Abb.: Tecan
Spezialisten von Molecular Devices in dieser scheitern, wie die große Debatte um die Re- Weitere Diagnostikinnovationen finden sich
Ausgabe (Seite XII). produzierbarkeit translationaler Forschung in in dem Bericht auf Seite VIII.
LABORWELT 18. Jahrgang | Nr. 1/2017 | III
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Zellanalyse/Screening Interview
RNAi-Screen findet vermehrung. Wir konnten zeigen, dass im
Verlauf einer Virusinfektion DAPK1 durch den
RIG-I-Signalweg mit einer gewissen zeitlichen
Immunregulator Verzögerung aktiviert wird. Aktive DAPK1
wiederum inaktiviert die Sensorfunktion von
RIG-I, indem es das Protein phosphoryliert.
Es handelt sich also um einen klassischen
RIG-I, ein Sensor des angeborenen Immunsystems für virale 5‘-ppp-dsRNA, sorgt dafür, dass negativen Feedback-Mechanismus.
bei Virusinfektionen rasch die Interferon-I-Antwort des Immunsystems startet: Unzählige
Abwehrmoleküle werden produziert, und das Virus kann nicht weiter replizieren. Durch einen LABORWELT
siRNA-Screen des RIG-I/IRF3-Signalweges ist es einer Arbeitsgruppe am DKFZ jetzt geglückt, Was bedeuten Ihre Resultate für die Behand-
ein Protein zu identifizieren, das die Immunreaktion wieder ins Lot bringt (Molecular Cell, lung von Virusinfektionen und von Krebs?
doi: 10.1016/j.molcel.2016.12.021). Über die Bedeutung der Entdeckung sprach LABORWELT
mit Studienleiter Dr. Marco Binder vom Deutschen Krebsforschungszentrum in Heidelberg. Binder
Obgleich unsere Arbeiten nicht auf eine Be-
handlung abzielten, zeigen sie jedoch mögli-
LABORWELT Interferonausschüttung signifikant modulier- che Anwendungen auf. Negative Regulatoren
Herr Dr. Binder, was hat Sie motiviert, nach ten. Die stärkste hemmende Wirkung zeigte der Interferonsynthese wie DAPK1 könnten
Inhibitoren des RIG-I-Pathways zu suchen? die Kinase DAPK1. etwa genutzt werden, um die Wirkung von
RIG-I Agonisten, die von der Firma Rigontec
Binder LABORWELT für die Krebsimmuntherapie eingesetzt
Da muss ich ein wenig ausholen. Die Entde- Was kam bei der experimentellen Untersu- werden, auf die Interferon-Antwort besser
ckung von RIG-I als Sensor für Virus-RNA und chung dieser Kinase heraus? einzustellen. Die potentiell bedeutendste
Induktor der antiviralen Interferonantwort Anwendung sehe ich aber in der Behandlung
im Jahr 2004 fiel in die Zeit, als ich am He- Binder von Autoimmunkrankheiten wie dem Lupus
patitis C-Virus forschte. Ob und mit welcher Nachdem wir das Ergebnis des Screenings, erythematodes, die mit einer permanenten
Konsequenz das RIG-I-System dieses Virus das DAPK1 als RIG-I-Gegenspieler identifiziert, Ausschüttung von Interferon einhergehen.
tatsächlich erkennt, ist trotz großer Anstren- nochmals experimentell verifiziert hatten, Daneben sind unsere Ergebnisse auch für das
gungen auch von unserer Seite bis heute schauten wir uns die Relevanz in zwei human- Gebiet der viral bedingten Krebserkrankun-
nicht ganz klar. Wir konnten damals aber pathogenen Viren an. Sowohl im Rift-Valley- gen interessant. Bisher ist etwa völlig unklar,
einen Beitrag dazu leisten zu verstehen, wie Fieber-Virus als auch im Influenzavirus zeigte weshalb mit dem Hepatitis C-Virus Infizierte
das Sensormolekül RIG-I sicherstellt, nur vira- DAPK1 eine deutliche Wirkung auf die Virus- ein erhöhtes Leberkrebsrisiko haben. Neue
le und keine zelleigene RNA zu erkennen. Wir Untersuchungen bei anderen Krebsarten
haben unsere Arbeiten dann stärker auf die haben unlängst gezeigt, dass die Aktivierung
zellbiologische Regulation des Signalweges von DAPK1 zu einer starken Beschleunigung
fokussiert, der zur massiven Ausschüttung des Tumorwachstums führt, wenn zugleich
von Interferon führt. Da eine permanente der Tumorsuppressor p53 mutiert ist. Wir
systemische Interferonausschüttung zu star- möchten sehr gerne überprüfen, ob das bei
ken Nebenwirkungen und Autoimmunkrank- Leberkrebs ebenfalls der Fall ist.
heiten führt, haben wir uns gefragt, wie es
dem Körper bei einer Virusinfektion gelingt, LABORWELT
lokal so schnell und so viel Inter feron Wie sehen Ihre nächsten Schritte und Ihr
auszuschütten, dass die Virusinfektion be- Fernziel aus?
grenzt wird, er zugleich aber rechtzeitig die
Interferon-Ausschüttung herunterfährt, so Binder
dass systemische Effekte unterbleiben. Wie Ich bin mir relativ sicher, dass DAPK1 nicht
die Zelle diesen Spagat bewerkstelligt, ist der einzige Regulator der Interferonaus-
derzeit noch völlig unklar. schüttung ist. Daraufhin werden wir jetzt
die verbleibenden 21 Kinasen untersuchen,
LABORWELT die unser Screening identifiziert hat. Span-
Wie sind Sie methodisch vorgegangen? nend dabei finde ich, dass darunter auch
Dr. Marco Binder Kinasen aus physiologisch komplett ande-
Binder leitet seit 2014 die Forschungsgruppe ren Zusammenhängen zu finden sind, wie
Wir haben mit Hilfe eines siRNA-Screens Dynamik der Virusreplikation und der etwa dem Energiestoffwechsel. Parallel
untersucht, welche humanen Kinasen an der angeborenen antiviralen Immunantwort dazu werden wir analysieren, ob sich eine
Regulation der Interferon-Antwort beteiligt am Deutschen Krebsforschungszentrum. Assoziation von DAPK1 und Leberkrebs nach-
sind. Zu diesem Zwecke haben wir mit einem Im Zentrum der Arbeiten steht die Frage, weisen lässt. Ist dies der Fall, werden wir
automatisierten Mikroskopieassay die Trans- weshalb die angeborene Immunantwort dem experimentell nachgehen. Die damit
lokation des Transkriptionsfaktors IRF3 vom bei manchen Viren erfolglos bleibt, die verbundene Vision ist, die Interferonant-
Zytoplasma in den Zellkern gemessen, der die Infektion daher chronisch wird und lang- wort mit DAPK1-Wirkstoffen so zu modu-
Abb.: DKFZ
Interferontranskription anschaltet. Am Ende fristig sogar zu Krebs führen kann. lieren, dass das Risiko von HCV-Infizierten
ließen sich 22 Kinasen identifizieren, die die sinkt, an Leberkrebs zu erkranken.
IV | 18. Jahrgang | Nr. 1/2017 LABORWELT
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Zellanalyse / Screening IMI-Projekt Rhapsody
Um diese Ziele zu erreichen, führen die Rhapso-
dy-Partner Studien zur Biomarkeridentifikation
und -validierung durch, die das Fortschreiten
vom Prä-Diabetes zum Vollbild T2D und somit
den Krankheitheitsverlauf von T2D anzeigen.
Multi-OMICS zur Identifikation und
Charakterisierung kausaler Biomarker
Im Rahmen dieser Aktivitäten werden Multi-
OMICS-Analysen an Geweben und Organen
von T2D-Betroffenen im Rahmen großer
europäischer Kohortenstudien durchgeführt.
Der Multi-OMICS-Ansatz umfasst Genomics,
Risikoanalyse und Proteomics, Metabolomics und Lipidomics.
Die in Dresden ansässige Lipotype GmbH
übernimmt dabei den Part der Lipidomics-
Prognose von Diabetes Analysen. Lipotype ist eine Ausgründung aus
dem international renommierten Max-Planck-
Institut für Molekulare Zellbiologie und Genetik
in Dresden (Labore von Prof. Kai Simons und Dr.
Dr. Kirsten Leufgen, SCIPROM Sàrl, und Dr. Oliver Uecke, Lipotype GmbH Andrej Shevchenko). Lipotype bietet umfassen-
de, quantitative Lipidanalysen für klinische und
biologische Proben im Hochdurchsatz. Lipotype
Rhapsody (Risk Assessment and ProgreSsiOn of DIabetes) ist eine Public Private Partnership, wird mit der Lipotype Shotgun Lipidomics Tech-
die von der Innovative Medicines Initiative (IMI) und Unternehmen der European Federation of nology umfassende Lipidprofile im Blutplasma
Pharmaceutical Industries and Associations (EFPIA) gefördert wird. Partner des Konsortiums sind und Serum für 3.000 prädiabetische Personen
Pharmaunternehmen, akademische Einrichtungen und KMU. Das Projekt untersucht das Risiko in vollständig charakterisierten Kohorten be-
für das Fortschreiten von Prä-Diabetes hin zu Typ 2-Diabetes (T2D), einer Epidemie mit aktuell stimmen, die als Anzeichen für das Fortschrei-
285 Millionen Patienten weltweit. Prognosen gehen von einem starken Anstieg auf 439 Millionen ten von T2D verwendet werden können.
T2D-Patienten weltweit bis 2030 aus, vermehrt auch in der jüngeren Bevölkerung.
Auswirkungen für die Diagnostik
Die Innovative Medicines Initiative ist ein maunternehmen und zwei KMU sind offizielle und Therapie von T2D
einzigartiges Public Private Partnership der Partner des IMI-Projektes Rhapsody Das Rhapso-
Pharmaindustrie, die durch EFPIA repräsen- dy-Team wird von den Universitäten Lausanne Die Aktivitäten von Rhapsody werden zur Identi-
tiert wird, und der Europäischen Kommission. und Lund sowie den Unternehmen Servier und fikation und Weiterentwicklung neuer Biomarker
Das übergeordnete Ziel von IMI ist es, Europa Sanofi koordiniert. Das Team arbeitet an einer zur verbesserten T2D-Klassifizierung beitragen,
wieder als einen weltweit führenden Standort molekularen Taxonomie des Typ-2-Diabetes, die pharmazeutische Entwicklung unterstüt-
für Pharmaforschung zu etablieren. Durch den mit dem Ziel, eine Einteilung in Patientengrup- zen und den Einsatz personalisierter Medizin
Abbau von Barrieren bei der Erforschung neuer pen zu unterstützen, das Design von klinischen ermöglichen, um die Gesundheit in Europa und
Medikamente soll ein wichtiger Beitrag für die Studien zu optimieren sowie regulatorische weltweit zu verbessern.
Wirtschaft und Gesellschaft geleistet werden. Wege zu etablieren, die die Einführung neuer
Führende europäische Experten aus 20 Strategien für Prävention und Behandlung Weitere Details unter:
akademischen Einrichtungen, vier EFPIA-Phar- ermöglichen. http://imi-rhapsody.eu
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Abb.: Lipotype
Arbeitsablauf der Lipotype Shotgun Lipidomics-Technologie
VI | 18. Jahrgang | Nr. 1/2017 LABORWELT
34_LW1_06_Lipotype_tg.indd 6 23.03.2017 14:08:12 Uhr
Promega_AZ_Laborwelt_170213.qxp_Layout 1 14.02.17 15:0
Glukoseaufnahme-Assay
für das Wirkstoffscreening Analyse des
Energiestoffwechsels
Christian Walczuch, Promega GmbH, Mannheim der Zelle
Ob Krebs oder Typ 2-Diabetes: Die Quantifizierung der erhöhten Glukoseaufname entarteter
Zellen oder des verminderten Glukosetransports in insulinresistente Zielzellen kann genutzt
werden, um die Wirkstoffe zu screenen. Promegas Glucose Uptake-Glo™ Assay bietet einen
schnellen Biolumineszenzassay auf Basis des Nachweises von 2-Desoxyglukose-6-phosphat
(2DG6P) in Säugerzellen.
Neben seiner Funktion als Hauptenergie- und den entgleisten Hormon-, Zucker- und
• Glucose-Uptake
quelle für zahlreiche Zellen und Organismen Fettstoffwechsel zu normalisieren. • Glucose
agiert Glukose auch als wichtiges Signal-
molekül für die Genregulation, Enzymakti- • Lactat
vität und Hormonausschüttung. Bei dieser Radioaktive Methode lange Zeit
biologischen Funktionsvielfalt ist es nicht der Goldstandard • Glutamin
verwunderlich, dass eine eingeschränkte oder • Glutamat
übermäßige Glukoseaufnahme immense Um die Glukoseaufnahme von Zellen zu unter-
Auswirkungen auf Zellen und den Organis- suchen, galt die radioaktive Nachweismethode
mus hat und so Krankheiten wie Krebs oder aufgrund ihrer Sensitivität lange Zeit als Gold- Hochsensitive und robuste
Diabetes begünstigt. standard. Radioaktive Tests sind mit erhöhten lumineszente Nachweisverfahren
Kosten und speziellen Sicherheits- und Entsor-
gungsvorschriften verbunden. Kolorimetrische Einfache „Add-mix-measure“
Veränderten Glucosebedarf und Fluoreszenz-Assays erhöhen zwar die Protokolle
erkennen und behandeln Sicherheit bei der Anwendung, bieten jedoch
nicht die Sensitivität eines radioaktiven Tests.
Krebszellen gewinnen laut der Warburg-
Hypothese ihre Energie auch in Anwesen-
heit von Sauerstof f durch Glykolyse. Im Alternative zu kolorimetrischen
Vergleich zur oxidativen Phosphorylierung und Fluoreszenz-Tests
in den Mitochondrien hat dies eine deut-
liche geringere ATP-Ausbeute zur Folge. Promega entwickelte deshalb den biolumines-
Um diesen Mangel auszugleichen und eine zenten Glucose Uptake-Glo™ Assay. Dieser ist
ausreichende Glukoseaufnahme für das einfach anzuwenden und mit der Sensitivität
Tumorwachstum zu gewährleisten, erhöhen der radioaktiven Methode vergleichbar. Glucose Uptake-GloTM Assay
Krebszellen die Anzahl an Glukoserezeptoren Der Nachweis basiert auf einem Glukose-
auf ihrer Zelloberfläche. Das durch die Gly- Analogon, das nach Zugabe zur Zellkultur von 250.000 Hypoxie
kolyse vermehrt in der Zelle produzierte und den Zellen aufgenommen, umgewandelt und Normoxie
ausgeschleuste Lactat schädigt umliegende als stabiles Derivat intrazellulär angehäuft 200.000
gesunde Zellen. wird. Durch die anschließende Lyse der Zellen
Im Gegensatz zu den Tumorzellen zeichnet wird das Derivat ins Medium freigesetzt und
sich Typ 2-Diabetes durch eine verringerte mit Hilfe eines Detektionsreagens anhand 150.000
RLU
Insulin-Sensitivität der Muskel-, (Leber-) und eines messbaren Lichtsignals quantifiziert. Der
Fettzellen und damit verbundener ernied- Glucose Uptake-Glo™ Assay lässt sich in allen 100.000
rigter Glukose-Aufnahme über induzierte gängigen Plattenformaten einsetzen und kann
Transportproteine aus. mit weiteren Assays kombiniert werden.
In beiden Fällen unterstützen Glukose- 50.000
aufnahme-Assays Wissenschaftler bei der
Entwicklung neuer Behandlungsmöglichkei- Kontakt 0
ten. Während bei Tumoren die Wirksamkeit
neuer Wirkstoffe zur Hemmung der Glukose- Promega GmbH MCF7 Zellen wurden bei 1% Sauerstoff für 24 Stunden
kultiviert. Der Glucose Uptake-Glo™ Assay weißt die
aufnahme von Krebszellen im Vordergrund Dr. Michaela Mack
Aufnahme von Glucose nach, was auf eine erhöhte
steht, zielt die Behandlung von Typ 2-Diabe- Schildkrötstr. 15, 68199 Mannheim Glykolyse aufgrund von Hypoxie hinweist.
tes auf eine Erhöhung der Insulinsensitivität +49(0)-621 8501-164
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Zellanalyse / Screening Schnelldiagnostik
Screenings neu gedacht automatischen quantitativen Analyse erfolg-
ten, steht nun die Weiterentwicklung dieser
Plattform an, deren Kommerzialisierung
über eine Firmenneugründung erfolgen soll.
Dr. Anke Kopacek, DiagnostikNet-BB e.V., Hennigsdorf Künftige Anwendungsgebiete reichen von
der Detektion spezifischer Erreger bis hin
zu komplexen Multiparameter-Assays, um
Screening-Tests erlauben es, Patientengruppen mit spezifischen Merkmalen zu identifizieren. zum Beispiel akute von latenten Infektionen
So lassen sich etwa jene herausfiltern, die ein hohes Erkrankungsrisiko tragen. Screenings zu unterscheiden oder unterschiedliche
ermöglichen es aber auch, Pathogene zu identifizieren und Patienten so einer spezifischen Antikörperklassen nachzuweisen, etwa bei
Therapie zuzuführen. Hier hat die Universität Würzburg zusammen mit der PolyAn GmbH der Detektion des Impfstatus. Besonderes
aus Berlin eine einzigartige Plattform entwickelt, die schnell und effektiv eine Diagnose Augenmerk gilt der Entwicklung mobiler Sys-
erlaubt: den Kaugummi-Schnelltest. teme für Point-of-Care-Anwendungen.
Dabei handelt es sich um einen Test, den jedem und jederzeit – also auch ohne Energie- Zirkuläre RNA als Biomarker
Ärzte aber auch Patienten selbst durchführen versorgung – anwendbar und eröffnet damit
können. Das Prinzip: Ist der Mundraum eines eine neue Dimension der Schnelldiagnostik. Der Detektion eines bisher wenig eingesetz-
Patienten mit Pathogenen wie Methicillin- Der Konzeptnachweis ist im Model erfolg- ten, aber vielversprechenden Moleküls wid-
resistenten Staphylococcus aureus besiedelt, reich etabliert, die ersten klinischen Studien met sich die Arbeitsgruppe um Prof. Dr. Frank
wird beim Kaugummi-Kauen ein Geschmack- befinden sich in Vorbereitung. Bier vom Fraunhofer IZI-BB in Potsdam: der
stoff frei, den der Patient wahrnimmt. Da die zirkulären RNA (circRNA). Dahinter verbirgt
Sensoren auf der Zunge Geschmacksstoffe sich eine neue Klasse endogener ringförmiger
nur im gelösten Zustand wahrnehmen, wird Glykanbasierte und kovalent geschlossener RNA-Moleküle,
im Testsystem etwa eine stark bitter schme- Multiparameter-Diagnostik die eine ungewöhnlich hohe Stabilität im Blut
ckende Substanz über einen peptidbasierten aufweisen. Zudem zeigen Untersuchungen,
Linker auf kleinen Polymethylmethacrylat- Einen neuartigen Ansatz verfolgen auch die dass das Expressionsmuster von circRNAs
Kugeln immobilisiert und in den Kaugummi Scienion AG und die MicroDiscovery GmbH mit der Alzheimer-Erkrankung assoziiert sein
eingebracht. Der Bitterstoff lässt sich dann aus Berlin. Sie entwickeln eine innovative könnte. Um den Nutzen von circRNAs genau
nur von jenem Enzym hochspezifisch ab- Diagnostikplattform basierend auf Glykan- zu bestimmen, ist es erforderlich, diese qua-
spalten, welches für das nachzuweisende Microarrays. Glykane sind bedeutsam für litativ und quantitativ an möglichst vielen
Pathogen charakteristisch ist: Der Patient molekulare Interaktionen und relevant als Probanden im klinischen Umfeld zu detek-
„schmeckt“ den Erreger. diagnostische Marker. Diese lassen sich nun tieren: mit Hilfe von Microarrays.
auch für die Entwicklung spezifischer Tests
nutzen, da es der Arbeitsgruppe um Prof. Dr.
Entscheidungshilfe mit Mehrwert Peter Seeberger am Max-Planck-Institut für Prostatakarzinom: Liquid Profiling
Kolloid-und Grenzflächenforschung erstmals
Damit liefert der Kaugummi ein qualitatives gelungen ist, einen Automaten für die Glykan- Bisher gibt es keine Methode, die zum Zeit-
Ergebnis, das dem Arzt zu entscheiden hilft, Synthese zu entwickeln. punkt der Diagnose sicher jene Patienten
welche weiterführende Diagnostik oder The- Nachdem bereits erfolgreich Arbeiten zur identifiziert, die an einem therapiebedürf-
rapie indiziert ist. Das System ist überall, von qualitätsgesicherten Produktion sowie zur tigen Prostatakarzinom leiden. Die Arbeits-
gruppe um Prof. Dr. Berend Isermann und
Dr. Juliane Hoffmann von der Universität
Magdeburg zielt daher darauf ab, eine Platt-
form zu entwickeln, die über den Nachweis
genetischer und/oder epigenetischer Aber-
rationen im peripheren Blut jene Patienten
identifiziert, die einer Behandlung zugeführt
werden müssen. Dieser Ansatz kombiniert
die nichtinvasive, blutbasierte Diagnostik
von Nukleinsäuren („liquid profiling“) mit
innovativen Technologien.
Alle Projekte wurden im Rahmen des Zwan-
zig20-Forums PARMENIDes – Initiative für
personalisierte Diagnostik und Medizin vom
BMBF finanziell unterstützt.
Abb.: iStock photos/ nyul
Kontakt:
a.kopacek@diagnostiknet-bb.de
VIII | 18. Jahrgang | Nr. 1/2017 LABORWELT
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Expertenpanel Zellanalyse / Screening
Expertenpanel: vom Dr. Philip
Gribbon
Target zum Kandidaten ist der Koordinator
des EU-Open-
screen-Konsor-
tiums am Berliner
Dr. Philip Gribbon, EU-Openscreen, Berlin; Thomas Langer, Universität zu Köln FMP.
Die spannendsten zellbiologischen Entdeckungen finden meist in der Akademia statt. Für
die Weiterentwicklung fehlen aber oft die Ressourcen und Partner. Was moderne Scree- LABORWELT
ningmethoden leisten können und wo Grundlagenforscher sie in Anspruch nehmen können, Wo finden Zellbiologen mit interessanten
beleuchten zwei ausgewiesene Experten für LABORWELT: Targets in Europa Ressourcen für das Drug
Screening?
chondrialen Struktur begünstigt, die durch Gribbon
Prof. Dr. mitochondrialen Proteasen und die Spaltung Die Suche nach neuen Wirkstoffen erfordert
Thomas Langer des Dynamins OPA1 reguliert werden. Die eine enge Zusammenarbeit von Chemikern
ist Koordinator des Analyse des mitochondrialen Proteoms in und Biologen sowie aufwendige Methoden
Sonderforschungs- Zellen, denen die Rhomboidprotease PARL und teure Geräte für das hierzu notwendige
bereiches 1218 der fehlt, erlaubte jetzt, auch dieser Protease Hochdurchsatzscreening. Zur Optimierung
DFG, CECAD For- eine entscheidende Bedeutung während erforderlicher Arbeitsabläufe haben Wissen-
schungszentrum, der Apoptose zuzuordnen (S. Saita et al., Nat. schaftler aus europäischen Forschungsein-
Universität zu Köln. Cell Biol ., 2017: DOI: 10.1038/ncb3488). Dabei richtungen und Universitäten die Initiative
kamen zwei massenspektroskopische Metho- EU-OPENSCREEN (www.eu-openscreen.eu) ins
den zum Einsatz: die Charakterisierung des Leben gerufen. Diese hat zum Ziel, die für die
LABORWELT mitochondrialen Proteoms durch quantitati- Erforschung neuer biologisch aktiver Subs-
Wie können Proteomanalysen mitochondria- ve, labelfreie Massenspektroskopie sowie die tanzen erforderlichen Screening-Plattformen
ler Proteasen helfen, neue Apoptoseregulato- Bestimmung der N-Termini mitochondrialer in Europa zusammenzuführen und eine von
ren zu identifizieren? Proteine durch das sogenannte ChaFRADIC- allen Partnern gemeinsam genutzte Substanz-
Abb.: Universität zu Köln (unten), EU-Openscreen (oben)
Verfahren. Diese Ansätze führten zur Iden- sammlung mit 150.000 ausgewählten chemi-
Langer tifizierung des pro-apoptotischen Proteins schen Verbindungen aufzubauen. Biologen,
Mitochondrien sind von zentraler Bedeutung Smac/DIABLO als Substrat der Protease die für ihre Fragestellung geeignete Assays
für den Stoffwechsel. Sie leiten jedoch nach PARL. Die Prozessierung von Smac/DIABLO entwickelt haben, suchen an diesen Screening-
Aktivierung der Apoptose auch den Zelltod ist Voraussetzung für dessen Freisetzung aus Plattformen systematisch nach Substanzen,
ein, indem pro-apoptotische Proteine aus den Mitochondrien während der Apoptose, die die gewünschte Wirkung in ihren biologi-
dem Intermembranraum der Mitochondrien ein essentieller Schritt des apoptotischen schen Systemen zeigen. EU-OPENSCREEN un-
freigesetzt werden. Die Freisetzung des Programms. Diese Untersuchungen identifi- terstützt hierbei das Finden des bestmöglichen
pro-apoptotischen Proteins Cy tochrom c zieren die mitochondriale Rhomboidprotease Screening- und Medizinalchemie-Partners
wird dabei durch Änderungen der mito- PARL als neuen Apoptoseregulator. sowie das Einwerben von Drittmitteln.
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Zellanalyse / Screening Zellkultur
Zum Experten für erkennen und zu beseitigen – umso mehr da
Forscher sie selbst tagtäglich ins Labor ein-
schleppen. Experimentelle Ergebnisse könnten
Zellkulturen werden ansonsten zu irreführenden oder nicht reprodu-
zierbaren Aussagen führen oder gar falsch sein.
Um dies zu verhindern, sollten daher sämtliche
Zellkulturen regelmäßig auf Mykoplasmen ge-
Dr. Samira Schroeder, Eppendorf AG, Hamburg testet werden, zum Beispiel mittels PCR, ELISA
oder mikrobiologischer Kulturmethoden.
Wer denkt, dass nur andere von Mykoplas-
Wann immer mit Zellen gearbeitet wird, sind die experimentellen Bedingungen, sowie die men-Kontaminationen betroffen sind, sei
Zellen selbst, so unterschiedlich, dass nicht selten unerwünschte Ergebnisse erzielt werden. gewarnt: Umfragen verschiedener Zellbanken
Die Standardisierung von Zellkulturtechniken kann helfen, Herausforderungen in der Zellkul unter Zellkultur-Nutzern haben ergeben, dass
tur zu bewältigen. Kontaminationen etwa stellen weltweit eine der größten Probleme dar. lediglich rund 30% aller Zellkulturlabore über-
Das gilt nicht nur für Kontamination mit Mikroorganismen, sondern auch für häufig unent haupt auf Mykoplasmenkontamination testen.
deckt bleibende Kreuzkontaminationen mit anderen eukaryotischen Zellen. Eine weitere Abschätzungen in der wissenschaftlichen Lite-
große Herausforderung aufgrund natürlicher Schwankungen in biologischen Ausgangs ratur zufolge sind etwa 5% bis 30% aller Zelllini-
materialen ist die Reproduzierbarkeit wissenschaftlicher Experimente. en weltweit mit Mykoplasmen kontaminiert.
Beschrieben ist aber auch, dass Labore, die
regelmäßig testen, die Kontaminationsrate
Kontaminationen mit Mikroorganismen, wie Kontaminationsarten inklusive deren Quellen signifikant reduzieren konnten. Zugleich
Bakterien, Pilzen, Hefen und Mykoplasmen in und Nachweismethoden sind dagegen häufig erhöhte sich die Reproduzierbarkeit der dort
der Zellkultur sind allseits gefürchtet. Leider weniger bekannt. So können Mykoplasmen zum gewonnenen Ergebnisse. Denn Mykoplasmen
handelt es sich dabei auch um ein weit verbrei- Beispiel aufgrund ihrer Größe von nur 0,1 bis können nahezu jeden Parameter innerhalb des
tetes Problem, über das kaum jemand reden 0,3 µm nicht mit Hilfe der Hellfeldmikroskopie Zellkultursystems beeinflussen.
mag, da (unentdeckte) Kontaminationen als erkannt werden (siehe Abb. 1). Ihre fehlende Zell- Möglicherweise vermittelt die durchaus noch
unsauberes Arbeiten ausgelegt werden können wand ermöglicht es zudem, dass sie Standard- verbreitete prophylaktische Verwendung von
und somit möglicherweise die wissenschaftli- Membranfilter mit Porengrößen von 0,2 µm Antibiotika ein trügerisches Gefühl der Sicher-
che Reputation gefährden. passieren können. Dadurch, dass Mycoplasmen heit. Dieses begünstigt die Verbreitung der My-
sich gut verformen können, passen sie auch koplasmen. Forschungsgruppen zahlen dafür
noch bequem durch die Poren, wenn sie größer einen hohen Preis: Ohne Gegenmaßnahmen
Zellkulturplatten und ihre Bewohner als 0,2 µm sind. Deswegen sollten immer Filter kann die Besiedelung mit Mykoplasmen sehr
verwendet werden, die geeignet sind, diesen viel einfacher unbemerkt überhandnehmen. Im
In den meisten Fällen können Kontaminationen Eigenschaften entgegenzuwirken. Gefühl der Sicherheit wird im schlimmsten Fall
mit Mikroorganismen mikroskopisch nachge- Auch die Farbe des Mediums zeigt keine die gute Laborpraxis unbemerkt vernachlässigt,
wiesen werden. Im schlimmsten Fall ist eine sichtbare Veränderung, anhand derer eine und das Risiko von Kontaminationen wächst.
Kontamination so offensichtlich, dass das Me- Mykoplasmen-Kontamination erkannt werden Wer mehr darüber wissen will, wie sich
dium sich bereits verfärbt und eintrübt. Andere könnte. Dabei ist es enorm wichtig, diese zu Kontamination in der Zellkultur erkennen,
vermeiden und beseitigen lässt, findet im
Internet ein neues Informationsangebot: die
neue Cell Handling-Website von Eppendorf
(www.eppendorf.com/cellexperts). Hier fin-
den Interessierte Informationen zu typischen
Herausforderungen in der Zellkultur, aber auch
mögliche Herangehensweisen und Lösungen.
Stöbern in einem virtuellen Labor (Abb. 2), zeigt
auf, wo potentielle Kontaminationsgefahren
lauern, und wie sie sich vermeiden lassen. Hier
werden auch verschiedene Methoden für den
Nachweis von Mykoplasmen in der Zellkultur
dargestellt und wissenschaftlich bewertet.
(Download: QR-code, Seite XI, links).
Ist es noch die ursprüngliche Zelllinie
oder schon HeLa?
Gerade wenn neue Zellen nicht von einer of-
fiziellen Zellbank stammen, sind einige Dinge
Abb.: Eppendorf
zu beachten, bevor diese in die Routine über-
Abb. 1: Verschiedene Mikroorganismen und ihre Größen, darunter auch Mykoplasmen, führt werden. Basierend auf den Daten des
welche nicht mehr mittels Hellfeldmikroskopie erkennbar sind. ICLAC (International Cell Line Authentication
X | 18. Jahrgang | Nr. 1/2017 LABORWELT
38_LW1_10-11_Eppendorf_2.indd 10 23.03.2017 14:11:56 UhrZellkultur Zellanalyse / Screening
der geeigneten Methode zur Authentifizierung
der Zellen. Werden die grundlegenden Arbeits-
weisen für den richtigen Umgang mit Zellen
im Labor beachtet, kann das Risiko einer Kreuz-
kontamination oder einer falsch identifizierten
Ziellinie deutlich verringert werden.
Zellen stets exakt gleich behandeln
Um Vorgänge in einer Zelle in vivo zu studieren,
muss eine physiologische Umgebung möglichst
realistisch in der Zellkultur nachgestellt werden.
Die Verwendung von In-vitro-Zellkulturen als
biologisches Testsystem erfordert daher stren-
ge Anforderungen an sämtliche Parameter,
die die Expansion und Proliferation sowie das
Differenzierungspotential von Zellen definie-
ren. Problematisch für die Vergleichbarkeit von
Abb. 2: Virtuelles Labor. Aufgezeigt werden potentielle Kontaminationsquellen und mögliche Daten ist in diesem Zusammenhang, dass sich
Vermeidungsstrategien. Protokolle in verschiedenen Laboren weltweit
häufig stark voneinander unterscheiden. Sogar
Committee) wird geschätzt, dass 15% bis 20% anderen sind sich viele dieser Gefahr gar nicht innerhalb eines Labors kann es vorkommen,
aller Zelllinien weltweit falsch identifiziert sind bewusst. Dies ist eine äußert unglückliche Kom- dass unterschiedliche Personen verschiedene
beziehungsweise nicht mehr der Ausgangs- bination. Das Risiko der Verunreinigung einer Protokolle verwenden.
Zelllinie entsprechen. Angesichts dieser Zahlen Zelllinie mit fremden Zellen ist ebenso groß wie Um personenunabhängig besser vergleich-
gibt es Bestrebungen, Zelllinien verpflichtend das einer mikrobiellen Kontamination. Deshalb bare Daten von In-vitro-Studien zu generieren
zu authentifizieren. So haben die NIH (National ist sterile Arbeitsweise oberstes Gebot. und damit die Reproduzierbarkeit von Ergebnis-
Institutes of Health, USA) Anfang 2016 eine Darüber hinaus gibt es weitere Möglich sen zu maximieren, ist eine Standardisierung
Richtlinie erlassen, der zufolge nur noch Pro- keiten, das Kontaminationsrisiko zu minimie- in der Zellkulturpraxis unerlässlich. Die Regeln
jekte gefördert werden, wenn die verwendeten ren: Neue Zelllinien sollten bis zur Überprü- für „Gute Zellkulturpraxis“ (GCCP) sollen dabei
Zellen zuvor authentifiziert wurden, also ihre fung ihrer Identität in Quarantäne gehalten unterstützen, Daten weltweit vergleichbarer
Identität bestätigt ist. Auch einige Journale werden. Vor der Überführung in die Routine zu machen.
gehen vermehrt dazu über, diesen Nachweis sollten außerdem eine Master-Zellbank sowie Die Verwendung spezieller Formulare mit
vor der Publikation von Forschungsergebnissen eine Arbeits-Zellbank angelegt werden. Die Schritt-für-Schritt-Anleitungen (sogenannte
einzufordern. Master-Zellbank dient dann auch als Referenz Standardarbeitsanweisungen; englisch: Stan-
Was aber ist der Grund dafür, dass ein so zum regelmäßigen Abgleich mit den Zellen in dard operating procedures, SOPs) können da-
hoher Anteil an Zelllinien mit anderen Zellen der Routine. So kann ermittelt werden, ob sich bei helfen, die bestmögliche Genauigkeit und
kontaminiert ist? Zum einen ist eine Konta- die Zelllinie über die Zeit verändert hat. Eine Präzision von Arbeitsabläufen sicherzustellen.
mination mit Zellen anderer Zelllinien in der lückenlose Dokumentation der einzelnen Char- Dabei ist es empfehlenswert, regelmäßig drei
Routinearbeit kaum zu erkennen (Abb. 3), zum gen ist hierbei ebenso wichtig wie die Auswahl wesentliche Aspekte zu berücksichtigen, näm-
lich Informationen über
(1) die Identität einer Zelllinie,
(2) deren Kulturbedingungen und
(3) die einzelnen Abläufe der Kultivierungen.
Um wertvolle Informationen über eine Zellli-
nie zu dokumentieren, wie etwa Zelltyp und
Herkunft oder verwendetes Medium, Wachs-
tumsoberfläche und Zellzahlen oder Zellvita-
lität, können Zellprofil-Formulare verwendet
werden, wie auf eppendorf.com/reproducibility
zur Verfügung gestellt (Download; QR-Code
Seite XI, rechts).
Abb. 3: Die Original-Zelllinie (grau), welche zunächst mit anderen, schneller wachsenden
Abb.: Eppendorf
Zellen verunreinigt wurde und anschließend nach und nach durch diese verdrängt
wird. Die resultierende Zelllinie entspricht nicht mehr der ursprünglichen, was rein
visuell häufig kaum erkennbar ist.
LABORWELT 18. Jahrgang | Nr. 1/2017 | XI
38_LW1_10-11_Eppendorf_2.indd 11 23.03.2017 14:14:00 UhrBUCHH
C`]\JZ`\eZ\j)'(-&(. Konfokale Bildgebung
BXg`kXc#I\Z_k#Ki\e[j
D\[`q`ek\Z_e`b#9`fk\Z_efcf^`\le[
von 3D-Sphäroiden
G_XidXjfi^\ej\`kAX_i\e]ijkXY`c\j
NXZ_jkldle[\i]]e\e`ek\i\jjXek\
D^c`Z_b\`k\e]ii\e[`k\kiZ_k`^\
im Hochdurchsatz
@em\jkd\ekj%;`\j\j9lZ_Y`\k\k\`e\
Oksana Sirenko, Research Scientist, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA
lem\iq`Z_kYXi\#]Xbk\ei\`Z_\|Y\ij`Z_k
Y\i[\eJkXe[[\i[\lkjZ_\eC`]\$
JZ`\eZ\j$9iXeZ_\jfn`\\`e\I\`_\mfe Beim Screening nach potentiellen Krebstherapeutika besteht ein wachsendes Interesse
=XZ_Xl]jkq\ed`kPERFEKTE SYMBIOSE
Direkte Darstellung Ihrer Mikroskop-
bilder in höchster Qualität
Abb. 2: (Oben) Projektion mit dem best-Fokus-Algoritmus von 15 VOLL INTEGRIERT
Bildern eines mit Weitfeldoptik aufgenommenen HCT116- Keine Scheibenöffnung für
Sphäroids. Die Software-Segmentierung zählte 817 Zellker- das Mikroskop notwendig
ne. Traten Verzerrungen durch unfokussierte Fluoreszenz
an den Sphäroidrändern und schlecht abgebildete dunkle
Zellen im Zentrum auf, wurden die Zellkerne nicht erfasst.
(Unten) Best-Focus-Projektion von 15 Bildern eines HCT116-
Sphäeroids, die mit konfokaler Optik aufgenommen wur-
den. Eine genauere Anzahl von 1.078 Kernen wurde gezählt.
von Unschärfen oder Hintergrundsignalen von oberhalb und un-
terhalb der Bildebene,
l Sofortige Analyse der Bilder, um aussagekräftige Ergebnisse zu
erhalten, aus denen weitere Schlussfolgerungen gezogen werden
können.
TOUCH-STEUERUNG
des Mikroskops
Sphäroidbildung und -behandlung
Mit dem folgenden Verfahren haben wir Sphäroide aus den Krebs-
zelllinien HCT116, DU145 und HepG2 gewonnen. Die Zellen wurden
bei 37°C unter 5% CO2 in Kulturflaschen kultiviert, anschließend
abgetrennt und auf 96- oder 384-Well-Platten mit schwarzem Rand,
klarem Boden und U-förmigen Wells (Corning 4520 beziehungs-
weise 3830) in entsprechenden Medien angesetzt, die mit fötalem
Kälberserum (FBS) supplementiert wurden. Die Zelldichte betrug PERFEKTE SYMBIOSE
1.000 bis 1.500 Zellen pro Well. Innerhalb von 24 Stunden bildete
sich auf dem Boden jedes Wells ein einzelnes Sphäroid, das zwei MADE IN GERMANY
bis vier Tage bei 37°C und 5% CO2 wachsen konnte (vgl. Abbildung
1), bis es für Experimente eingesetzt wurde. Die Sphäroide können
Claire mit integriertem Mikroskop
zwar noch länger kultiviert werden, aber die zunehmende Größe für die sichere Begutachtung
kann die Durchfärbung und das Abbilden der im Zentrum gelegenen
Zellen behindern.
von Zellkulturen
Wir beschreiben hier Assays, mit denen die Wirkung der Antikrebs-
substanzen Etoposid, Paclitaxel und Mitomycin C ermittelt werden
Abb.: Molecular Devices
kann. Zur Behandlung der Sphäroide wurden die Substanzen in
zehnfacher Konzentration in die Wells zugesetzt. Die anschließen-
de Inkubation dauerte ein bis vier Tage – je nach Mechanismus, der
untersucht werden sollte. Zur Untersuchung der Apoptose wurden
LABORWELT www.berner-safety.deZellanalyse/Screening Sphäroid-Assays
Dadurch wird das Hintergrundsignal verklei-
nert, das durch fluoreszierende Objekte ober-
halb und unterhalb der Ebene erzeugt wird.
In der Regel wird auch eine bessere Auflösung
der feinen Details auf subzellulärer Ebene
oder zwischen den Zellen erzielt, die wie in
einer 3D-Struktur gehäuft oder gestapelt
übereinanderliegen. Mit einem konfokalen
Bild ist häufig eine genauere Segmentierung
möglich. In wiederholten Experimenten mit
Sphäroiden wurden bei der Segmentierung
von Zellkernen in mit Weitfeldoptik erfassten
Bildern etwa 20% weniger Zellkerne gezählt
als in mit Konfokal-Optik erzeugten Bildern
(vgl. Abbildung 2).
Screening von Antikrebsmitteln
mit einem Apoptose-Assay
Eine Klasse von Krebsarzneien zielt auf den
extrinsischen Signalweg der Apoptose, um
den Zelltod auszulösen. In einem Assay zur
Messung der Apoptose wurden HCT116-Sphä-
Abb. 3: (Oben) Montage mit Miniaturansichten von HCT116-Sphäroiden auf einer 96-Well- roide, die drei Tage lang in 96-Well-Platten
Platte, die mit Substanzen behandelt und mit einem 10-fach-Plan-Fluor-Objektiv kultiviert worden waren, 24–48 Stunden
aufgenommen wurden. Mit Hoechst gefärbte Zellkerne (blau) sind mit dem Apopto- lang mit einer Verdünnungsreihe von vier
semarker CellEvent Caspase 3/7 (grün) überlagert. Die unbehandelten Kontrollen sind verschiedenen Krebswirkstoffen behandelt.
in Spalte 4 aufgeführt. Eine Caspase 3/7-Reaktion zeigt sich in den Spalten 5–7, wo Nach Abschluss der Behandlung wurde die
1 µM Paclitaxel in Reihe A in einer Konzentrationsreihe auf 1:3 verdünnt wurde (je- Apoptose mit den Reagenzien CellEvent
weils drei Replikate). (Links) Elf z-Ebenen wurden mit Maximum Projection in einem Caspase und MitoTracker Orange von Life
2D-Bild kombiniert und mit einem einfachen anwendungsspezifischen Modul ana- Technologies detektiert. Die Medien in den
lysiert. Die Rohbilder zeigen mit den entsprechenden Segmentierungsmasken einen Wells wurden dann mit einem Vierfach-
niedrigen und hohen Grad an Apoptose (royalblau = Kerne, rosa = apoptotische Zel- Cocktail der kombinierten Färbemittel, dar-
len). (Rechts) Durch Normalisieren des Apoptosevorkommens im Vergleich zu unbe- unter Hoechst-Zellkernfärbemittel, versetzt.
handelten Sphäroiden und Darstellung in einem Diagramm wird erkennbar, dass zur Hierbei wurden Färbemittel eingesetzt, die
Induzierung von Apoptose mit Paclitaxel (grüne Linie) eine viel niedrigere Konzentra- keinen Waschschritt erfordern, um eine
tion erforderlich ist als mit Mitomycin C oder Etoposid. Störung der Sphäroide zu vermeiden (vgl.
Abbildung 3).
kürzere Einwirkzeiten, für die multipara- tion oder Störung der Sphäroide zu ver-
metrische Untersuchung der Zytotoxizität meiden.
längere Einwirkzeiten gewählt. Bei einer Die Sphäroide wurden mit dem ImageX- Multiplex-Assay des mitochondrialen
Inkubation von mehr als zwei Tagen wurde press Micro High-Content Imaging System Membranpotentials im Screen
die Substanz alle zwei Tage in einfacher (Molecular Devices) bei 10- oder 20-facher
Konzentration erneuert. Vergrößerung visualisiert. Um die Reaktionen In dem oben beschriebenen Apoptose-Screen
der Zellen in der gesamten 3D-Struktur zu kann das mitochondriale Membranpotential
analysieren, wurden Bilder aus verschiede- auch durch Zugabe von MitoTracker Orange
Färbung und Abbildung nen Tiefenschichten des Sphäroid-Körpers zum Färbemittel-Cocktail bestimmt wer-
von Sphäroiden zu einem Stapel zusammengefasst. Der den. Alternativ können Substanzen, die das
Bilderstapel wurde dann mit Hilfe eines ma- Tumorwachstum durch Einwirkung auf den
Die hier gezeigten Beispiele stammen aus der thematischen Algorithmus zu einem einzigen Mitochondrien-Stoffwechsel hemmen, ge-
Entwicklung eines HCT116-Sphäroid-Assays, 2D-Projektionsbild kombiniert („kollabiert“). trennt untersucht werden. Veranschaulicht
mit dem morphologische Veränderungen der In diesem Fall wurde das kollabierte Bild mit wird dies durch einen Assay mit Antimycin
Sphäroide sowie das Auftreten apoptotischer dem Maximum-Projection-Algorithmus der A, einem wirksamen Disruptor des mito-
Zellen im Well erfasst werden können. Nach MetaXpress High-Content Image Acquisi- chondrialen Membranpotentials. Nach vier
Abschluss der Behandlung mit den Wirkstof- tion and Analysis Software generiert. Zur Stunden Behandlungszeit war der Zustand
fen wurden die Farbstoffe in einem einzigen Erzeugung der Projektion werden hierbei der Mitochondrien anhand der Intensität
Cocktail mit vier- bis sechsfacher Konzen- die Pixel mit der größten Intensität in dem von MitoTracker Orange in den Sphäroid-
Abb.: Molecular Devices
tration zusammengeführt und die Medien Stapel beibehalten. Zellen nachweisbar. Entweder war MitoTra-
in den Wells direkt damit versetzt. Hier- Die konfokale Optik bietet die Möglichkeit, cker nicht vollständig in das Zentrum der
bei wurden Farbstoffe eingesetzt, die keine einen schmaleren optischen Schnitt des großen Sphäroide vorgedrungen, oder die
Waschschritte erfordern, um eine Disrup- Sphäroids abzubilden als die Weitfeldoptik. Zellen im Zentrum wiesen keine intakten
XIV | 18. Jahrgang | Nr. 1/2017 LABORWELT
40_LW1_12-15_Molecular-Devices_tg.indd 14 23.03.2017 14:20:01 UhrMitochondrien auf, worauf das allgemein dunklere Erscheinungsbild
im Inneren auf der Mitochondrien-Wellenlänge der Bilder hinweist
(vgl. Abbildung 4).
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Schnell-Screening von 3D-Sphäroiden
auf Mikrotiterplatten
Zur Vereinfachung von aussagekräftigen Prüfverfahren für chemo-
therapeutische Wirkstoffkandidaten sind zwei Faktoren von großer
Bedeutung: einerseits die Fähigkeit von In-vivo-3D-Kultursystemen,
Sphäroide menschlicher Krebszellen von einheitlicher Größe zu pro-
duzieren, und andererseits die Möglichkeit, die Reaktionen der Sphä-
roide auf die Behandlung mit automatisierten Hochdurchsatz-High-
Content-Bildgebungsverfahren zu untersuchen. Das ImageXpress
Micro High-Content Confocal Imaging System und die MetaXpress
Image Analysis Software ermöglichen eine schnelle Bildgebung und
Analyse von 3D-Sphäroiden auf Mikrotiterplatten zum Nachweis
von induzierter Apoptose und mitochondrialer Toxizität von Krebs-
medikamenten.
Weitere Informationen zur Optimierung der Aufnahmeparameter
in Sphäroid-Screening-Assays finden sich in: Sirenko, O. et al., High-
Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D
Cancer Spheroid Cultures. Assay and Drug Development Technologies,
2015, 13 (7): 402–414.
Kontakt
Lars Hofmann (Germany South)
lars.hofmann@moldev.com
Hans-Joerg Behrendt (Germany North)
hans-joerg.behrendt@moldev.com
Molecular Devices GmbH
www.moleculardevices.com
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H̡]LHQWHUXQGOHLFKWHUDXWRPDWLVLHUEDU
Q Kein Phenol/Chloroform
Q Kein Ionenaustauscher
Q Keine Spin-Filter-Säulen
Q Keine Silika- bzw. Magnetpartikelsuspensionen
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Abb. 4: Toxische Wirkung von Antimycin A auf Mitochondrien.
(Oben) Überlagerung der Färbemittel Hoechst (blau) und
MitoTracker (orange) bei Sphäroiden, die mit Antimycin A www.analytik-jena.de
in steigenden Konzentrationen von 1, 22, 67 und 200 nM
Abb.: Molecular Devices
behandelt wurden. (Unten) Darstellung von durchschnittli-
chen Intensitätswerten von Mitochondrien, die im
Sphäroid identifiziert wurden. Dies illustriert die Wirkung
der Substanz.
LABORWELT
40_LW1_12-15_Molecular-Devices_tg.indd 15 23.03.2017 14:20:09 UhrService Verbände
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www.bts-ev.de und der weltweit führende RNA-Forscher und Vogel (Institut f. Molekulare Infektionsbiologie)
Infektionsbiologe Prof. Dr. Jörg Vogel (Würz- der Julius-Maximilians-Universität Würzburg.
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Deutsche Gesellschaft Star-Trio zu Gast in Berlin / Termine
für Neurogenetik
www.hih-tuebingen.de/dgng/ Am 11. Mai 2017 bietet der Treffpunkt In- Termin-Hinweis: Am 18. Mai 2017 lädt das
vitro-Diagnostik die Gelegenheit, drei interna- DiagnostikNet-BB zum 6. Forum Companion
Netzwerk Nutrigenomik tional renommierte Experten der serologischen Diagnostics Network in den CoLaborator
Allergiediagnostik bei einem Vortragsabend im der Bayer Pharma AG in Berlin. Dort stellen
www.nutrigenomik.de Magnus-Haus zu erleben – in der Zeit von 18.00 Experten aus Klinik und Forschung innovati-
bis 20.15 Uhr mit anschließendem Get-together. ve Projektideen vor, die auf die Entwicklung
DiagnostikNet-BB
Prof. Harald Renz vom Universitätsklinikum biomarkerbasier ter Diagnostika für die
Gießen/Marburg führt mit der Keynote „Perso- personalisierte Medizin fokussieren. Zudem
www.diagnostiknet-bb.de nalisierte Therapie in der Allergologie – neuer widmen sich Experten des Netzwerks aus
Stellenwert der Diagnostik“ in den Abend ein. Patent- und Medizinrecht themenbegleitend
Verband der
Diagnostica-Industrie e.V. Danach spricht Prof. Jörg Kleine-Tebbe vom aktuellen regulatorischen Aspekten. Neben
Allergie- und Asthmazentrum Berlin-Westend einem ausgewählten Vortragsprogramm
www.vdgh.de über „Allergiediagnostik auf dem Prüfstand: bietet das Forum ausreichend Gelegenheit,
Qualität, Standards und Ringversuche“. Die miteinander ins Gespräch zu kommen und
Österreichische
Reinraumgesellschaft Vortragsrunde beschließt Prof. Edzard Spillner gemeinsam Förderprojekte zu initiieren. Wei-
(ÖRRG) von der Universität Aarhus, Dänemark, mit dem terführende Informationen zum Programm
www.oerrg.at
Thema „Molekulare Aspekte und neue Strategi- und Details zur Anmeldung finden sich unter
Österreichische Ges.
en der antikörperbasierten Allergie-Diagnostik“. www.companion-diagnostics.eu
f. Laboratoriums- Interessierte können sich unter www.eveeno.
medizin & Klinische Chemie com/Treffpunkt-Allergien registrieren. Anmel- a.kopacek@diagnostiknet-bb.de
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44_LW1_16-17_Verbände_Wiss_tg.indd 16 23.03.2017 14:20:42 UhrLABVOLUTION
Diagnostik world of labs.
Mikrobiomscreening als Biomarker
■ Neue Fachmesse für
Mit 45 Millionen Betroffenen allein in den innovative Laborausstattung
USA ist das Reizdarmsyndrom (IBS) die häu- und Labor-Workflows
figste Magen-Darm-Indikation weltweit. Die
■ smartLAB – das intelligente
Behandlung des von Medizinern oft herunter-
gespielten Leidens könnte einfacher sein, als Labor der Zukunft
bisher gedacht, berichteten Wissenschaftler ■ 3D-Printing in Science
des Nestlé-Forschungszentrums in Lausanne
und Partner dreier kanadischer Universitäten 16. – 18. Mai 2017
Anfang März (Science Translational Medicine, doi:
Hannover ▪ Germany
0.1126/scitranslmed.aaf6397).
Vorerst in Tierexperimenten haben die For- labvolution.de
scher um Premysl Bercik entdeckt, dass die Nei-
gung von Reizdarmpatienten Angststörungen
zu entwickeln, ganz offensichtlich mit ihrer
Darmflora zusammenhängt. Transplantierten
sie die Darmbakterien von IBS-Patienten mit ve n t
nce s E
Angstsymptomen in keimfreie Mäuse, zeigte sen mit IBD-Mikrobiome eine Signatur von 22 mit Lif
e Scie
A
abweichend exprimierten Genen und sieben CHNIC
sich ganz Erstaunliches. Die Transplantation BIOTE
führte in den Mäusen nicht etwa nur zu IBS- Blutmetaboliten. Die meisten betroffenen
typischen Symptomen, wie etwa beschleu- Gene betrafen Entzündungs- und Immunmo-
nigtem Magen-Darmtransit des Speisebreis, dulatoren, einige aber auch die Entwicklungs-
Durchfällen oder unterschwelligen Entzün- steuerung von Neuronen.
dungen, sondern auch zu Angststörungen. Auf Basis ihrer Ergebnisse empfehlen die Neuer Termin:
Obgleich sich die Bakteriengemeinschaften Forscher nun, Therapieansätze zu prüfen, die Mai 2017
der verschiedenen Probanden stark ähnelten die Mikrobiome von IBS-Patienten modifizie-
ließen, fanden die Wissenschaftler in den Mäu- ren und Risikopatienten zu screenen.
Patientenstratifizierung
Roches PD-L1-Assay misst anders
Rückschlag für die in der personalisierten Tumor-infiltrierenden Immunzellen mit einer
Abb.: Roche (unten), American Society of Microbiology (oben)
Medizin führende Roche AG? Ausgerechnet Übereinstimmung von 86,8% und 97% erfass-
der vom Diagnostikarm Ventana entwickelte ten, lag Ventanas neues SP142-Assay weit da-
immunhistochemische PD-L1-Test zur Stra- runter. Ob die von AstraZeneca verbreiteten
tifizierung Lungenkrebskranker vor Krebs Ergebnisse indes die analytische Ähnlichkeit
immuntherapie mit Atezolizumab misst in Frage stellen, war von den Briten nicht zu
offenbar anders als entsprechende Tests der erfahren. Das ist aber vielleicht auch nicht so
Konkurrenten AstraZeneca (SP263-Assay, wichtig, denn das US-Unternehmen Flagship
Ventana), Merck & Co. (22C3-Assay, Dako) Biosciences LLC will auf dem AACR-Meeting
und Bristol Myers Squibb (28-8-Assay; Dako). im April eine Software vorstellen, die die Er-
Während die drei Tests die PD-L1-Expression in gebnisse aller Assays vergleichbar macht.
LABORWELT
44_LW1_16-17_Verbände_Wiss_tg.indd 17 23.03.2017 14:24:27 UhrSie können auch lesen
