E ekte des PPAR β-/δ-Agonisten GW0742
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Universität Ulm
Institut für Anästhesiologische Pathophysiologie und Verfahrensentwicklung (APV)
Institutsleitung: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Peter Radermacher
Eekte des PPAR β-/δ-Agonisten GW0742
auf Organmorphologie und Funktion der
Niere im Modell des septischen Schocks beim
Schwein
Dissertation
Zur Erlangung des
Doktorgrades der Medizin
der Medizinischen Fakultät
der Universität Ulm
leer
Vorgelegt von: Matthias Alexander Reize
aus Karlsruhe-Durlach
2019
Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth 1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Dr. h.c. Peter Radermacher 2. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Miriam Kalbitz Tag der Promotion: 09.07.2021
Meinem Vater
Präambel Teile dieser Dissertation wurden bereits in folgenden Fachartikeln veröentlicht: Nussbaum B L, McCook O, Hartmann C, Matallo J, Wepler M, Antonucci E, Kalbitz M, Huber-Lang M, Georgie M, Calzia E, Radermacher P, Hafner S: Left ventricular function during porcine-resuscitated septic shock with pre-existing atherosclerosis, In- tensive Care Med Exp 4: 14 (2016) Riedesser S: Ein uss von EMD008 auf Ischämie-/Reperfusionsschäden der Niere nach thorakaler Aortenokklusion am Groÿtiermodell., Open Access Repositorium der Uni- versität Ulm. Dissertation. http://dx.doi.org/10.18725/OPARU-33861 (2020) Wepler M, Hafner S, Scheuerle A, Reize M, Gröger M, Wagner F, Simon F, Matallo J, Gottschalch F, Seifritz A, Stahl B, Matejovic M, Kapoor A, Möller P, Calzia E, Georgie M, Wachter U, Vogt J A, Thiemermann C, Radermacher P, McCook O: Eects of the PPAR-β/δ agonist GW0742 during resuscitated porcine septic shock, Intensive Care Medicine Experimental 1: 9 (2013)
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis II
1 Einleitung 1
1.1 Die Sepsis und der septische Schock . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2 Die Rezeptorklasse PPAR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.3 Versuchsmodell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.4 Zielsetzung der Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
2 Material und Methoden 7
2.1 Verwendete Materialien und Geräte . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.2 Studiendesign . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.3 Systemische Hämodynamik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.4 Systemischer Metabolismus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.5 Nierenfunktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.6 Western Blot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.7 Datenverarbeitung und statistische Auswertung . . . . . . . . . . . . . 26
3 Ergebnisse 28
3.1 Allgemeines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.2 Systemische Veränderungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.3 Renale Veränderungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.4 Western Blots . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
4 Diskussion 40
4.1 Auswertung der Daten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.2 Ursachensuche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
4.3 Bewertung des Modells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
5 Zusammenfassung 54
6 Literaturverzeichnis 56
I
Abkürzungsverzeichnis
AKI acute kidney injury - eine akute Einschränkung der Nie-
renfunktion
BGA Blutgasanalyse - ein Schnelltestverfahren für Gaspartial-
drücke, Säure-Basen- und Elektrolyt-Haushalt
CKD chronic kidney disease - chronische Niereninsu zienz
CLP cecal ligation and puncture - ein Sepsismodell bei dem
Versuchtieren das Coecum versorgende Blutgefäÿe ligiert
werden und anschlieÿend eine Punktion des betreenden
Darm-abschnittes erfolgt
CO cardiac output - HZV; siehe dort
CSE cystathionine-γ-lyase - ein Di-Hydrogen-Sul d bildendes
Enzym
DMSO Dimethylsulfoxid - ein organisches Lösungsmittel und Trä-
gersubstanz des untersuchten Agonisten
EDTA Ethylendiamintetraacetat - ein chemischer Komplexbild-
ner
EGDT Early Goal-Directed Therapy - ein Behandlungsprotokoll
bei Sepsis
EGTA Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N´,N´-tetraessig
säure - ein chemischer Komplexbildner
ELISA Enzyme-linked Immunosorbent Assay - ein antikörperba-
siertes Nachweisverfahren
EMSA Electrophoretic Mobility Shift Assay - eine A nitätselek-
trophorese zum Nachweis von DNA- oder RNA-bindenden
Proteinen
II
EPO Erythropoetin - ein Glykoprotein-Hormon, das als Wachs-
tumsfaktor für die Bildung roter Blutkörperchen von Be-
deutung ist
FBM-Schweine familial hypercholesteremia, Bretoncelles, Meishan - eine
besondere Züchtung; für Details siehe Abschnitte 1.3.1 so-
wie 2.2.1
GCS Glasgow Coma Scale - eine Skala zur Abschätzung einer
Bewusstseinsstörung
GFR glomeruläre Filtrationsrate - ein Maÿ für die Nierenfunk-
tion
HE-Färbung Hämatoxylin-Eosin-Färbung - eine histologisches Färbe-
verfahren bei dem basophile Strukturen blau und acido-
phile Strukturen rot angefärbt werden
HES Hydroxy-Ethyl-Stärke - eine Kolloidlösung zur Anhebung
des kolloidosmotischen Drucks im Gefäÿsystem
HF Herzfrequenz
HZV Herzzeitvolumen - gepumptes Blutvolumen pro Minute
iNOS induzierbare NO-Synthase - ein Enzym, das die Bildung
von Stickstomonoxid katalysiert
ITBV intrathorakales Blutvolumen - ein Messparameter zur Be-
urteilung der Volumenbelastung des Organismus
KHK koronare Herzkrankheit - eine Gefäÿerkränkung der Herz-
versorgenden Blutgefäÿe
MAP mean arterial pressure - der mittlere arterielle Druck
MPAP mean pulmonary arterial pressure - mittlerer Druck im
pulmonalarteriellen Gefäÿsystem
III
MQTiPSS Minimum quality threshold in pre-clinical sepsis studies
MZP Messzeitpunkt
NGAL neutrophilengelatinase assoziiertes Lipocalin - früher Bio-
marker für ein akutes Nierenversagen
PAOP pulmonary artery occluded pressure - Lungenarterienver-
schlussdruck, entsprechend dem Druck im linken Vorhof
und damit der linksventrikulären Vorlast
PAS Periodic acid-Schi reaction - eine Färbetechnik mit Per-
iodsäure und Schischem Reagenz zur Anfärbung von Gly-
kogen, Cellulose, Glykolipiden, Muko- und Glykoprotei-
nen sowie neutralen Mukopolysacchariden
paVK peripher arterielle Verschlusskrankheit
PBS-Puer phosphate-buered saline - eine Puerlösung mit einge-
stelltem pH-Wert von 7,4
PiCCO Pulse Contour Cardiac Output - dt. Pulskontur-Herzzeit-
volumen; ein Messverfahren, mit dem, nach vorheriger Ka-
librierung durch Thermodilution, anhand einer Pulskon-
turanalyse das Herzzeitvolumen und andere Werte errech-
net werden
PPAR peroxisome proliferator-activated receptor - ligandenab-
hängige Transkriptionsfaktoren
PPRE PPAR response element - der DNA-Abschnitt an den PPAR
binden
RXR Retinoid-X-Rezeptoren - ligandenabhängige Transkripti-
onsfaktoren
SDS sodium dodecyl sulfate - Natriumdodecylsulfat, ein anio-
nisches Tensid
IV
SIRS systemic in ammatory response syndrome - eine systemi-
sche Entzündungsreaktion des Körpers
SOFA-Score Sepsis-related organ failure assessment score bzw. sequen-
tial organ failure assessment score - eine Maÿzahl zur Be-
urteilung des Ausmaÿes einer Organschädigung bei septi-
schen Patienten
TBS-Puer Tris-buered saline - ein zur Lösung von Proteinen ver-
wendeter Puer
TNF-α Tumornekrosefaktor-α - ein Zytokin, welches bei lokalen
und systemischen Entzündungen beteiligt ist
TR Thyroidrezeptor - ligandenabhängige Transkriptionsfak-
toren
ZVD zentraler Venendruck
V
1 Einleitung
Inhalt dieser Dissertation ist die Untersuchung der Eekte des PPAR-β/δ-Agonisten
GW0742 auf Organmorphologie und -funktion der Niere im Modell des septischen
Schocks beim Schwein in einem intensivmedizinischen Setting.
Insbesondere wird hier im Bereich der Komorbiditäten Augenmerk auf den Ein uss
von parallel bestehender KHK gelegt, während auch eine Vielzahl anderer Komorbidi-
täten, wie beispielsweise Erkrankungen des respiratorischen Systems oder Malignitäten,
einen ähnlichen Eekt auf die Mortalität ausüben [107].
Unter intensivmedizinischer Therapie versteht sich in diesem Kontext die Nutzung
supportiver Maÿnahmen wie Volumengabe, sowie Administration von Vasopressoren.
Auÿerdem maschinelle Beatmung, die zusammen mit den Vorgenannten eine ausrei-
chende Oxygenierung der Gewebe zum Ziel hat.
Patienten mit polymikrobieller Sepsis wird im Allgemeinen eine schlechtere Prognose
zugesprochen. Das betrit sowohl die Mortalität, die Häu gkeit von Organversagen
bzw. die Schwere der Sepsis, als auch die Dauer des Aufenthaltes auf der Intensivstation
[91, 107, 127, 139].
1.1 Die Sepsis und der septische Schock
Sepsis ist de niert als lebensbedrohliche Organdysfunktion verursacht durch eine fehl-
geregelte Reaktion des Wirtes auf eine Infektion. (übersetzt aus Singer et al. 2016;
Seite 806 [133])
Als Ursache einer Sepsis ist das Eindringen von Pathogenen in den Kreislauf zu
sehen. Im Rahmen dessen kommt es zur überlappenden Aktivierung pro- und anti-
in ammatorischer Mechanismen [30, 150]. Darüberhinaus lässt sich eine verstärkte
Apoptose von Zellen des Immunsystems beobachten [20, 60, 147]. Die Depletion der
Immunzellen und eine Anergie der verbleibenden bedeuten eine Immunsuppression, die
den Patienten anfälliger für nosokomiale Sekundär-Infektionen macht [58, 77, 99]. Diese
Veränderungen scheinen zudem für längere Zeit (Monate bis Jahre) von Bedeutung zu
sein [23].
Auÿerdem zeigen sich Beeinträchtigungen von nicht direkt an der Immunabwehr be-
teiligten Regelkreisen, wie kardiovaskuläre, neuronale und metabolische [133]. Erhöhte
1Gefäÿpermeabilität sowie -dilatation sorgen trotz erhöhtem Herz-Zeit-Volumen für eine
Hypotension, die wiederum gemeinsam mit einer Dysfunktion des Gerinnungssystems
eine verschlechterte Mikrozirkulation und somit Zellschäden zur Folge hat [40].
Letztendlich kommt es zum Multiorganversagen [115]. Eine besonders häu ge Kom-
plikation mit immerhin über 40 % (-67 %) Koinzidenz auf Intensivstationen ist die
akute Niereninsu zienz (AKI) [3, 41, 160]. Die Mortalität der Sepsis ist beim Vor-
liegen einer AKI um den Faktor 6 bis 8 erhöht [41]. Dabei führt eine Sepsis zum
Funktionsverlust des Nierenparenchyms. Die Ausprägung und der Schweregrad dieser
akuten Niereninsu zienz sind wiederum ein Korrelat zum Vorliegen und dem Schwere-
grad der Sepsis [39, 160]. Morbidität, Mortalität, eine zusätzlich bestehende chronische
Nierenschädigung, die Wahrscheinlichkeit für und die Dauer von Beatmung und Inten-
sivaufenthalten korrelieren ebenfalls mit dem Vorliegen und der Ausprägung einer AKI
bei Sepsis [39, 160, 161].
1.2 Die Rezeptorklasse PPAR
Bei PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor) handelt es sich um ligandenab-
hängige Transkriptionsfaktoren. Sie stellen eine Unterfamilie in der Superdomäne der
nukleären Hormonrezeptoren dar [8, 37], die Heterodimere mit Retinoid-X-Rezeptoren
(RXR) bilden. Sie lagern sich nach Aktivierung durch einen entsprechenden Liganden
an das sog. PPRE (PPAR response element) in spezi schen DNA-Regionen an, um
Genexpressionen zu stimulieren oder zu inhibieren [8, 37, 93]. Sie spielen eine wich-
tige Rolle in vielen metabolischen und immunologischen Pathways. Sie sitzen an der
Schnittstelle vieler Regulationszyklen und beein ussen diese. Ihre Deaktivierung löst
LDL-Hypertriglyceridämie und verzögerte Wundheilung aus. Ebenso treten verringer-
te Masse von weiÿem und braunem Fettgewebe in KO-Mäusen auf [43]. Desweiteren
wirken sie regulatorisch auf Zelldierenzierung und -entwicklung und spielen eine Rolle
in der Tumorgenese, der Entstehung von Hypercholesterin- und -triglyceridämie, einer
gestörten Glukosetoleranz und weiteren metabolischen und zytologischen Regelkreisen
[8, 32, 37, 78, 104, 105, 122, 144]. Damit sind sie auch an der Pathogenese kardiome-
tabolischer Erkrankungen beteiligt [21, 37, 112].
21.2.1 PPAR-β/δ
Der Subtyp PPAR-β/δ ist einer von drei Isotypen; alpha, beta/delta und gamma. Wäh-
rend für die beiden anderen Subtypen bereits Medikamente zur Behandlung anderer
Indikationen zugelassen sind (PPAR-α: Fibrate zur Senkung der LDL-Cholesterin- und
Triglycerin-Plasmaspiegel, PPAR-γ: Glitazone zur Insulinsensitivierung bei Diabetes
mellitus Typ 2), gibt es für spezi sche PPAR-β/δ-Agonisten noch keine pharmakolo-
gische Zulassung. Für Endurobol (GW501516) gibt es zahlreiche Bezugsquellen im
Internet, jedoch wurde diese Substanz niemals als Arzneimittel zugelassen und steht
auÿerdem aufgrund seines karzinogenen Potentials in Kritik [74, 118]. Der Angiotensin-
Rezeptor-Antagonist Telmisartan führt ebenfalls zur Aktivierung verschiedener PPAR-
Subtypen, u.a. von PPAR-β/δ [34, 51, 81].
PPAR-β/δ wird nahezu ubiquitär exprimiert [10, 13, 36, 63]. Als endogene Liganden
binden an die PPAR verschiedene Fettsäuren und Prostaglandine und bewirken da-
durch unter anderem eine Hemmung mehrerer pro-in ammatorischer Genexpressionen
(iNOS, IL-1β, TNF-α) und des Transkriptionsfaktors NF-κB [6, 26, 31, 37, 47, 67, 143,
166]. Dadurch kann potentiell eine deutlich bessere Organfunktion in Stresssituationen
wie einer Ischämie oder Sepsis gewährleistet werden [24, 25, 63]. In ihrer Funktion als
Regulatoren der Glukoseutilisation und Insulinsensitivität sind sie ein lohnendes Ziel
zur Verbesserung der Prognose von Sepsis-Patienten [37, 152, 153, 154]. Insbesondere
bezüglich der Niere kommt die protektive Rolle von PPAR-β/δ-Agonisten zum Tragen.
Im Kaninchenmodell zeigte sich durch die gesteigerte Insulinsensitivität eine geringe-
re Schädigung der Niere [155]. Bei Ratten waren vergleichbare Eekte zu beobachten,
was sich in der verstärkten Schädigung der Niere in einer diabetischen Gruppe im
Vergleich zu normalen Tieren zeigte [22]. Bei PPAR-β/δ-KO-Mäusen waren ebenfalls
im Vergleich zu Wildtypen vermehrt Organschädigungen durch ischämischen Stress zu
beobachten [80]. In Kleintiermodellen zeigte sich eine gute Wirkung des PPAR-β/δ-
Agonisten GW0742, die mit verbesserten Werten in Physiologie sowie laborchemischen
Messwerten einherging. Durch eine verminderte In ammation und Stabilisierung des
Gerinnungssystems konnte die Organfunktion von Herz und Niere besser gewährleis-
tet werden [19, 24, 36, 46, 47, 62, 63], was direkt in einer besseren Überlebenschance
resultiert.
Der von uns genutzte PPAR-β/δ-Agonist GW0742 hat eine ca. 1000-fache Selektivi-
3tät gegenüber PPAR-α und PPAR-γ. Er aktiviert PPAR-β/δ ohne Koaktivierung der
anderen menschlichen Subtypen [141].
1.3 Versuchsmodell
1.3.1 Tiermodelle
Der Agonist GW0742 war in Kleintiermodellen sehr erfolgreich (vgl. Abschnitt 1.2.1).
Eine weitere Evaluation soll hier an dem Menschen phylogenetisch ähnlicheren Spezi-
es durchgeführt werden. Besonders wichtig für die Evaluation der in Abschnitt 1.2.1
erwähnten Studien ist hier der Punkt, dass die genannten Versuche ohne intensivmedizi-
nische Versorgung durchgeführt wurden. Supportive Therapie kann für sich genommen
schon einen sehr starken Ein uss auf die Überlebenswahrscheinlichkeit in Tiermodellen
der Sepsis haben [35, 56, 95, 106]. Demnach überleben bis zu 50 % aller Versuchstiere
allein durch supportive Therapie und Antibiotika. Therapie-Ansätze, die bei ansonsten
unbehandelten Versuchstieren Erfolge zeigen, könnten im intensivmedizinischen Setting
ihre Wirkung verfehlen [56]. Kubiak et al. schlugen 2011 in einer ihrer Publikationen
eine Checkliste vor, die zur Evaluation von Tiermodellen des septischen Schocks her-
angezogen werden kann [72]. Demnach erscheint es sinnvoll, in ein Tiermodell Faktoren
wie Komorbidität und Alter einzubeziehen. Zur weiteren Beurteilung des Agonisten sol-
len in der vorliegenden Arbeit Schweine herangezogen werden. Sie weisen, insbesondere
im Vergleich zu Nagern, eine bemerkenswerte Ähnlichkeit mit dem Menschen bezüg-
lich Physiologie, Metabolismus und Anatomie auf [27, 45, 110, 140]. Beispielsweise ist
gerade die Niere, als Untersuchungsfokus dieser Arbeit, dem Menschen dahingehend
ähnlicher, dass sie polylobulär aufgebaut ist [140]. Bei Nagern sind diese unilobulär.
Auch aus praktischen Gründen wurden hier Schweine gewählt. Sie sind gut zu instru-
mentieren und es ist möglich wiederholt und ausreichend Blutproben zu entnehmen.
Die meisten der aus Kubiak et al. 2011 [72] ersichtlichen Kriterien sind schon dadurch
erfüllt, dass Schweine als Versuchstiere genutzt werden. Weitere Punkte, wie die inten-
sivmedizinische Betreuung, die Durchführbarkeit und Reproduzierbarkeit, sowie eine
polymikrobielle Infektion sind bei diesen Tieren ebenfalls gut zu erreichen. Neben der
Variabilität bezüglich Alter, Geschlecht und genetischem Hintergrund bleibt noch die
Komorbidität. Wünschenswert wären Modelle, die entsprechend der epidemiologischen
Verteilung des Patientenkollektivs ausgerichtet sind. Gerade die Faktoren Alter, kar-
4diometabolische Vorerkrankungen und Atherosklerose sind von besonderer Bedeutung
und damit gute Ansatzpunkte ein Modell zu erstellen, welches zumindest Teile der kli-
nischen Realität gut abbildet. Thim et al. nutzten eine spezielle Züchtung, sog. FBM-
Schweine (s. Abschnitt 2.2.1), die in kurzer Zeit bei ausgeprägter Fettstowechselstö-
rung eine Koronarsklerose (s. exemplarisch Abbildung 1) entwickeln, für Forschungen
im Feld der Koronarsklerose.
Abbildung 1: Linke Koronararterie eines FBM-Schweines mit ausgeprägter Atherosklerose (HE
2,5X); ausgeprägte, pathologische Intima-Verdickung mit Einengung des Lu-
mens; Erstveröentlichung in [98] (Additional le 3; Ausschnitt der ursprüng-
lichen Abbildung) unter den Bedingungen der Creative Commons Attributi-
on License 4.0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/); HE=Hämatoxylin-
Eosin-Färbung, FBM=familial hypercholesterolemia Bretoncelles Meishan
Diese Tiere sind auch für das Tiermodell eines komorbiden Patienten bei Sepsis
geeignet. Es liegt eine ubiquitäre Atherosklerose und ausgeprägte metabolische Vorbe-
5lastung, mit Werten für das Gesamt-Cholesterin im Plasma von 800 mg/dL und mehr,
vor [146]. Atherosklerose ist ein eigenständiger Risikofaktor für die Entwicklung einer
chronischen Niereninsu zienz (CKD) und erhöht durch die Vorschädigung der Niere
damit auch das Risiko einer AKI. Fettleibigkeit ist auÿerdem ein Ein ussfaktor für die
Entwicklung einer chronischen Niereninsu zienz [128]. Umgekehrt ist die chronische
Niereninsu zienz ein unabhängiger Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen wie
KHK, akuten Myokardinfarkt, Stroke, paVK und Herzrhythmusstörungen [9, 128].
1.3.2 Fäkale Peritonitis durch direkte Inokulation
Um eine möglichst realitätsgetreue Entwicklung der Sepsis (bspw. wie bei Anastomo-
seninsu zienz nach anteriorer Rektumresektion) zu erzeugen, bietet es sich an, eine
Peritonitis durch Inokulation von Fäces herbeizuführen. Hier besteht die Möglichkeit
autologes Material zu benutzen und es kann von einem polymikrobiellen Keimspek-
trum ausgegangen werden. Durch ein hochstandardisiertes Verfahren, auf das in Ab-
schnitt 2.2.4 im Detail eingegangen werden soll, ist hier eine Reproduzierbarkeit in der
Hinsicht gegeben, dass regelhaft eine Sepsis ausgelöst wird, deren Ausprägung inter-
individuell vergleichbar ist. Die beobachteten klinischen und apparativen Parameter
entsprechen dem Bild einer Sepsis [53, 54, 64, 70].
1.4 Zielsetzung der Arbeit
In dieser Arbeit soll das therapeutische Potential des untersuchten Agonisten GW0742
am Groÿtiermodell des komorbiden Schweins im septischem Schock beurteilt werden.
Konkret ergeben sich folgende Fragestellungen:
1. Ist der PPAR-β/δ-Agonisten GW0742 in der Lage die extensive Immunantwort
des Organismus einzuschränken und damit hämodynamische und metabolische
Vorteile in der Intensivsituation zu bieten?
2. Kann der PPAR-β/δ-Agonisten GW0742 die Entstehung einer, beim septischen
Schock typischen, Niereninsu zienz verhindern, verzögern oder einschränken?
3. Wenn eines der Erstgenannten zutrit, worauf sind diese positiven Eekte zu-
rückzuführen? Im Falle eines Ausbleibens des therapeutischen Eektes, sind die
Ursachen für dieses Therapieversagen zu ergründen.
62 Material und Methoden
2.1 Verwendete Materialien und Geräte
2.1.1 Operationsmaterialien
Atropin
®, Braun, Melsungen
Atropinsulfat
Azaperon
®
Stresnil , Janssen, Neuss
Buprenorphin
®
Temgesic , Boehringer, Mannheim
®
Freka Cyst Standard 8 cm - CH 10,
Cysto x-Katheter
Fresenius Kabi, bad Homburg
Heparin Heparin-Natrium, Braun AG, Melsungen
HES-steril
® 6 % 200/0.5, Fresenius Kabi, bBad
Hydroxyethylstärke
Homburg
®
ICG-Pulsion , Mulsion Medical Systems,
Indocyaningrün
München
8,5 Magill, Mallinckrodt Medical, Athlone,
Intubationstubus
Ireland
KCL-Lösung Fresenius, Fresenius Kabi, Bad
Kaliumchlorid
Homburg
7,5F Multipurpose
® A1, Cordis, Roden,
Katheter
Niederlande
8,5F Multipurpose
® A1, Cordis, Roden,
Niederlande
High Flow Cordis 7Fr, 527-784, Cordis Corp.,
Miami, Florida, USA
Alsius-Kühlkatheter IC-3893 AE, Zoll
Circulation, California USA
PICCO-Katheter 5µV/V/mmHg, PV2015L20,
Pulsion Medical Systems, München
Thermodilkatheter 4Fr, PV2014L, Pulsion
Medical System, München
Swan-Ganz Katheter 7Fr, 111F7, Edward
Lifescience, California, USA
7Katheterschleuse 4F-Introducer-Set PV3240
®, Pulsion, München
Ketamin
®, Pharmacia & Upjohn, Erlangen
Ketavet
Midazolam
® Ratiopharm, Ratiopharm GmbH,
Midazolam
Ulm
Na-Pentobarbital
®, Merial, Hallbergmoos
Narkoren
Isotone Kochsalz-Lösung 0,9 % NaCl, Braun,
Natriumchlorid-Lösung
Melsungen
®
Arterenol , 25 ml, Sano -Aventis Deutschland
Noradrenalin
GmbH, Frankfurt
Pancuronium Pancuronium duplex-Actavis, Actavis, Langenfeld
Ringerlösung Fresenius
®, Fresenius Kabi,
Ringer-Lösung
Erlangen
2.1.2 Operationsgeräte
Wisa Absaugpumpe W. Sauer GmbH&CoKG,
Absaugpumpe
Wuppertal
Beatmungsgerät
®
Servo900B , Siemens, Erlangen
ABL-System 625, Radiometer, Copenhagen,
BGA-Gerät
Dänemark
®
Pulsion COLD Z-021 , Pulsion Medical Systems,
COLD-System
München
66S TM-Monitor, Hewlett-Packard, Palo Alto,
ICU-Monitor
CA, USA
Infusomat Infusomat secura, B. Braun AG, Melsungen
Datex Capnomac
® ULT-S-3301, Datex
Pulsoxymeter
Instrumentation Corp., Helsinki, Finnland
66S TM-Monitor, Hewlett Packard, Palo Alto,
Überwachungseinheit
California, USA
2.1.3 Laborgeräte
Eismaschine Scotsman AF80, Frimont, Mailand, Italien
8Wendt Maschinenbau GmbH und Co,
AS-2-Färbeautomat
Georgsmarienhütte, Deutschland
Sub-Cell
® GT Basic, Bio-Rad, Hercules, CA,
Elektrophoresekammer
USA
Kühlschrank Glass-Line, Liebherr, Bulle, Schweiz
Mikroskop Olympus BX41, Olympus, Tokyo, Japan
Bosch Mikrowellenherd 842C, Robert Bosch
Mikrowelle
GmbH, Gerlingen
pH-Meter Mettler MP220, MettlerToledo, Gieÿen
Spectronic Genesys 2, Milton Roy, Ivyland, PA,
Photometer
USA
Pipetten Eppendorf Reference, Eppendorf, Hamburg
Eppendorf Multipette, Eppendorf, Hamburg
Hamiltonpipette #705, Hamilton Company,
Reno, NV, USA
Consort E835, LTF Labortechnik,
Spannungsversorgung
Wasserburg/Bodensee
Waage ScalTec SBC31, ScalTec, Heiligenstadt
Zentrifugen Biofuge 28RS, Heraeus, Osterode
Hettich Rotina 38R, Hettich, Bäch, Schweiz
Oxygraph 2-K, Oroboros Instruments, Innsbruck,
Respirometer
Österreich
2.1.4 Chemikalien, Reagenzien
Acrylamid EC-890 Fa. National Diagnostics, UK
Ethanol Sigma-Aldrich, Steinheim
HKT Custodiol R, Köhler Chemie, Deutschland
Methanol Sigma-Aldrich, Steinheim
Na2 -EDTA Sigma-Aldrich, Steinheim
Natriumbikarbonat Sigma-Aldrich, Steinheim
Natriumchlorid Sigma-Aldrich, Steinheim
Natriumnitrat Sigma-Aldrich, Steinheim
9Natronlauge 1M Merck, Darmstadt
PBS-Puer Invitrogen Cooperation, Paisley, Schottland
Salzsäure 1M Merck, Darmstadt
Sauersto MTI Industriegase, Ulm
Sticksto (gasförmig) MTI Industriegase, Ulm
Sticksto ( üssig) MTI Industriegase, Ulm
Tetramethylethylendiamin Sigma-Aldrich, Steinheim
Tris-Base Sigma-Aldrich, Steinheim
Triton X-100 Sigma-Aldrich, Steinheim
Vanadiumchlorid Merck, Darmstadt
Antikörper Western Blot:
HO-1-Primär-AK: ADI-OSA-111-F Enzo Life Sciences, Lörrach
HO-1-Sekundär-AK: #7076 Cell Signaling Technology Inc., USA
iNOS-Primär-AK: 610333 BD Transduction Laboratories, Europe
iNOS-Sekundär-AK: #7071 Cell Signaling Technology Inc., USA
Caspase-3 Rabbit mAB (#9665) Cell Signaling Technology Inc., USA
Goat anti-rabbit IgG-HRP Santa Cruz Biotechnology, Inc., USA
(sc-2004)
Antikörper Immunhistochemie:
cleaved caspase-3 (ASP175) Cell Signaling Technology Inc., USA
NGAL (ABS 048-28) Bioporto Diagnostica, Dänemark
Rabbit polyclonal to PPAR delta Abcam plc, Cambridge, UK
(ab23673)
rabbit anti-Nitrotyrosine Millipore, Schwalbach
Analysekits:
Gesamtprotein im Plasma SYS1 BM/Hitachi 704/911, Roche Diagnostics,
Mannheim
Proteingröÿenstandard Kaleidoscope #161-0375 Bio-Rad, München
8-Isoprostane EIA Kit Cayman Chemical, Ann Arbor,
Michigan, USA
10Analysekit zum Nachweis der Dako REAL Detection System, Alkaline
Antikörperbindung Phosphatase/Red, rabbit, Dako Corp.
Medien, Standardlösungen und
Puer:
Ammoniumpersulfat 1g APS in 10ml Aqua dest. lösen
Bromphenolblau 50 mg Bromphenolblau, 100 ml Aqua dest.
Ponceau S 0,1 % Ponceau S in 5 % Essigsäure
1M Tris-HCl 121,14 g Tris Base, 500 ml Aqua dest. mit
32 %iger HCl auf pH 6,8 einstellen
2.1.5 Sonstige Verbrauchsmaterialien
Adapter für Monovette Sarstedt, Nürmbrecht
Bechergläser Schott Glas, Mainz
Deckgläser Menzel-Gläser, Braunschweig
Einmalpipettierspitzen Corning Incorporated, New York
Erlenmeyerkolben Schott Glas, Mainz
Färbeküvetten nach Hellendahl VWR International, Darmstadt
Küvette 4ml 1cmx1cm, PS Sarstedt, Nürmbrecht
Micro Test Tubes 1,5 ml Eppendorf, Hamburg
® Syringes, Hamilton
Hamilton Microliter
Mikroliterspritzen
Company, Reno, USA
Objektträger mit Mattrand Marienfeld, Lauda-Königshofen
Perfusor-Spritzen 50 ml Braun AG, Melsungen
Pipettenspitzen VWR, VWR International GmbH, Darmstadt
Probengefäÿe 20 ml Sarstedt, Nürmbrecht
Röntgenkassette Amersham Biosciences, Buckingamshire, England
Saranfolie Dow Chemical Company, Schwalbach
Serum-Monovetten 2,7 ml LH Sarstedt, Nürmbrecht
Zentrifugenröhrchen 14 ml Sarstedt, Nürmbrecht
112.1.6 Versuchstiere
22 kastrierte, männliche FBM-Schweine, 15-30 Monate alt, medianes Gewicht: 72(65;81)kg.
2.1.7 Software
Axio Vision Software rel. 4.8 Zeiss, Jena
Excel 2010 Microsoft, Redmond, Washington, USA
Sigma Plot 2002 2.03 Systat Software Inc., Richmond, California, USA
Sigmastat 8.0 Systat Software Inc., Richmond, California, USA
Windows 7 Microsoft, Redmond, Washington, USA
Windows XP Microsoft, Redmond, Washington, USA
Windows 95 Microsoft, Redmond, Washington, USA
Lyx 2.0.6 LYX-Team
Latex AT X Projekt Team
L E
Donald E. Knuth, Leland Stanford Junior
Tex
University, Stanford, California, USA
LibreO ce Calc The Document Foundation, Berlin, Germany
2.2 Studiendesign
2.2.1 Art und Anzahl der Versuchstiere und ethische Grundlagen
Die Versuche wurden gemäÿ den Deutschen und Europäischen Richtlinien (Directive
2010/63 EU on the protection of animals used for scienti c purposes) zum Umgang
mit Labortieren durchgeführt. Das Versuchsprotokoll wurde sowohl vom Tierschutz-
komitee der Universität Ulm als auch vom Regierungspräsidium Tübingen, Baden-
Württemberg, unter der Registrierungsnummer 1024 am 24.08.2010 genehmigt.
Für die Versuchsreihe wurden 22 kastrierte, männliche FBM-Schweine im Alter von
15-30 Monaten und einem medianen (Interquartilsabstand) Gewicht von 72 (65; 81) kg
verwendet. Bei dieser Schweinerasse handelt es sich um eine Kreuzung von Rapacz-
Schweinen mit den beiden kleineren Rassen Bretoncelles und Meishan. Sie weisen
eine homozygote Mutation im LDL-Rezeptor-Gen (R84C) auf, die in Verbindung mit
hochkalorischer und cholesterinreicher Diät zu einer ubiquitären Atherosklerose mit
der Ausbildung einer KHK und ausgeprägter Fettstowechselstörung führt [90, 146].
12Durch die Kreuzung mit den beiden kleineren Rassen steht somit ein Versuchstier zur
Verfügung, das einerseits den Metabolismus eines komorbiden Patienten mit Athero-
sklerose und Fettstowechselstörung widerspiegelt und andererseits eine dem erwachse-
nen Menschen vergleichbare Thorax- und Abdomengröÿe hat. Schweine wurden deshalb
verwendet, weil sie einerseits eine bemerkenswerte Homologie bezüglich Anatomie, Phy-
siologie, Metabolismus sowie Pathophysiologie zum Menschen aufweisen. Andererseits
sollten durch die Nutzung eines Groÿtiermodells eine ausreichende Gefäÿ- und Organ-
präparation gewährleistet und es möglich gemacht werden, ausreichend Blutproben zu
entnehmen.
2.2.2 Versuchsgruppen
Die Tiere wurden zufällig auf zwei Gruppen mit n=10 bzw. n=12 Tieren verteilt, und
erhielten entweder den Agonisten (GW0742) oder die Trägersubstanz (DMSO) als Pla-
cebo. Sowohl Versuchsleiter als auch -personal waren bezüglich der Gruppenzuteilung
verblindet.
2.2.3 Versuchsaufbau, Anästhesie und chirurgische Präparation
Vorbereitungsphase Die Tiere befanden sich bereits eine Woche vor Versuchsbeginn
im Tierforschungszentrum und wurden zur Versuchsvorbereitung einem Futterentzug
über 12h mit Wasser ad libitum ausgesetzt. Die anästhesiologische Betreuung der Tiere
begann eine Stunde vor Versuchsbeginn mit einer intramuskulären Injektion, durchge-
führt im Tierforschungszentrum Oberer Eselsberg, Oberberghof. Die Prämedikation
enthielt 5 mg/kg Azaperon. Anschlieÿend erfolgte der schlafende Transport der Tiere in
einer dafür vorgesehenen Transportbox in den Tier-OP des Instituts für Anästhesiolo-
gische Pathophysiologie und Verfahrensentwicklung (APV) in der Parkstraÿe 11, 89073
Ulm bzw. Helmholtzstr. 8/1 89081 Ulm .
Narkoseführung und supportive Therapie Die Tiere erhielten einen periphervenö-
sen Zugang über eine der Ohrvenen und wurden noch in der Transportbox groÿzügig
präoxygeniert. Während der Einleitung erfolgte die pulsoxymetrische Überwachung der
O2 -Sättigung über einen am Schwanz angebrachten Clipsensor. Unter Oxygenierung er-
folgte die Narkose-Einleitung über den i.v.-Zugang am Ohr mit 1-2 mg/kg Propofol und
131-2 mg/kg Ketamin. Anschlieÿend erfolgte in Rückenlage auf dem OP-Tisch die orotra-
cheale Intubation und schlieÿlich kontrollierte Beatmung. Alle Versuchstiere bekamen
eine Magensonde zur Entlastung. Unter dem Rücken der Tiere kam die Nullelektro-
de für den intraoperativ eingesetzten Couter zu liegen. Um die Narkose aufrecht zu
erhalten, bekamen die Tiere eine Dauerinfusion von Pentobarbital (6-12 mg/kg·h) so-
wie Buprenorphin als Bolus (30 µ /kg initial; 10 µ /kg vor Beginn der Operation, dem
g g
Auslösen der fäkalen Peritonitis und alle acht Stunden bzw. bei Bedarf, d. h. bei Ta-
chykardie, Blutdruckanstieg und anderen vegetativen Symptomen, die auf eine unzu-
reichende Analgesie schlieÿen lassen). Die notwendige Muskelrelaxation erfolgte durch
Pancuronium 1 mg/kg·h. Die während der operativen Instrumentierung vorgenommene
Standard-Einstellung des Respirators (Tidalvolumen 8 ml/kg; PEEP 10 cmH2 O ; I/E-
Verhältnis 1:1.5; Atemfrequenz abhängig vom arteriellen pCO2 - Zielbereich 35-40 mm-
Hg) wurde im Verlauf des Versuches angepasst, um der zu erwartenden Verschlech-
terung der Lungenfunktion entgegenzuwirken. Maÿgebend war hierbei der Horovitz-
pa O2
Index, also der Quotient aus arteriellem pO2 und inspiratorischer O2 -Fraktion (
F iO2
)
nach folgendem Schema:
pa O2
>300 mmHg: unverändert
F iO2
pa O2
F iO2
18 mm-
kg·h kg·h kg·h
Hg), wobei darauf geachtet wurde, dass das intrathorakale Blutvolumen (ITBV) maxi-
ml
mal 30-35 beträgt. Falls die Erhaltung des MAP auf Niveau vor Peritonitis alleine
kg
14durch Volumensubstitution nicht möglich war, bekamen die Tiere Noradrenalin nach
Bedarf bis zu einer maximalen Herzfrequenz (HF) von 160 min−1 . Diese wurden als
Parameter der systemischen Hämodynamik (s. Abschnitt 2.3) registriert und verwertet.
Chirurgische Präparation Zur Vorbereitung für die operativen Eingrie wurden die
Versuchstiere abgewaschen, rasiert, desin ziert und steril abgedeckt. Bei der chirur-
gischen Präparation wurde auf das in Ulm etablierte Groÿtiermodell zurückgegrif-
fen, das teils in veränderter Form in vorherigen Studien schon zur Anwendung kam
[7, 49, 50, 90, 130, 131].
Hierbei erfolgte eine Freilegung und Kanülierung der rechten A. femoralis mit einer 7F-
Katheterschleuse, die mit einem 3F-PiCCO
®-Katheter zur kontinuierlichen Messung
des Herzzeitvolumens versorgt wurde. Die Freilegung der linken A. carotis mit Ein-
legen einer 7F-Katheterschleuse, über die unter Kontrolle der Druckkurve ein Druck-
Leitfähigkeits-Katheter bis in den linken Ventrikel vorgeschoben wurde. Weiterhin wur-
den die Vv. jugularis internae freipräpariert. In der rechten V. jugularis interna wurde
eine Katheterschleuse platziert. Diese wurde für Volumengabe und Katecholaminthe-
rapie genutzt. Es erfolgte die Einschwemmung eines Pulmonalarterienkatheters. In der
linken V. jugularis interna wurde ein Coolgard-Wärmeaustausch-Katheter platziert.
Die verwendeten Versuchstiere haben im Vergleich zu deutschen Landschweinen eine
verminderte metabolische Rate und neigen daher zur Hypothermie. Um einen Eekt auf
die Blutgerinnung und den Glukose-Stowechsel zu vermeiden, wurde mit diesem Ka-
theter sichergestellt, dass keine Hypothermie auftritt. Es wurde eine quere Laparotomie
durchgeführt. Über eine 8,5F-Katheterschleuse in der rechten V. femoralis wurde ein
4F-Katheter in die rechte V. renalis, zur Gewinnung renalvenösen Blutes, unter manu-
eller Kontrolle am Gefäÿ, vorgeschoben. Vor dreischichtigem Verschluss der Bauchdecke
wurden zwei Drainagen in die seitliche Bauchwand eingebracht. Es erfolgte auÿerdem
die Anlage eines Cysto x-Katheters zur Urinableitung. Im Anschluss an den opera-
tiven Eingri schloss sich eine achtstündige Ruhephase an.
2.2.4 Induktion der fäkalen Peritonitis
Für eine gute Standardisierbarkeit, wurden bei der Abholung der Tiere die autologen
wurden in 500 ml 38 °C
g
Fäces in den Haltungsboxen der Tiere eingesammelt. 1
kg
ml
warmer NaCl-Lösung 0,9 % gelöst und über 12 Stunden inkubiert. 3 des Überstandes
kg
15wurden über die in der Bauchwand eingelegten Drainagen infundiert, wodurch sich eine
Vier-Quadranten-Peritonitis und daraus resultierend ein septischer Schock entwickelte
[53, 54, 64, 70].
2.2.5 Messzeitpunkte und Probenentnahme
Nach der Ruhephase wurden zunächst Ausgangsdaten erhoben, woraufhin die fäkale Pe-
ritonitis ausgelöst wurde. (s. Abschnitt 2.2.4 und Abbildung 2) Die Gabe von GW0742
mg
0,03 (gelöst in DMSO) bzw. DMSO erfolgte 6, 12 und 18 Stunden nach Auslösen
kg
der fäkalen Peritonitis. Die Zeit von 0-12 Stunden nach Peritonitis-Induktion wird als
Phase 1, die folgenden 12 Stunden entsprechend als Phase 2 bezeichnet. Am Ende des
Versuches wurden die Tiere in tiefer Narkose mittels Bolusgabe von Na-Pentobarbital
sowie zentralvenöser Injektion von 30 mmol Kaliumchlorid getötet.
Abbildung 2: Schema des Versuchsablaufes und der MZP (Messzeitpunkte)
2.3 Systemische Hämodynamik
Die Hämodynamik sowohl im groÿen als auch kleinen Kreislauf wurde mittels der In-
strumentierung und klassischem Monitoring erhoben.
Die Bestimmung der Herzfrequenz fand anhand der EKG-Ableitungen statt. Arteri-
eller, pulmonalarterieller sowie zentralvenöser Druck wurden kontinuierlich mit einem
Patientenmonitor aufgezeichnet. Der Pulmonalarterien-Verschlussdruck sowie das HZV
wurden durch eine Software-Option des Patientenmonitors bestimmt. Für das HZV
kam die Thermodilutionsmethode zum Einsatz. Des Weiteren wurde das intrathoraka-
le Blutvolumen und das extravaskuläre Lungenwasser bestimmt.
162.4 Systemischer Metabolismus
Zur Bestimmung arterieller, renal- und gemischtvenöser Blutgaspartialdrücke, pH, Hä-
moglobin-Konzentration und Sauerstosättigung, des Weiteren der Elektrolyte, des
Blutzuckers sowie Laktatspiegels wurden BGA durchgeführt. Als Parameter für oxi-
dativen Stress durch freie Sauerstoradikale und zur Beurteilung der antioxidativen
Kapazität wurde die 8-Isoprostan-Konzentration, als Marker für Lipidperoxidation,
im Blut mittels Elisa durch Mitarbeiter der Abteilung bestimmt. Dasselbe gilt für
die renalvenösen Nitrit- und Nitratspiegel [130] und die renalvenösen Blutspiegel der
Zytokine TNF-α und IL-6, die mit kommerziell erhältlichen, schweinespezi schen ELI-
SA-Kits ebenfalls durch Mitarbeiter der Abteilung nachgewiesen wurden [7, 48, 130].
Die endogene Glukose-Produktionsrate wurde ebenso wie die direkte, aerobe Glukose-
Oxidationsrate bestimmt. Zur Quanti zierung wurde die stabile Isotopen-Methode mit-
13
tels 1,2,3,4,5,6- C6 -Glukose angewandt. Dabei wird eine de nierte Menge des Isotops
infundiert und schlieÿlich im Kreislauf durch die endogen produzierte bzw. aus Glyko-
gen freigesetzte Glukose verdünnt. Aus einer entnommenen Blutprobe kann man nun
per Massenspektrometrie das Konzentrations-Verhältnis zwischen Tracer und norma-
ler Glukose bestimmen. Dies ist proportional zum Verhältnis zwischen infundierter und
produzierter Glukose. Zur Quanti zierung der Glukose-Oxidation wird eine Atemluft-
13 CO
2
Probe durch Infrarot-Spektroskopie auf das Verhältnis 12 CO untersucht. Mit dem schon
2
bekannten Verhältnis von Tracer und endogen produzierter Glukose ist berechenbar,
welcher Anteil des expiratorischen CO2 aus Glukose stammt.
2.5 Nierenfunktion
Als Marker für die, typischerweise beim septischen Schock vorliegende, AKI wur-
den Kreatinin im Urin und arteriellen Blut sowie die Elektrolyt-Konzentrationen im
+
Urin bestimmt. Daraus lassen sich die Kreatinin-Clearance und die fraktionelle Na -
Exkretion bestimmen, welche zuverlässige Marker für die Nierenfunktion darstellen.
Zudem wurde noch die Konzentration von NGAL im Blut bestimmt.
172.5.1 Histologie und Immunhistochemie
Nach Versuchsende wurde den Versuchstieren die linke Niere entnommen, sagittal er-
önet, pyramidenförmige Probenstücke zugeschnitten und diese über eine Woche in
einer 4 % Formalinlösung belassen. Diese Proben enthielten Anteile von Cortex, Mark
und Papillarsystem mit angrenzendem Nierenkelch von jeweils 5mm Dicke. Nach Ab-
lauf dieser Einwirkzeit wurden die Gewebestücke dehydriert und nach Einbettung in
Para n am Mikrotom zu 2-4 µm dicken Schnittpräparaten weiterverarbeitet, die auf
Objektträgern xiert wurden. Vor Durchführung der jeweiligen Färbungen wurden die
Proben durch drei Zyklen Xylol entpara niert, schlieÿlich durch mehrere Zyklen Etha-
nol von absteigender Konzentration rehydriert und anschlieÿend in destilliertem Wasser
vom Restalkohol befreit. Nach Beendigung des vorgegebenen Färbe-Protokolls wurden
die Proben in einer Ethanol-Reihe aufsteigender Konzentration dehydriert und für zwei
mal 5 min in Xylol eingelegt. Die Deckgläser wurden mit Neo-Mount auf den Objekt-
trägern xiert. Die Aufarbeitung und Bewertung der histologischen Präparate verlief
in Kooperation mit dem Institut für Pathologie der Universität Ulm (Leitung: Herr
Prof. Dr. med. P. Möller).
HE- und PAS-Färbung Zur morphologischen Beurteilung der Histopathologie des
Nierengewebes zogen wir HE- und PAS-Färbungen heran. Die HE-Färbungen wurden
automatisiert durch einen HE-Automaten durchgeführt. Bei der PAS-Reaktion wur-
den die probenbeladenen Objektträger für 5 min in einer Perjodsäurelösung inkubiert.
Anschlieÿend wurden sie in mehrmals gewechseltem destilliertem Wasser gespült und
weitere 15 min unter dem Abzug in Schi 'schem-Reagenz eingetaucht. Danach folgte
ein weiterer Waschgang von 15 min unter ieÿendem Wasser. Zur Gegenfärbung mit
Hämalaun wurden die Proben 1 min eingetaucht und abschlieÿend ein letztes Mal für
10 min unter ieÿendem Wasser ausgewaschen.
Die Beurteilung des Nierengewebes im HE bzw. PAS-Schnitt bezüglich Veränderun-
gen, die auf den Ausprägungsgrad des septischen Schocks und somit auch auf eine
potentielle Wirksamkeit der Versuchssubstanz hindeuten können, erfolgte anhand hi-
stopathologischer Parameter in Zusammenarbeit mit einer erfahrenen Pathologin (Fr.
Dr. Angelika Scheuerle, Sektion Neuropathologie, Universitätsklinikum Ulm). Unter-
sucht wurden der Ausprägungsgrad der glomerulären Tubularisation, die Dilatation
18und Schwellung der Bowman-Kapsel, zelluläre Ödeme der proximalen und Dilatation
der distalen Tubuli, die Anzahl der Protein-Zylinder im Tubulus-Lumen und Tubulus-
nekrosen, anhand eines Scoring-Systems, dass an Kubiaks Arbeit von 2010 angelehnt
ist und so auch schon im Institut APV angewendet wurde (vgl. Abbildung 3 und Ab-
bildung 4) [71, 90].
Zur Beurteilung der glomerulären Tubularisation, sowie der Dilatation der Bowman-
Kapsel wurden für jedes Versuchstier 50 Glomeruli im Kortex, sowie 30 im juxtame-
dullären Bereich der Nieren zufällig ausgewählt und nach diesen Kriterien beurteilt.
Dadurch ergab sich für jedes Versuchstier und jedes Kriterium ein Score in Prozent.
Die zellulären Ödeme wurden nach einem Verfahren beurteilt, in dem fünf zufällige
Bildausschnitte in vier Quadranten unterteilt wurden (s. Abbildung 5). Jeder dieser
Bildausschnitte bekam nun ein Grading entsprechend folgendem Schema:
Grad 0: unauälliges Parenchym
Grad 1: Vorkommen in einem Quadranten des Bildausschnittes
Grad 2: Vorkommen in zwei Quadranten
Grad 3: Vorkommen in drei Quadranten
Grad 4: Vorkommen in allen vier Quadranten
Die ermittelten Grade des Parenchymschadens aus den Bildausschnitten wurden ge-
mittelt. In entsprechender Weise wurde mit den Dilatationen und Schwellungen in den
distalen Abschnitten des Tubulussystems, aber auch mit den Tubulusnekrosen verfah-
ren.
Die Proteinzylinder wurden ausgezählt und in die Grade 0-3 eingeteilt, wobei die An-
zahl auschlaggebend war.
Grad 0: keine
Grad 1: 1-10
Grad 2: 11-50
Grad 3: >50 Proteinzylinder
19Abbildung 3: Gewebsschnitte mit Beispielen von pathologischem Nierenparenchym. (HE; PAS): A glome-
ruläre Tubularisation (HE, 20X), B Dilatation der Bowman-Kapsel (PAS, 20X), C Schwel-
lung der Bowman-Kapsel (PAS, 20X), D zelluläre Ödeme des Tubulussystems (PAS, 10X);
HE=Hämatoxylin-Eosin-Färbung; PAS=Periodic acid-Schi reaction
Immunhistochemische Färbungen Nach Rehydrierung der Proben wurden diese,
um eine bessere Antikörper-Bindung zu ermöglichen, in Citrat-Puer (10 mmol/l; pH
6,0) erhitzt. Dazu wurden sie für 5 min in eine Mikrowelle bei 600 Watt gestellt. Nach
Ersetzen des verdampften Puers mit destiliertem Wasser wurde dieser Vorgang wie-
derholt. Nach einer 10-minütigen Abkühlphase bei Raumtemperatur wurden sie für
2 min in destilliertem Wasser ausgewaschen. Im weiteren Verlauf wurden die Proben in
TBS-Puer gewaschen und zwischengelagert. Die Gewebeproben wurden schlieÿlich auf
dem Objektträger mit einem hydrophoben Stift umfahren. Dieses lipohile Agens konn-
te gewährleisten, dass die aufpippetierten Substanzen sich nicht zu sehr verteilten und
20Abbildung 4: Gewebsschnitte mit Beispielen von pathologischem Nierenparenchym: A Dilatation des Tubulus-
systems (PAS, 10X), B Protein-Zylinder im Tubulus-Lumen (HE, 10X),C Tubulusnekrosen (HE,
10X); HE=Hämatoxylin-Eosin-Färbung; PAS=Periodic acid-Schi reaction
die Proben während der Einwirkzeit nicht austrockneten. Um zu vermeiden, dass sich
viele unerwünschte Verbindungen bilden können und es so zu einem falsch-positiven
Ergebnis käme, wurden die Proben bei Raumtemperatur für eine Dauer von 15 min
in Ziegen-Serum inkubiert. Anschlieÿend wurde die überschüssige Flüssigkeit vom Ob-
jektträger abgegossen und die primäre Antikörper-Lösung, bestehend aus 10 ml TBS,
1 µl Tween 20 und 1 µl Ziegenserum 10 % mit dem entsprechenden Antikörper, aufpi-
pettiert. Nach 60-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Objektträger
in TBS (1 min), einer Mischung bestehend aus 10 ml TBS und 20 µl Tween 20 (3 min)
und schlieÿlich erneut TBS (1 min) gewaschen. Zum Nachweis der Antikörperbindung
wurde ein kommerziell erhältliches Analyse-Kit (Dako REAL Detection System, Al-
kaline Phosphatase/Red, rabbit) genutzt. Enthalten darin sind laut Hersteller:
21 Substanz A: biotinylierter sekundärer Antikörper Ziege/anti-Rabbit
Substanz B: Streptavidin-Alkaline Phosphatase
Substanz C, D, E: Chromogen 1, 2 und 3 ohne nähere Angabe des Inhaltsstoes
seitens des Herstellers
Substanz F: gepuerte Substratlösung
Substanz G: Levamisol
Abbildung 5: Grading vier Quadranten (HE, 10X); HE=Hämatoxylin-Eosin-Färbung
Dazu wurden die Proben mit Substanz A und Substanz B für je 30 Minuten bei
Zimmertemperatur inkubiert. Nach jedem dieser beiden Schritte folgte eine erneute
Waschung mit einem TBS/Tween 20-Gemisch. Anschlieÿend wurden 1,5 ml der Sub-
stanz F mit 2 µl der Substanz G gemischt, bevor die Substanzen C, D und E zugegeben
22wurden. Dieser Schritt dient dazu, die endogene alkalische Phosphatase zu blockieren
und somit unerwünschte Färbe-Reaktionen zu verhindern. Es folgte die Inkubation der
Proben mit dem zuvor beschriebenen Stogemisch für 15 Minuten bei Raumtempera-
tur. Zum Abschluss wurden die Proben mit einer Hämalaun-Lösung für 30 Sekunde
gegengefärbt und danach mit demineralisiertem Wasser abgewaschen.
Laut Hersteller reagiert das den sekundären Antikörper enthaltene Reagenz gleich
gut mit den Immunglobulinen von Kaninchen und Maus, so dass nur ein Sekundäran-
tikörper für die Bindung von primären Kaninchen- oder Mausantikörpern erforderlich
ist
Dieses Verfahren wurde für folgende Antigene angewendet:
1. NGAL als Frühmarker für eine AKI (ABS 048-28, Cell Signaling Tech. Inc.)
2. Nitrotyrosin als Marker für oxidativen und nitrosativen Stress (rabbit anti-Nitro-
tyrosine, Millipore)
3. Caspase-3 als Marker für Apoptosen innerhalb der Niere (ASP175, Bioporto Dia-
gnostica)
4. PPAR-β/δ-Expression im Nierengewebe (rabbit anti-PPAR-delta 1:100 #ab23673,
Abcam plc)
Um die immunhistochemischen Präparate nicht nur qualitativ beurteilen zu können,
wurde mit der Densitometrie eine in diesem Fall zumindest semi-quantitative Ana-
lyse genutzt. Dabei wurden drei repräsentative Ausschnitte (800,000 μm²) aus dem
angefärbten Gewebe, mittels eines von der Firma mitgelieferten Programmes, anhand
der Farbdichte im Bildausschnitt beurteilt. Es wird am Computer eine Suchmaske
darübergelegt (s. Abbildung 6), die man manuell bearbeiten kann, um somit die Berei-
che auszuwählen, die eine Antikörper-Bindung aufweisen. Die Farbdichte im gesamten
Bildausschnitt kann nun bestimmt werden.
2.6 Western Blot
Der Western-Blot ist ein Verfahren, bei dem Proteine auf Trägermembranen übertra-
gen und anschlieÿend per Antikörper nachgewiesen werden [18]. Die bei Versuchsende
23Abbildung 6: Axioscope-Imaging (NGAL, 10X); linker Bildausschnitt nativ, rechter Bildausschnitt mit Such-
maske; NGAL=neutrophilengelatinase-assoziiertes Lipocalin, Erstveröentlichung in [114] unter
den Bedingungen der OPARU-Standard-Lizenz (https://oparu.uni-ulm.de/xmlui/license_v3)
entnommenen Proben aus Cortex-Gewebe der Niere wurden durch üssigen Sticksto
schockgefrostet und anschlieÿend bei -80 °C aufbewahrt. Nachdem die Proben leicht
aufgewärmt wurden, vermischten wir diese mit kaltem PBS-Puer und Proteaseinhibi-
toren (0,1 mM Na-Vanadat, 2 mM para-Nitrophenylphosphate, 2 mM Dithiothreitol,
1 mM β-Glycerolphosphat, 10 µM Leuceptin sowie einer Tablette Complete) und ho-
mogenisierten die Suspension mit einem Ultra Turrax 25. Anschlieÿend setzten wir eine
1:2 Verdünnung der Proben mit zweifachem Lysepuer (50 mM TRIS-HCL; pH 7,5;
250 mM NaCl, 3 mM EDTA, 3 mM EGTA, 1 % Triton X-100, 0,5 % NP40 und 10 %
Glycerol) und Proteaseinhibitoren an und kühlten die Proben 30 min auf Eis. Nachdem
sie 30 min bei 20000 gE (4 °C) abzentrifugiert wurden, kam der, die Proteine enthal-
tende, Überstand für zwei mal 10 sec in einen Sonicater, um weitere Membranen, die
noch in den Proben enthalten waren, zu lösen. Nachdem der Proteingehalt der Proben
photometrisch bestimmt worden war, wurden die Proben mit EMSA Puer (10 mM
Tris-HCl pH 7,9, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 20 % Glycerol und 100 µg
bovines Serumalbumin) auf eine Proteinkonzentration von 4 µ /µ g l verdünnt. Für die
Western Blot Analysen wurden sie zusätzlich mit zwei mal Probenpuer (6 % SDS,
250 mM Tris-HCl pH 6,8; 20 % Glycerol, 6,7 % β-Mercaptoethanol, Bromphenolblau)
in einer 1:2 Verdünnung vermischt und bei 95 °C für 10 min erhitzt.
242.6.1 Proteinauftrennung und -transfer
Es wurden Polyacrylamid-Trenngele (29:1) mit Konzentrationen von 7,5 %, 10 % und
12 % verwendet, abhängig von der Gröÿe des zu quanti zierenden Proteins. In jedem
Fall wurde ein 4,5 %iges Polyacrylamidgel auf das Trenngel gegossen, das als Sam-
melgel wirken sollte. Pro Spur wurden 10 µg Protein im Acrylamidgel aufgebracht
zuzüglich 6 µg Precision Plus Protein Standards Kaleidoscope (Bio-Rad) als Mar-
ker. Bei Spannungen von 90 V (15 min) und anschlieÿend 180 V (ca. 45 min) er-
folgte nun die Auftrennung im SDS-Laufpuer (25 mM Tris, 190 mM Glycin, 3,5 mM
SDS). Anschlieÿend folgte bei 20 V (60 min) der Proteintransfer auf 0,45 µm dicke
Nitrocellulose-Membranen, die zuvor mit Blotpuer (2,4 M Trisbase, 1,9 M Glycin,
64,5 mM SDS, 200 ml Methanol, destilliertes H2 O) getränkt wurden. Dies geschah im
Halbtrocken-Verfahren (Semi-Dry-Blotter, Bio-Rad). Die Ponceau-Färbung diente an-
schlieÿend zur Überprüfung einer gleichmäÿigen Proteinladung. Fertige Blots blockier-
ten wir für 60 min bei Raumtemperatur mit einem Blockierpuer (5 % Milchpulver,
TBS, 0,1 % Tween 20), der zugleich als Waschpuer und Antikörperdiluent diente.
Es wurden folgende Primär-Antikörper verwendet:
iNOS
HO-1
cleaved Caspase-3
Der primäre Antikörper wurde über Nacht bei 4 °C inkubiert, woraufhin sechs Wasch-
gänge von je 7 min folgten. Die Inkubation mit dem sekundären Antikörper geschah
bei Raumtemperatur für die Dauer von einer Stunde. Darauf folgte ein wiederholtes
Auswaschen der ungebundenen Antikörper. Nach der Zweitantikörper-Detektion durch
das Chemolumineszenz-Reagenz Supersignal (Pierce) nach Herstellerangaben wurden
die Blots auf Agfa Cronex-5-Filme exponiert.
Die Auswertung der Western Blots wurde mit dem Programm Image J durchgeführt,
wobei die Einstellungen so adaptiert wurden, dass ein invertiertes Bild des Röntgen-
lms entstand (s. Abbildung 7). Die Banden wurden demnach weiÿ dargestellt, der
Hintergrund schwarz. Anhand der Area, Mean gray value und integrated density
der einzelnen Banden konnte das Programm eine densitometrische Analyse erstellen.
Diese Werte wurden schlieÿlich durch den Mittelwert zweier nativ-Proben dividiert.
25Abbildung 7: Beispiel eines Röntgen lms der Western Blot-Analyse
2.7 Datenverarbeitung und statistische Auswertung
Alle Daten in Tabellen sind als Median, sowie obere und untere Quartile dargestellt.
Ermittelt wurden auÿerdem Minimum bzw. Maximum. Sofern signi kante Unterschie-
de vorliegen, sind diese in den Tabelen bzw. zugehörigen Diagrammen entsprechend
kenntlich gemacht.
Nach dem Ausschluss einer Normal-Verteilung der vorliegenden Daten mittels Kolmo-
gorov-Smirnow-Test, wurden Unterschiede innerhalb der Gruppen durch einen Fried-
mann-Test zur Rangvarianzanalyse durchgeführt. Zusätzlich wurde ein Dunn-Test mit
Bonferroni-Korrektur durchgeführt. Schlieÿlich wurde noch durch einen Rangsummen-
test nach Mann und Whitney, der dazu dient zwei unabhängige Stichproben zu ver-
gleichen, überprüft, ob es signi kante Unterschiede zwischen den Ergebnissen der je-
weiligen Behandlungsarme zu gleichen Messzeitpunkten bzw. zu verschiedenen Mess-
zeitpunkten gab. Dabei wurde auch überprüft, ob Eekte innerhalb und zwischen den
Gruppen feststellbar waren, die auf die, durch uns durchgeführten, Maÿnahmen (Sepsis-
26Induktion, invasive Instrumentalisierung) zurückzuführen waren. Bei all diesen Tests
wurden p-Werte kleiner als 0,05 als signi kant angenommen.
Die statistische Auswertung der Daten wurde mit Sigmastat
® in der Programm-
Version 2.03 durchgeführt. Zur gra schen Darstellung der Ergebnisse wurde das Li-
breO ce Calc in der Version 6.1.1.2 benutzt.
27Sie können auch lesen
